soluciones para microbiología industrial...(paso 1) calentamient o del tubo (paso 2) enfriamiento...
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BioControl Systems, Inc.
Bellevue - Seattle- USA
Soluciones para
Microbiología Industrial
Método de PCR en
Tiempo Real validado
por SAG para
muestras oficiales de
productos cárnicos (matrices del programa de reducción de
patógenos)
Marzo 2011
Amplificación de PCR: Una reacción = Un ciclo
Cómo funciona el PCR ?
Los primers se unen
a la secuencia
complementaria del
target cuando se
enfría
(55 C)
La Taq polimerasa
elabora nuevas
cadenas de ADN
(72 C)
Separación de las 2
cadenas cuando se
calienta (95 C)
A
AGTC
C
T
T
AG
A
AGTC
C
T
T
AG
A
AGTC
TCA
C
T
T
AG
A
TC
Todo el proceso se repite con los
cambios de temperatura
Paso 1 – Desnaturalización del ADN
Paso 2 - Primers
Paso 3 - Extensión
Paso 4 – Se repite el ciclo
Paso 5 - Detección
El producto terminado de este proceso
debe ser detectado para determinar si
el target estaba presente
4
La evolución del método de PCR…Electroforesis – 1a.
Generación de PCR
Lectura multicanales
Bloque sólido Curva de fusion
( 2a. Generación)
Rotor Gene 3a.
Generación
5
No son necesarias 3 salas separadas...
Las tres partes del método PCR
Preparación
de Muestra
Equipo
Preparación
de Reactivos
6
Preparación de la muestra
Usar PickPen
para capturar
la bacteria Vortex
Adición del
reactivo de
Concentración
(immunobeads) y
la solución de
lavado
Enriq. de
la Muestra
Assurance
Adición de
1ml de la
muestra
10 min
Preparación de
la Muestra
Transferir immunobeads al
buffer con MgCl
Separación ImmunoMagnética
PickPen => Innovación
7
¿Cómo funciona la PickPen ?
Immunobeads
con
anticuerpos
Bacteria se une
a los
anticuerpos
8 imanes protegidos
por puntas de silicón
atrapan los
immunobeads.
8
Comparación de los
procedimientos
Enriq. de
muestra
Assurance GDS
2a. GeneraciónEnriq.
muestra
Adición
0.005ml
Muestra
95°C37°C
20 min 10 min 5 min
Adición de
(immunobeads)Adición 1ml
muestra
Adición
proteasaAdición
reactivo
para lisis
Calentamiento
del tubo
(paso 1) Calentamient
o del tubo
(paso 2)Enfriamiento
tubo de lisis
Diluie
Concentra
Vortex por
10 minutos
Usar PickPen para
capturar las perlas
metalicas con las
bacterias.
Transferir
para buffer
MgCl
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Sistema de Reactivos Primers específicos + Sonda DNA => PCR en Tiempo Real
Dos niveles adicionales de especificidad
Primers específicos al target
Sistema de sonda específica – MGB Eclipse Probe
Sistema de
Reactivos
10
¿Cómo funciona la sonda?
hv
MGBProbe bound to target, ( fluorescence emitted )
Correlación directa entre la cantidad de fluorescencia y la cantidad del DNA target
Si la sonda está en solución, ¿qué pasa?• Su formato no es lineal• Marcador fluorescente está inhibido
F = Fluoroforo
Q= Quencher
MGB = Minor Groove
Binder
Cuando la sonda se une al target…La sonda se vuelve lineal• El marcador genera fluorescencia.
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Termociclador Centrífugo con
intercambio de aire
Formato rotativo
Multi Canal – 3 canales con
diferentes longitudes de onda
Plataforma del Instrumento
Assurance GDS Rotor-GeneTM
Instrumento
Objetivo: Tener una plataforma de Detección y
Amplificación Rápida y Fácil de usar
12
PCR de 2a Generación (Curvas de Fusión)
vs PCR – Tiempo Real ( sondas)
Instrumento
PCR-TR
PCR con curvas de fusión
La fluorescencia es inmediatamente
detectada y la linea aparece en la
pantalla.La fluorescencia se acumula y después se
sube la temperatura para desnaturalizar el
DNA y la fluorecencia disminuye.
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¿Cómo leemos los resultados usando el GDS?
14
Transferindo Inmunobeads para
bandeja con buffer MgCl.
Inmunobeads +
buffer MgCl
15
Colocando TAQ – Polymerase en
los tubos GDS de amplificación
Dentro de los tupos de amplificación están: Primers + Nucleótidos + Sonda
MGB(Tiempo Real) + Controle Interno. Todo en formato de pastilla blanca liofilizada.
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Transferindo los inmunobeads para los
tubos de amplificación usando pipeta
multicanal...
Beads
con las
bacterias
17
Colocando los tubos en el termociclador
(Rotor Gene)
Entrar con nombre de
muestras
Colocar tubos amplificación
en el RotorGene
Ler los resultados en 75min.
18
Resultados
19
E. coli 0157:H7
E. coli 0157:H7 Shiga toxins
Listeria monocytogenes
Listeria spp.
Salmonella spp.
Ent. Sakazakii
La familia de pruebas PCR
Assurance GDS®
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