revisión de aislamiento y purificación enzimática
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Agradecimientos
A nuestros padres, quienes nos han apoyado con esfuerzo y abnegación para
el emprendimiento de nuestros estudios.
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Dedicatoria
El presente trabajo está dedicado a nuestros amigos, familiares y personas
involucradas en el campo de la biotecnología.
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Contenido1. Introducción.............................................................................................5
2. Generalidades..........................................................................................5
3. CAPÍTUL 1! "#tracción en$i%ática.........................................................&
3.1. '(todos )u*%icos..............................................................................&
3.1.1. Uso de en$i%as +idrol*ticas.........................................................&
3.1.2. Alteración del ,- de la solución..................................................&
3.1.3. Uso de detergentes.....................................................................&
3.1.. Uso de sol/ente orgánicos...........................................................0
3.1.5. Uso de soluciones +i,otónicas.....................................................0
3.2. '(todos *sicos..................................................................................
3.2.1. i4raciones ultrasónicas..............................................................3.2.2. -o%ogeni$ación con a4rasi/os...................................................
3.2.3. -o%ogeni$ación con +o%ogeni$ador Potter"l/e+6e%..............17
3.2.. Largos ,eriodos de %e$clado....................................................17
3.2.5. Adición de ,erlas de /idrio durante el %e$clado.......................11
3.2.8. Congelación9escongelación.....................................................11
. CAPÍTUL 2! Puri:cación en$i%ática......................................................12
.1. '(todos de,endientes del ta%a;o o %asa.....................................12
.1.1. Centriugación...........................................................................12
.1.2. <iltración en gel.........................................................................13
.1.3. 9iálisis o ultra:ltración..............................................................13
.2. '(todos de,endientes de la carga..................................................1
.2.1. Cro%atogra*a de interca%4io iónico........................................1
.2.2. "lectrooresis.............................................................................15
.2.3. "no)ue isoel(ctrico..................................................................15
.3. '(todos de,endientes de la solu4ilidad..........................................18.3.1. Ca%4io en el ,-........................................................................18
.3.2. Ca%4io en la uer$a iónica........................................................18
.3.3. 9ecre%ento en la constante diel(ctrica....................................18
.. '(todos de,endientes de sitios de unión es,ec*:cos.....................1&
..1. Cro%atogra*a de a:nidad.........................................................1&
..2. "lución de a:nidad....................................................................1&
5. CAPÍTUL 3! In%o/ili$ación en$i%ática.................................................10
5.1. Adsorción.........................................................................................10
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5.2. <or%ación de enlaces iónicos..........................................................10
5.3. <or%ación de enlaces co/alentes....................................................1
5.. <or%ación de enlaces cru$ados.......................................................27
5.5. Atra,a%iento...................................................................................27
5.8. "nca,sulación..................................................................................21
8. Conclusiones..........................................................................................21
&. =i4liogra*a.............................................................................................23
1. Introducción
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Las enzimas se encuentran distribuidas ampliamente en los sistemas vivos y
son un factor importante en el crecimiento, el mantenimiento y la propagación
del sistema vivo. De hecho, cualquier alteración en las enzimas puede conducir
a una condición patológica e incluso la muerte. Los primeros días de desarrollo
de la enzimología estaban llenos de controversias relacionadas con su
estructura, naturaleza química y funciones (Kularni y Deshpande, !""#$.
%na vez que se entiende que las enzimas tienen la capacidad de traba&ar en
sistemas libres de c'lulas, se comienza con los intentos para su aislamiento y
purificación. illst)tter y sus colegas entre *+!" y *+! llevaron a cabo los
primeros intentos de purificación de enzimas. Di-on y Kodama intentaron la
purificación de la -antina o-idasa.
La primera enzima para cristalizar la ureasa fue en *+! por /umner. 0sto fue
seguido por la purificación y cristalización de proteasas como tripsina y pepsina
por 1orthrop.
2. Generalidades
0n general la e-tracción y purificación de enzimas es requerida por las
siguientes razones2
• 3ara el estudio de varios aspectos de una enzima en particular.
