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SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Lodos de plantas de tratamiento de líquidos
sépticos
Bioq. Graciela Sanguinetti
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Generación de los lodos
Red cloacal
PLANTA DE TRATAMIENTO
LODOS
EFLUENTE TRATADO
Líquido cloacal
Pozo absorbente
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
BarrosDefiniciones
(Resolución 97/2001 del Ministerio de Desarrollo Socialy Medio Ambiente de la Nación)
Barros crudos: Barros generados como consecuencia de operaciones de tratamiento de efluentes líquidos y que constituyen subproductos de ese proceso.
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
BarrosDefiniciones
(Resolución 97/2001 del Ministerio de Desarrollo Socialy Medio Ambiente de la Nación)
Barros tratados: Productos originados en el tratamiento de barros crudos con el propósito de modificar su contenido de humedad y su capacidad de atraer vectores.
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
BarrosDefiniciones
(Resolución 97/2001 del Ministerio de Desarrollo Socialy Medio Ambiente de la Nación)
Barros orgánicos: Barros con contenido de materia orgánica total igual o mayor al 20% sobre materia seca.
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
BiosólidosDefinición
(Resolución 97/2001 del Ministerio de Desarrollo Socialy Medio Ambiente de la Nación)
Productos originados en la transformación de barros orgánicos a través de tratamientos destinados a reducir su nivel de patogenicidad, su poder de fermentación y su capacidad de atracción de vectores y a otorgarles aptitud para su utilización agrícola y para la recuperación de suelos y sitios degradados.
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Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Disposición inadecuada de lodos con riesgo sanitario
PLANTA DE TRATAMIENTO
LODOS SIN
TRATAR
EFLUENTE TRATADO
SueloCanales
Cuerpo receptor
Cuerpos de agua
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Alternativas de disposición final de lodos sin riesgo sanitario
PLANTA DE TRATAMIENTO
LODOS
TRATADOS
EFLUENTE TRATADO
Disposición oceánica
“Land farming”
Cuerpo receptor
Uso agrícola Incineración
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Reuso de lodos en agricultura
Factores a considerar:Presencia de metales pesadosMicroorganismos patógenos Bacterias Virus Parásitos
Otros tóxicos
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y Salmonella en lodos cloacales
Guías nacionales para el Uso y Disposición Final de Biosólidos
(Ministerio de Desarrollo Social y Medio Ambiente de la Nación)
ParámetroValor límite
Nivel AValor límite
Nivel B
Escherichia coli (*) < 1000 NMP/g MS< 2.000.000 NMP/g MS
Salmonella (*) < 3 NMP / 4 g MS
Huevos de helmintos viables
< 1 / 4 g MS
Indicadores virales
Reducción del 99,9% de la densidad de bacteriófagos
somáticos de Escherichia coli
(*) Se exige el cumplimiento de uno de los 2 límites
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y Salmonella en lodos cloacales
Indicador apropiado para garantizar la inactivación de
patógenos ¿ Coliformes fecales?
¿Salmonella sp.?
HUEVOS DE HELMINTOS
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Huevo de Trichuris
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Huevos de Hymenolepis
H. diminuta H. nana
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Huevo de Tenia saginata
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Huevos de parásitos resistentes a condiciones ambientales adversas
ASCARIS LUMBRICOIDES
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Huevo de Ascaris
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y Salmonella en lodos cloacales
Ascaris
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y Salmonella en lodos cloacales
AscarisCiclo
biológico
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Bolo de Ascaris
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y Salmonella en lodos cloacales
Proyecto de Investigación Investigación sobre tratamiento de
lodos sépticos: Proyecto colaborativo entre UNR / CIS (Argentina) y EAWAG / SANDEC (Suiza)
Fase B2 del Proyecto: Investigación de la inactivación de
patógenos en lodos sometidos a deshidratación natural
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y Salmonella en lodos cloacales
Investigación en el CIS
Plantas de tratamiento: Alcorta: planta existente.
Tratamiento con ciclos largos de acumulación y deshidratación de barros.
Máximo Paz: planta nueva. Tratamiento con ciclos cortos de acumulación y deshidratación de barros.
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y Salmonella en lodos cloacales
Objetivos de la investigación Huevos de helmintos
Determinar el tiempo de almacena-miento necesario para la inactivación de huevos de helmintos en lodos sometidos a procesos de deshidratación natural dentro de la Planta de Tratamiento
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Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Objetivos de la investigaciónSalmonella sp.
Establecer una técnica para aislamiento de Salmonella y determinar el die-off.
