tecnicas de observaciÓn microscopica

TECNICAS DE OBSERVACIÓN MICROSCOPICA

1. Observación en frescoSon preferibles en las situaciones siguientes:

• La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen.• Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad• Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la división celular• Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasa.

2. Observación con tinciones• Para observar las características morfológicas de las bacterias• Identificación y diferenciación de microbios entre especie y dentro de la misma especie (tinción diferencial o selectiva).

Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

1. Observación en fresco•preparación en fresco simple •preparación en gota pendiente

2. Observación con tinciones

•Tinción simple: un solo colorante.•Tinción diferencial: más de un colorante•Tinción especial

Tinción negativa: colorea el medio que rodea a la bacteria permaneciendo ésta sin teñir. 

Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

Porta objeto

Muestra

1. Colocar una gota de SSF o agua en un porta

2.- Tomar la muestra con el asa de siembra o un gotero

Procedimiento para un preparado en fresco

("entre porta y cubre")

Observación microscópica

1. Observación en fresco Bacterias: Leptospiras, treponemas (M.

campo oscuro)

Observación microscópica

1. Observación en fresco : (SSF) Parásitos : Trofozoitos, larvas.

Observación microscópica

1. Observación en fresco Hongos: Levaduras

Observación microscópica

1. Observación en fresco con modificaciones Hongos

NaOH 10% (hifas)

Procedimiento para un preparado en fresco

en gota pendiente

2. TINCIONES O COLORACIONES

COLORANTE: DEFINICIÓN

• Son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por algún componente.

• Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste

COLORANTES: Tipos

a) Sales colorantes: más comúnmente usados básicos: Consisten en un catión coloreado unido a un anión

incoloro. Tiñen la célula bacteriana uniformemente (ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos ) (cromatina nuclear de pro y eucariotas) (más usados en citología bacteriana).• Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica,

el cristal violeta

ácidos: Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. No tiñen la célula bacteriana, pueden usarse como color de contraste (coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas(Rx básicas)

Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo.

COLORANTES: Tipos

b) Colorantes liposolubles• Se combinan con los componentes lipídicos de

la célula, usados para revelar la localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.

COLORACIONES : Tipos

• Vitales– Son aquellas que se practican sobre células que están

vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo.

– Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.

• Supravitales – son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos,

pero que están aislados del organismo del que proceden.

• No vitales – se realizan sobre células muertas.

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

a) Frotis o película (extensión)

b) La fijación

c) Coloración.

Tinción de células para la observación microscópica

Extensión de una fina capa de células sobre el porta

Secado al aire

Fijación por flameado del porta

Adición del colorantelavado y secado

Se coloca una gota de aceite de inmersión sobre el porta yse observa con el objetivo de100X

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

a) Frotis o película (extensión)• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

b) La fijación:Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)

TIPOS– CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)– FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales

de etanol absoluto y éter)

Metanol

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

c) Coloración. SIMPLE : Positiva o negativa

Tinción simple de azul de metileno.

Frotis y fijación

Tinción

1.- Poner una gota de agua en un porta

2.- Tomar la muestra con el asa de siembra

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

1.- Cubrir la preparación con Azul de Metileno 5’

2.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Micrococcus luteus

Lunes

1.- Colocar una gota de Nigrosina en un porta

2.- Tomar muestra del microorganismo con el asa, flamear el tubo y tapar

3.- Mezclar con la Nigrosina y extender por todo el porta. Secar al aire y observar

Tinción negativa.

Lunes

cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y espiroquetas

Hongos Tinción negativa

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

c) Coloración. Diferencial o compuestase utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos

Etapas :1. tinción primaria2. Tinción de contraste o secundaria

- Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE ZIEHL-

NEELSEN, ESPORAS

TERMINOS

• Los mordientes, aunque no son colorantes, intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula por el colorante. También se pueden utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados de otra forma.

Diferencias en la pared celular

Frotis y fijación

1.- Poner una gota de agua en un porta

2.- Tomar la muestra con el asa de siembra

3.- Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

Tinción

1.- Cubrir la preparación con Cristal Violeta 2’

2.- Añadir Lugol (mordiente) durante 1’

3.- Decolorar con Alcohol 96º hasta que no suelte colorante

4.- Lavar con agua 5.- Teñir con Safranina 1’ 6.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

L-3.2.3.- Tinción de Gram

Lunes

Tinción de Gram

Paso 1

Paso 2

Paso 3

Paso 4

Tinción del frotisPreviamente fijado al calor,con cristal violetaDurante 1 minuto. Todas las células se tiñen de color azul-violeta.

Añadir Lugol, dejar actuar 2 minutos

Todas las células siguen de color azul-violeta.