• 3ara la identificación de sustratos y el sustrato específico de la enzima.• 3ara evaluar el papel de diversas coenzimas4cofactores en la velocidad
de reacción.
• 3ara investigaciones como componentes de diagnóstico.
• 3ara propósitos terape5ticos.
• 3ara el desarrollo de sistemas de enzimas inmovilizadas
comercialmente e-plotables para aplicaciones industriales,
fermentaciones y procesos de valor agregado.
• 3ara la li-iviación de minerales de importancia comercial.
• Las enzimas puras tambi'n se emplean en el procesamiento de
alimentos.
• Los estudios de inhibición de enzimas pueden indicar inhibidores
potenciales, que pueden ser utilizados para tratar trastornos metabólicos
y heredables.
Las enzimas extracelulares son más fáciles de aislar que las enzimas
intracelulares
6ndependientemente de la fuente de te&ido, es decir, plantas o animales, lasenzimas e-tracelulares son m)s f)ciles de recolectar. /u recolección
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generalmente no requiere la destrucción de los te&idos y por lo tanto se reducen
los gastos y tiempo requerido para procesos tales como homogeneización o
cualquier otro tipo de procesos (7ordero y 8erdugo, !""$.
Las enzimas vegetales y microbianas son generalmente más baratas
Los te&idos animales son una fuente m)s costosa para la producción comercial
de enzimas. 0sto es principalmente debido a que muchas veces el animal
completo tiene que ser comprado y sacrificado antes de que un te&ido u órgano
específico pueda ser aislado y utilizado como una fuente de la enzima (7astillo
et al., !""9$.
Una amplia gama de métodos está disponible para el aislamiento y
purificación de enzimas
0stos varían de acuerdo con muchos criterios, que incluyen la fuente de laenzima, su disponibilidad, el costo de los procesos, el factor tiempo involucrado
y la disponibilidad de los equipos (/trayer, et al., !""$. 0l aislamiento y
purificación enzim)tica generalmente sigue el siguiente proceso2
• 6dentificación de la fuente de enzimas.
• 3rocedimientos de mane&o generales para e-tractos de origen y crudo.
• :'todos para la e-tracción.
• :'todos para la purificación.
• Desarrollo de ensayos2 cualitativos y cuantitativos.
• 0stabilización y cristalización.• 7riterios de pureza.
• :'todos para la preservación de enzimas aisladas.
3. CAPÍTULO 1 !"tracción en#i$%tica
Los m'todos de e-tracción enzim)tica pueden ser divididos en dos grupos2
m'todos químicos y m'todos físicos.
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3.1. '(todos )u*$icos
3.1.1.Uso de en#i$as +idrol*ticas
/e utilizan deferentes tipos de enzimas como lisozimas, proteasas y lipasaspara remover partículas localizadas en la membrana produciendo la formación
de agu&eros a trav's del cual el líquido intracelular y org)nulos pasan a la
solución (;une y 7ase, !""#$.
3.1.2.Alteración del ,- de la solución
/ometer las c'lulas a un entorno de p< alterado provoca que las proteínas de
la membrana celular se coagulen conduciendo a la formación de poros a trav's
de los cuales el líquido intracelular salga como un homogeneizado (Durs y
=oel, !""#$.3.1.3.Uso de deterentes
Los detergentes rompen la barrera lipídica solubilizando las proteínas e
interrumpiendo la interacción lípido>lípido, lípido>proteína y proteína>proteína.
Los detergentes iónicos desnaturalizan la proteínas y si dividen en detergentes
aniónicos (lauril sulfato sódico, colato sódico, /D/$, y catiónicos (bromuro de
cetil>trimetil>amonio$, por otro lado los detergentes no iónicos preservan
estructura nativa e interacciones de la enzima (?@een, /pam, ?riton$ (Koolmany Aohm, !""B$.
Los inconvenientes que se manifiestan con el uso de los detergentes es que
pueden provocar la desnaturalización total de las proteínas, y adem)s se los
debe remover despu's de la e-tracción.