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y Salmonella en lodos cloacales
Planta de Tratamiento enAlcorta, Santa Fe
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y Salmonella en lodos cloacales
AlcortaEsquema de la Planta de Tratamiento
Líquidos sépticos
Efluente
Líq
uid
o c
loacal
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Alcorta - Descarga de camiones
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Alcorta - Laguna de sedimentación (C1)
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AlcortaDistribución de líquido séptico en la laguna
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Alcorta - Laguna de lodos (C2)
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y Salmonella en lodos cloacales
AlcortaDeshidratación de lodos en pilas
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y Salmonella en lodos cloacales
Caracterización del lodo de la Planta de Tratamiento de
Alcorta
Monitoreo:Muestras: (envases, volumen, extracción, cantidad de muestras)Frecuencia de muestreo: quincenalDuración del Estudio: 2 años
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y Salmonella en lodos cloacales
Caracterización de lodos Parámetros analizados
Humedad Sólidos totales, fijos y volátiles pH Coliformes fecales Huevos de helmintos Salmonella sp.
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y Salmonella en lodos cloacales
Caracterización del lodo de la Planta de Tratamiento de
Alcorta Humedad: 80% Sólidos totales: 200.000 mg/l
Sólidos fijos: 60% Sólidos volátiles: 40%.
Coliformes fecales: se han detectado concentraciones entre 2 y 130.000 NMP /gramo de materia seca.
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
AlcortaMonitoreo: Humedad
30
40
50
60
70
80
90
100
0 100 200 300 400 500 600 700
Time (days)
Hu
mid
ity
(%
)
Piles' samples
Humedad inicial = 87% Humedad final = 32%
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
AlcortaMonitoreo: Sólidos fijos y volátiles
Sólidos Fijos y Volátiles en la laguna de sedimentación
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
0 100 200 300 400 500 600 700
T (días)
Fra
cció
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)
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
AlcortaMonitoreo: Coliformes fecales
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
0 100 200 300 400 500 600 700
Tiempo (días)
Co
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NM
P p
or
gra
mo
)
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Caracterización de lodos Parámetros analizados
Humedad Sólidos totales, fijos y volátiles pH Coliformes fecales Huevos de helmintos Salmonella sp.
Investigación de
patógenos
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Etapas de la investigación de patógenos en lodos
Experiencias desarrolladas: Viabilidad de huevos de helmintos en lodos
acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados en
tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través de
la aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.
Supervivencia de Salmonella sp. en lodos cloacales
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Viabilidad de huevos de helmintos en lodo acumulado en
laguna de sedimentación
Aplicación de técnica de recuperación de huevos (EPA 1992 modificada por J. Schwatzbrod)
Determinación de viabilidad: Incubación a 26 ºC, durante 4 semanas.
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
Técnica de aislamiento de huevos de helmintos
Filtración:
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Técnica de aislamiento de huevos de helmintos
Sedimentación:
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y Salmonella en lodos cloacales
Técnica de aislamiento de huevos de helmintos
Flotación con Zn SO4, densidad 1,32 g/cm³:
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
Técnica de aislamiento de huevos de helmintos
Centrifugación:
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y Salmonella en lodos cloacales
Técnica de aislamiento de huevos de helmintos
Flotación con Zn SO4, densidad 1,32 g/cm³:
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
Técnica de aislamiento de huevos de helmintos
Purificación en solución ácida de alcohol-éter:
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
Técnica de aislamiento de huevos de helmintos
Incubación a 26 ºC, 21 días:
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Técnica de aislamiento de huevos de helmintos
Detección de huevos viables:
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Planta de Tratamiento en Alcorta
Resultados de la investigación de patógenos
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
Patógenos en laguna de sedimentación
Huevos de helmintos
0,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
0 100 200 300 400 500 600 700
Tiempo (días)
Hu
ev
os
de
He
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tos
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gra
mo
)
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Patógenos en laguna de sedimentación
Huevos viables de Ascaris
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0 100 200 300 400 500 600 700
Días de almacenamiento
Hu
ev
os
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ble
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Nº
po
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SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Patógenos en laguna de sedimentación
Salmonella: no se detectó en ninguna de las muestras analizadas.
Huevos de helmintos: se han detectado en concentraciones variables entre 0 y 17 huevos totales / gramo. Se detectaron huevos viables en muy pocas muestras.
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Etapas de la investigación de patógenos en lodos
Experiencias desarrolladas: Viabilidad de huevos de helmintos en lodos
acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados
en tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través de la
aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.
