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Seminario 3

Clonación animal

Obtención de embriones capaces de desarrollar un

organismo completo o producción de células

multipotenciales, a partir de tejidos diferenciados

mediante la técnica de transferencia nuclear

Transferencia nuclear

Introducción de núcleos diferenciados de células de anfibios

ó mamíferos en huevos anucleados

Los núcleos espermátic

os se replican con total

eficiencia. Pero los

núcleos de eritrocitos no pueden replicarse.

¿¿¿Es necesario el pasaje por mitosis para reprogramar los núcleos para la rápida replicación del ADN???

Pregunta….

Pregunta….

¿¿¿La remodelación de la cromatina en los núcleos de los eritrocitos durante la mitosis afecta el tamaño de los replicones???

Núcleos de eritrocitos + extracto de huevo + BrdUTP + aphidicolin

en fase M o S

DNA combing *Ubicación de las fibras

anticuerpo a- guanosina + anticuerpo secundario con fluoróforo

*Incorporación de BrdUTP anticuerpo

a-BrdU + anticuerpo secundario con fluoróforo

77% < 30kpb

97% > 30kpb

74% 10-30 kpb

• La replicación lenta en los eritrocitos en fase S se debe a una baja frecuencia de orígenes de replicación.

• La exposición de los núcleos de eritrocitos a un extracto en fase M genera un espaciamiento de los orígenes de replicación similar al núcleo espermático

¿¿¿Es suficiente la formación de cromosomas mitóticos para reprogramar la organización nuclear de eritrocitos para que se produzca la rápida replicación de DNA en el siguiente ciclo celular???

Pregunta…

•Acetilación de histonas requerida para una rápida replicación

•Nivel de acetilación máximo en núcleos de eritrocitos en extracto interfásico

•Efecto dominante de la organización cromatínica por sobre la acetilación

Se investigaron cambios globales en la organización de la cromatina de eritrocitos que puedan explicar la remodelación de los replicones

¿¿¿Puede ocurrir lo contrario cuando los núcleos de eritrocitos son expuestos a extractos de huevo??? Es decir, ¿¿¿Puede haber una transición desde sitios de unión definidos a una asociación al azar con la matriz nuclear???

Pregunta…

El pasaje previo por la fase M induce dos tipos de rearreglos en nucleos de eritrocitos:

•Reduce el tamano de los loops, consistentemente con una mayor densidad de sitios de anclaje a la matriz nuclear

•Disminuye el espacio promedio entre origenes de replicacion

Pregunta…

¿¿¿La reprogramación de los replicones en núcleos de eritrocitos incubados en extracto de huevos en fase M de Xenopus se debe a la condensación de los cromosomas dirigida por la Topoisomerasa II o únicamente al pasaje de la fase M a la S???

La reorganización de los replicones no se debe a la transición de la fase M a la S

+ICRF 193

ICRF 193 inhibidor de la Topoisomerasa II previene la condensación cromosómica

No es el pasaje de la Fase M a la S la que aumenta la tasa de replicación sino la condensación cromosómica

La organización cromosómica dependiente

de topoisomerasa II, ¿¿¿controla la eficiencia de reclutamiento de ORC???

Pregunta…

•Tasa replicativa depende de un eficiente reclutamiento de factores de iniciación de la replicación

•Reclutamiento en eritrocitos incubados en extracto en fase M es afectado por la remodelación cromatínica dependiente de topoisomerasaII

Se investigó si la misma reorganización cromatínica ocurre durante el desarrollo temprano “in vivo”

Los datos sugieren que la rápida replicación del DNA durante el desarrollo temprano, involucra el uso de muchos puntos de unión situados al azar entre la cromatina y la matriz nuclear. La entrada en mitosis restaura el tamaño de los loops tanto de embriones tempranos en fase post-replicativa como de núcleos diferenciados

Modelus

De este trabajo puede deducirse que….

• La mayor especificidad en los orígenes de replicación observado en células diferenciadas debe ocurrir entre el medio y el final de la fase G1

• Para obtener una exitosa clonación deben realizarse sucesivas transeferencias nucleares

Resumiendo…

• El aumento de la organización de los cromosomas en la metafa- tasa replicativa se dirigida por la

depende de Topoisomerasa II y el anclaje en la Matriz Nuclear

loops más pequeños reclutamiento de ORC =

Mayor orígenes de replicación

la acetilación de las histonas • Es independiente de la concentración de

factores de replicación presencia del complejo

pre- replicativo

Gracias!!!!!