3.1.4.Uso de sol/ente or%nicos
Las membranas son bicapas lipídicas y los solventes org)nicos apropiados
como acetona, cloroformo, 'ter, etc., son a menudo empleados para disolver
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los lípidos conduciendo a la formación de poros, entonces el citoplasma de la
c'lula fluye hacia fuera como un homogeneizado crudo (Lodish, et al., !""$.
3.1.5.Uso de soluciones +i,otónicas
La suspensión de c'lulas en soluciones hipotónicas conduce a la absorción de
agua y su inflamación que conduce a una presión de turgencia que es lo
suficientemente grande para hacer que las c'lulas estallen. 3or lo general, se
emplean soluciones de sacarosa o soluciones de K76 (/u)rez, !""$.
3.2. '(todos *sicos
3.2.1.iraciones ultrasónicas
Las c'lulas se someten a vibraciones ultrasónicas que resultan en su
destrucción y la formación de un homogeneizado.
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3.2.2.-o$oeni#ación con arasi/os
Los te&idos vegetales o te&idos microbianos con pared celular son a menudo
sometidos a homogenización con un material abrasivo tal como al5mina o
arena. 0l cizallamiento y la tensión provocan la ruptura de la pared celular que
conduce a la colección del líquido c'lular como un homogeneizado crudo.
/istemas de mortero mano de mortero simples o mezcladores y molinos se
utilizan para lograr los resultados deseados (Kularni y Deshpande, !""#$.
3.2.3.-o$oeni#ación con +o$oenei#ador Potter!l/e+e$
0l homogeneizador 3otter>0lveh&em se compone de un tubo de vidrio que
enca&a perfectamente en un pistilo de teflón que est) conectado a un motor de
alta velocidad. 0l te&ido para ser homogeneizado se pica y mezcla con la
cantidad apropiada de solución isotónica y despu's se somete a
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homogeneización a una velocidad muy alta (apro-imadamente "" rpm$
durante apro-imadamente 9 a *" minutos (Kularni y Deshpande, !""#$.
3.2.4.Laros ,eriodos de $e#clado
Las c'lulas, cuando son sometidas a largos períodos de mezclado se rompen
debido a las fuerzas mec)nicas de choque contra las paredes de la batidora
generando un crudo (/u)rez, !""$.
3.2.5.Adición de ,erlas de /idrio durante el $e#clado
La adición de perlas de vidrio o arena se emplea a menudo para aumentar el
cizallamiento mec)nico que hace el proceso m)s eficaz. C menudo se utilizan
mezcladores aring en el proceso. C veces tambi'n se emplean instrumentos
con los a&ustes de velocidad (/u)rez, !""$.
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3.2.6.Conelación8esconelación
0sto se basa en el hecho de que al congelarse las mol'culas de agua forman
el hielo que se e-panden en m5ltiples tamaos y causan tensión en la
membrana celular que conduce a su destrucción. La descongelación que
provoca la fusión del hielo que conduce a la formación de un homogeneizado
crudo (:uoz, !""*$.
4. CAPÍTULO 2 Puri9cación en#i$%tica
%na vez que se obtiene el homogeneizado crudo, el ob&etivo de un
procedimiento de purificación debería ser para aislar una enzima de inter's con
el m)-imo rendimiento posible. Cdem)s, la preparación debe poseer la
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capacidad m)-ima de la cat)lisis. 0n otras palabras, debe estar libre de
contaminación de otras proteínas inactivas y activas.
Los m'todos de purificación enzim)tica pueden ser clasificados de acuerdo a
diferentes propiedades de la enzima de inter's como el tamao o masa, carga,
solubilidad y sitios de unión específicos (Kularni y Deshpande, !""#$.
4.1. '(todos de,endientes del ta$a:o o $asa
0stos m'todos dependen del principio general de que las mol'culas
sedimentan a diferentes velocidades dependiendo de su tamao o masa.