Supervivencia de Salmonella sp. en lodos cloacales
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Viabilidad de huevos de Ascaris
Experiencias en Tanque Experimental y
“Playa de Secado”Alcorta, Santa Fe
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
Viabilidad de huevos de Ascaris suum sembrados en lodos
acumulados
Se estudió en dos etapas: Tanque experimental: 8 meses Playa de secado experimental: 12
meses
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Parámetros adicionales determinados en tanque/playa
de secado
Coliformes fecales
Sólidos totales, fijos y volátiles
Humedad
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Preparación de Suspensión de huevos de Ascaris suum
Se extraen huevos del útero de helmintos hembras
Se prepara suspensión de huevos en solución fisiológica estéril con una concentración aproximada de 3 x 105 huevos/l
Se agrega la suspensión de huevos al lodo del tanque experimental (20 huevos/g materia seca)
Se realizan tests control con la suspensión de huevos incubada a 20ºC, 4 semanas (confirman viabilidad)
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Helmintos Ascaris
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Extracción de huevos de Ascaris
Preparación
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Extracción de huevos de Ascaris
Disección del Ascaris
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Extracción de huevos de Ascaris
Disección del útero
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Extracción de huevos de Ascaris Ruptura del útero y liberación de huevos
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Extracción de huevos de Ascaris Huevos de Ascaris en la suspensión
preparada
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Tanque experimentalDiseño del experimento
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Tanque experimental
Preparación: Siembra de
huevos
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Tanque experimentalUbicación del tanque experimental
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
Tanque experimentalComienzo de la experiencia
SANDEC
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y Salmonella en lodos cloacales
Tanque experimentalCuarto mes de deshidratación
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y Salmonella en lodos cloacales
“Playa de secado”
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
AlcortaResultados de la experiencia
en tanque experimental y playa de secado
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Tanque experimental / playa de secado
Monitoreo de la humedad
20
30
40
50
60
70
80
0 120 240 360 480 600 720
Tiempo (días)
Hu
me
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%)
Tanque Experimental Playa de secado
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Tanque experimental / playa de secado
Viabilidad de Ascaris
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
0 120 240 360 480 600 720
Tiempo (días)
Hu
evo
s d
e Ascaris
(N
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)
Huevos totales Huevos viables
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Tanque experimental / playa de secado
Huevos viables de Ascaris vs. humedad
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
20 30 40 50 60
Humedad (%)
Hu
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e Ascaris
via
ble
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º p
or
gra
mo
)
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Etapas de la investigación de patógenos en lodos
Experiencias desarrolladas: Viabilidad de huevos de helmintos en lodos
acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados en
tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través
de la aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.
Supervivencia de Salmonella sp. en lodos cloacales
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Investigación de un método apropiado para aislamiento de Salmonella sp. en lodo séptico ¿Cuáles son los inconvenientes que se
plantean en el laboratorio para la detección de Salmonella en lodos sépticos?
La presencia de una importante flora indígena puede enmascarar el desarrollo de Salmonella, especialmente cuando se encuentra en bajas concentraciones
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
METODOLOGIA Según Standard Methods (1999)
Se procesaron 9 muestras del lodo de la laguna de sedimentación de la Planta de Tratamiento de Alcorta Medios de enriquecimiento: caldo Selenito - CistinaMedios de aislamiento: agar XLDTests de identificación: TSI, LIS, ureasaConfirmación: Pruebas serológicas (Antígeno grupo “0”)
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacalesSalmonellaen presencia de flora
competidora
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Resultados obtenidos aplicando técnica del “Standard Methods”
Ausencia de Salmonella en todas las muestras de lodo analizadas
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
El resultado < 3 NMP/4g materia seca, ¿significa realmente que Salmonella está por debajo de
dicha concentración?
¿O podría encontrarse en mayor concentración y no detectarse por
quedar enmascarada por la abundante flora competidora presente en el lodo cloacal?
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Objetivos de la investigación Salmonella sp.
Establecer una técnica apropiada para el aislamiento de Salmonella en presencia de flora indígena.
Determinar el die-off (en tanque experimental).
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Selección de la metodología más apropiada para aislamiento
de Salmonella en lodo
1. Se contaminaron 5 muestras de lodo con Salmonella enteritidis. Concentración final: 1,5 x 103 - 1,5 x 105/g materia seca
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Selección de la metodología más apropiada para aislamiento
de Salmonella en lodo (cont.)