Decolorar con alcoholLas células Gram + siguen de color azul-violeta.Las Gram negativas se decoloran.

Tinción de contrasteCon safranina 2 minutos.

Las células G+ se ven azul-violeta.

Las G- rosas o rojas.

Gram +

Gram -

PROCEDIMIENTO COLORACION GRAM

Cocos Gram - Bacilos Gram -

Tinción de Gram

Lunes

COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN

fundamento de esta técnica diferencial se basa en la propiedad de la pared celular Orden Actinomycetales. (acidos micólicos)

• Resiste la decoloración con alcohol y un ácido fuerte cuando• VARIANTES• Caliente : Mycobacterium • En frío (o de Kinyoun) : Cryptosporidium, Cyclospora E

Frotis y fijación

1.-Poner una gota de agua en un porta

2.- Tomar la muestra de un cultivo de Mycobacterium

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

1.-Cubrir la preparación con Fuchina fenicada

2.-Calentar con un hisopo de algodón empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero hasta la emisión de vapores. Mantener durante 5 minutos.

3.-Lavar con agua y decolorar con alcohol ácido

4.-Teñir con Azul de Metileno 1’

5.-Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Miercoles

Tinción

Tinción de ácido-alcohol-resistente.

Tinción de esporas.

Frotis y fijación

1.-Poner una gota de agua en un porta

2.-Tomar la muestra de un cultivo de Bacillus

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

1.-Cubrir la preparación con Verde Malaquita

2.-Calentar, con un hisopo de algodón empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero, hasta la emisión de vapores. Mantener caliente durante 5 minutos.

3.-Lavar con agua 4.-Teñir con Safranina 1’5.-Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

Tinción

Bacterias

Esporas

Miercoles

La tinción de flagelos de Leifson• 1.Se fija químicamente la suspensión bacteriana,

mediante formol, y se hace la extensión en un portaobjetos.

• 2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.• 3.Se cubre la preparación con una mezcla de ácido

tánico y el colorante rosanilina, de preparación extemporánea. El ácido tánico engruesa los flagelos y la rosanilina los tiñe.

• 4.Se retira el exceso de colorante con agua.

5. Por último, se deja secar al aire, antes de su observación al microscopio.

• Figura 3.11Tinciones específicas. (a) La tinción de Wirtz-Conklin se utiliza para observar endosporas. Bacilius cereus (b) La tinción de Leifson revela que este microorganismo posee flagelos, lo cual contribuye a su identificación como Spirillum volutans..(c) La tinción negativa con tinta china permite observar que esta bacteria posee cápsula, lo que facilita su identiticación como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumonía.

Tinción Uso Técnicas

Tinciones simples

Un colorante; proporciona contraste para observar mejor un organismo completo

Se tine con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen casi todas las bacterias; la rnayoría de los tejidos no se tiñen.

Tínciones diferenciales

Tinción de Gram Dos o más colorantes; distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas

Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta y después con una solución de iodo (mordiente). Todas las células quedan tenidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.

Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el colorante. Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.

Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)

Dos colorantes; distingue entre las micobacterias (ácido-alcohol resistentes) y el resto de las bacterias

Se tiñen las células con fucsina básica y se calienta a emisión de vapores durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes permanecen teñidas de rojo; todas las demás se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes continúan tenidas de rojo, las otras se tiñen de azul.

Tinciones especificas

Tinción de esporas de Wirtz-Cortitlin

Tiñe selectivamente las endosporas Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tiñe con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula toma el color rosa.

Tinción de flagelos de Leifson

Permite observar los flagelos A las células previamente fijadas, se le añade una mezcla de ácido tánico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine.

Tinción negativa Revela la presencia de cápsulas Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparación en fresco del espécimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cápsula, que se observa como una región clara alrededor de la célula.

Técnicas de tinción para bacterias

Imágenes de Paramecium al mismo aumento (1000x), pero con distintos microscopios. (a) La microscopía de campo claro permite observar la forma y las estructuras internas de mayor tamaño, como el núcleo. (b) La imagen de contraste de fases muestra mayor detalle interno, y el característico halo. (c) La microscopía de campo oscuro revela la presencia de cilios. (d) La imagen de Nomarsky es casi tridimensional.

PARASITOS: Plasmodium

• GIEMSA O WRIGHT

COLORACION LEISHMAN

HONGOS• AZUL DE LACTOFENOL• T. MENTAGROPHYTES

COLORACION DE TEJIDOSHEMTOXILINA /EOSINA

Hay alguna pregunta…?o de lo contrario…

…seguimos en la próxima clase !!!