Clgunos de los m'todos empleados con frecuencia incluyen2
4.1.1.Centriuación
Las grandes mol'culas tales como enzimas pueden ser sedimentadas por las
altas velocidades (hasta E"","""g$ generadas por una ultracentrífuga. Cunque
la velocidad a la que cualquier enzima en particular se sedimenta depende de
una variedad de factores, incluyendo el tamao y la forma de la mol'cula y la
viscosidad de la solución, se encuentra que en general, cuanto mayor sea el
peso molecular, mayor es la tasa de sedimentación. 0ste m'todo no se utiliza
ampliamente en procedimientos de purificación para separar una enzima de
otra porque sólo un volumen pequeo (unos pocos mL$ puede ser tratado
dentro de una ultracentrifugadora. /in embargo la centrifugación esampliamente utilizada para eliminar el material insoluble precipitado en el curso
de aislamiento, por e&emplo, para eliminar los desechos de c'lulas despu's de
la homogeneización o para recoger la enzima que ha sido precipitada por la
adición de sales (/trayer, et al., !""$.
4.1.2.;iltración en el
;iltración en gel o cromatografía de permeación en gel es un m'todo de
separación que depende del tamao molecular. 0l m'todo tambi'n se conoce
como tamiz molecular, o cromatografía de e-clusión molecular. /u e-celente
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reproducibilidad, comparativamente corto tiempo y equipo relativamente barato
hace que sea el m'todo de separación m)s ampliamente utilizado
0n una columna con perlas de gel o gr)nulos de vidrio poroso se pone un
solvente para que las mol'culas sean separadas. /i la mezcla de mol'culas de
diferente tamao se coloca en la parte superior de una columna, las mol'culasgrandes pasan a trav's de los espacios intersticiales entre las perlas. 0sto es
porque los poros del gel tienen un di)metro m)s pequeo de lo que se necesita
para que las mol'culas grandes puedan entrar. 3or lo tanto, las mol'culas
grandes se mueven hacia deba&o de la columna con poca resistencia. Las
mol'culas pequeas sin embargo pueden entrar en los poros y son por lo tanto
eliminadas de manera efectiva del flu&o del disolvente de elución (Lodish, et al.,
!""$.
Las t'cnicas utilizadas son la cromatografía de columna o cromatografía en
capa fina.
4.1.3.8i%lisis o ultra9ltración
%na membrana de di)lisis, tal como el celof)n puede ser usado para separar
las proteínas o mol'culas globulares con un peso molecular de alrededor de
!", """ Dalton. 0l tamao de poro puede ser cambiado por diversos
tratamientos mec)nicos y químicos. 0l m'todo se utiliza de manera rutinaria
para separar pequeas mol'culas org)nicas, sales y disolventes org)nicos a
partir de los e-tractos crudos. La capacidad de mane&o de volumen es
generalmente ba&a. 0l proceso no se puede emplear para separar una enzima
de otra (/trayer, et al., !""$.
La ultra filtración por otro lado es una modificación del procedimiento de
di)lisis en la que pequeas mol'culas y iones pasan a trav's de una
membrana de di)lisis ba&o la influencia de la presión aplicada (por lo general
gas nitrógeno a B atm. de presión$. 0sto conduce a la concentración de la
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solución de enzima, que es 5til en la reducción del volumen de la muestra de
e-tracto durante el procedimiento de purificación.
4.2. '(todos de,endientes de la cara
0stos m'todos dependen del hecho de que las enzimas puedan tener cadenas
laterales cargadas que dan a la mol'cula una carga neta y que la movilidad de
la mol'cula cargada ba&o un campo el'ctrico depende de las cargas estas
llevan. Clgunos de los m'todos utilizados habitualmente incluyen los siguientes2
4.2.1.Cro$atora*a de interca$io iónico
0l intercambio de iones puede ser definido como el intercambio reversible de
iones en solución, con iones, electrost)ticamente unidos a un medio de soporteinerte. La fuerza de la atracción electrost)tica a su vez depende de la carga
relativa, el radio de los iones hidratados, y el grado de las interacciones no
enlazantes.