2. Se seleccionaron los siguientes medios de cultivo y condiciones de incubación:
a. Caldos de enriquecimiento: Selenito-cistina: 24, 48, 72 horas a 41 ºC Rappaport Vassiliadis: 24, 48, 72 horas a
43ºC
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Selección de la metodología más apropiada para
aislamiento de Salmonella en lodo (cont.)
b. Medios selectivos de aislamiento: Agar XLD: 24 horas a 35 ºC y a 40 ºC Agar SS: 24 horas a 35 ºC y a 40 ªC
c. Pruebas bioquímicas: TSI, LIA, Ureasa
d. Pruebas serológicas: Realizadas en Servicio de Enterobacterias
del Instituto Dr. Carlos Malbrán
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Resultados obtenidos en el estudio de la selección de metodología para
aislamiento de Salmonella
#
Caldo Selenite-Cistina (41ºC) Caldo Rappaport-Vassiliadis (43ºC)
Salmonella Flora indígena Salmonella Flora indígena
24 hs
48 hs
72 hs24 hs
48 hs
72 hs24 hs
48 hs
72 hs
24 hs
48 hs
72 hs
1 ** ** * * ** ** ** *** ** * * **
2 ** * * * ** *** ** *** ** * * *
3 * * * * ** *** * ** ** * * *
4 ** * * * ** ** * ** ** * * **
5 ** ** * * ** ** ** *** ** * ** **
* Desarrollo escaso - ** Desarrollo moderado - *** Desarrollo abundante
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Resultados obtenidos en el estudio de la selección de metodología para
aislamiento de Salmonella
#
Agar Salmonella-Shigella (SS) Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD)
Salmonella Flora indígena Salmonella Flora indígena
35 ºC 40 ºC 35 ºC 40 ºC 35 ºC 40 ºC 35 ºC 40 ºC
1 * ** ** * ** *** ** *
2 ** ** ** * ** *** * *
3 * ** ** ** * ** * *
4 ** ** ** * * ** ** *
5 * ** ** ** ** *** ** *
* Desarrollo escaso - ** Desarrollo moderado - *** Desarrollo abundante
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Aislamiento e identificaciónde Salmonella
Método modificado (Sanguinetti et al) Enriquecimiento
Caldo Rappaport-Vassiliadis
43 ºC – 48 hs.
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Aislamiento e identificaciónde Salmonella
Aislamiento:
Agar XLD40 ºC 24 hs.
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Aislamiento e identificaciónde Salmonella
Aislamiento en Agar XLD:
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Aislamiento e identificaciónde Salmonella
Aislamiento en agar XLD
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Aislamiento e identificación de Salmonella
TSI (alcalino/ácido)
LIA (positivo)
Ureasa (negativo)
Tipificación por pruebas bioquímicas
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Etapas de la investigación de patógenos en lodos
Experiencias desarrolladas: Viabilidad de huevos de helmintos en lodos
acumulados en la laguna de sedimentación. Viabilidad de huevos de Ascaris sembrados en
tanque experimental. Aislamiento de Salmonella de lodos a través de la
aplicación de diferentes técnicas para inhibir flora indígena.
Supervivencia de Salmonella sp. en lodos cloacales
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Supervivencia de Salmonella en lodo de tanque experimental
LODOConcentración final:
7,0 x 106 NMP/g ST
Duración experiencia: 4 meses
Salmonella enteritidis
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Supervivencia de Salmonella en lodo de tanque experimental
Aplicación de la técnica propuesta para aislamiento
Cuantificación: técnica de tubos múltiples
Expresión de resultados: índice NMP / gramo de materia seca
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Supervivencia de Salmonella en lodo de tanque experimental
Parámetros adicionales pH entre 6,5 y 7,5 Humedad entre 30% y 70% Sólidos fijos entre 75% y 80% de ST Sólidos volátiles entre 20% y 25% de ST Coliformes fecales entre 10² y 104 NMP/g ST Temperatura ambiente entre 13ºC y 27ºC Temperatura del lodo entre 14ºC y 30ºC
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Salmonella sp.Die–off en lodos
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
CONCLUSIONES
AB
C
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Los huevos de Ascaris presentes en lodos almacenados
durante 2 años permanecen viables, aún con 35% de humedad
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
Un método apropiado para el aislamiento de Salmonella en lodos, que inhibe el desarrollo de flora indígena es:
Enriquecimiento: caldo Rappaport-Vassiliadis, 48 horas a 43 ºCAislamiento: Agar XLD, 24 horas a 40 ºCTests de identificación: TSI, LIA, ureasa, pruebas serológicas
SANDEC
Aislamiento y determinación de huevos de helmintos
y Salmonella en lodos cloacales
El decaimiento de Salmonella durante 115 días en tanque
experimental con lodos puede expresarse por la ecuación:
Y = log NMP Salmonella/g materia seca = 6,67 x t-
0,086
t: tiempo transcurrido en días
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