tecnologÍa del adn recombinante · 2019. 4. 9. · tecnologÍa del adn recombinante •la...

M A R T Í N E S P A R I Z - E S P A R I Z @ I B R - C O N I C E T . G O V . A R

B I O T E C N O L O G Í A D E L O S A L I M E N T O S 2 0 1 9

TECNOLOGÍA DEL ADNRECOMBINANTE

• Alfa-amilasa

• Quimosina

• Lipasas

• Proteasas

Producción de proteínas

de interés

• E. coli

• Bacterias lácticas

• Levaduras

Expresión de proteínas

recombinantes en diferentes huéspedes

• Replicación del DNA

• Transcripción

• Traducción

• Métodos para detectar las proteínas

Clonado, vectores de expresión, modificación del

genoma

REPRESENTACIÓN DE UN GEN PROCARIOTA

Se representa la región promotora (p), el sitio de iniciación y dirección de la

transcripción (flecha curvada), y la secuencia de terminación para la ARN

polimerasa (t).

Un gen codificante procariota se transcribe en

ARNm y luego directamente en proteína.

TECNOLOGÍA DEL ADNRECOMBINANTE

• La tecnología ADN recombinante, que también se

llama clonación génica o clonación molecular, es

un término general que abarca una serie de

protocolos experimentales que conducen a la

transferencia de información genética (ADN) de un

organismo a otro.

• No hay un solo conjunto de métodos que puedan

usarse para cumplir este objetivo

Molecular biotechnology : principles and applications of

recombinant DNA /

Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, and Cheryl L. Patten. — 4th ed.

Capítulo 3 (p47-86)

CLONACIÓN DE ADN

El ADN de un organismo

fuente se escinde con una

endonucleasa de restricción y

se inserta en un vector de

clonación. La construcción se

introduce en una célula. Al

crecer, el vector con el gen

insertado se replica. El gen

clonado puede expresarse

(transcribirse y traducirse) en

la célula huésped,

produciendo la proteína

recombinante.

ADN Y LAS HERRAMIENTAS DE LA TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)

Corte que genera extremos cohesivos en un fragmento corto de ADN

mediante la endonucleasa de restricción tipo II EcoRI.

Las flechas grandes muestran los sitios de escisión en la cadena

principal del ADN. S, azúcar desoxirribosa; P, grupo fosfato; OH, grupo

hidroxilo.

La secuencia de

reconocimiento de EcoRI se

resalta mediante la línea

discontinua.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)

Corte que genera extremos romos en un fragmento corto de ADN por

la endonucleasa de restricción de tipo II HindII.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)

Isosquizómeros. Endonucleasas de restricción se unen al mismo

sitio de reconocimiento.

Neoisosquizómeros son isosquizómeros que cortan en diferentes

posiciones del mismo sitio.

Con flechas se indican los sitios de corte de las enzimas.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS)

Mapa de endonucleasa de restricción

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

Digestiones de endonucleasas de

restricción y separación electroforética

de fragmentos. Un trozo de ADN

purificado y lineal se corta con EcoRI y

BamHI por separado (digestiones

simples) y luego con ambas enzimas

juntas (digestión doble).

LIGASAS

Los cuatro fragmentos que se generan por la digestión con BamHI

pueden aparearse entre sí para formar cualquiera de las seis

moléculas de ADN diferentes. Unión inestable.

LIGASAS

La enzima T4 ADN ligasa forma enlaces fosfodiéster uniendo grupos 5

'fosfato y 3' hidroxilo en nicks en la cadena principal del ADN bicatenario.

Ligación de ADN con

extremos cohesivos

Ligación del ADN de

extremos romos.

VECTORES PLASMÍDICOS

Vector de clonado

Vector de expresión

CLONADO DE GENES EUCARIOTAS

CLONADO DE GENES EUCARIOTAS

SELECCIÓN DE CLONES POSITIVOS

Vector de clonado

SELECCIÓN DE CLONES POSITIVOS

Vector de expresión

RESUMEN DE ALGUNAS “HERRAMIENTAS”