La t'cnica emplea generalmente columnas de intercambio iónico. <ay dos tipos
de intercambiadores de iones, intercambiadores de aniones e intercambiadores
de cationes. 0l medio es un medio de soporte inerte que est) unido
covalentemente a un grupo funcional positivo (intercambiador de aniones$ o a
un grupo funcional negativo (intercambiador catiónico$. Los iones
electrost)ticamente unidos al intercambiador se conocen como contraiones(Durs y =oel, !""#$.
0sta t'cnica es muy 5til en la separación de compuestos cargados e incluso
compuestos no cargados que se pueden marcar con un grupo cargado o una
varianza de p<.
4.2.2.!lectrooresis
La electroforesis es la migración de partículas o mol'culas cargadas en un
medio ba&o la influencia de un campo el'ctrico aplicado. ?ras la suspensión en
un disolvente acuoso casi todas las partículas incluyendo biomol'culas tales
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como enzimas adquieren cargas positivas o negativas. La adquisición de tales
cargas depende de la naturaleza de la partícula4mol'cula y el disolvente.
0stos grupos determinan la densidad de carga neta de la mol'cula proteica, lo
que hace que se mueva en un campo el'ctrico en una dirección, y a una
velocidad dependiente de la seal y la cantidad de esta densidad de carganeta. 6ncluso si dos mol'culas tienen la misma carga, no pueden migrar &untos
porque si hay diferencia en sus pesos moleculares tendr)n diferente cargo2
relación en masa (Lodish, et al., !""$.
4.2.3.!no)ue isoel(ctrico
0n la t'cnica del enfoque isoel'ctrico, por otro lado, un gradiente de p< estable
est) dispuesto, el p< aumenta gradualmente de )nodo a c)todo. %na proteína
se introduce en este sistema en un punto donde el p< es inferior a su punto
isoel'ctrico, la cual poseer) una carga neta positiva y migrar) en la dirección
del c)todo. Debido a la presencia del gradiente de p<, la proteína migrar) a un
ambiente de valores de p< sucesivamente m)s altos, que a su vez, influenciar)
en la ionización y carga neta de la mol'cula. ;inalmente la proteína se
encontrar) con un p< en el que su carga es cero y se detendr) la migración.0ste es el punto isoel'ctrico de la proteína (Kularni y Deshpande, !""#$.
4.3. '(todos de,endientes de la soluilidad
La solubilidad de un compuesto en un disolvente dado depende del equilibrio
de las fuerzas entre soluto y soluto y aquellas entre soluto y disolvente. /i elprimer caso predomina, el compuesto ser) insoluble en cambio si el segundo
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de afinidad2 (*$ la cromatografía de afinidad utiliza la afinidad, en la etapa de
adsorción de la enzima de inter's, a un intercambiador de iones y (!$ la elución
de afinidad utiliza la especificidad en la etapa de desorción, las cuales son
descritas brevemente a continuación2
4.4.1.Cro$atora*a de a9nidad
La t'cnica e-plota la capacidad de especificidad, la unión no covalente de
enzimas con otras mol'culas llamadas ligandos. La mayoría de las veces un
sustrato an)logo (una mol'cula que se aseme&a al sustrato pero no causa
reacción fructífera$ específico para la enzima de inter's se une a una matriz
sólida e inerte (como agarosa$. 7uando la mezcla se carga en la parte superior
de la columna, sólo la enzima deseada se unir) al an)logo de sustrato
inmovilizado y deber) retardar. ?odas las otras enzimas y proteínas pasar)n
aba&o y hacia fuera de la columna (Durs y =oel, !""#$.
4.4.2.!lución de a9nidad
0s una t'cnica complementaria a la cromatografía de afinidad. /e utiliza con
mezclas de enzimas parcialmente purificadas y es m)s venta&osa que la
cromatografía de afinidad pues2 se eliminan las reacciones comple&as de unión
del an)logo de sustrato y las columnas son m)s baratas porque los
intercambiadores de iones son m)s baratas que las matrices de afinidad (Durs
y =oel, !""#$.
5. CAPÍTULO 3 In$o/ili#ación en#i$%tica
%na nueva dimensión se aadió al desarrollo de enzimología con los avances
en las t'cnicas que permiten la inmovilización enzim)tica en una matrizinsoluble sin ning5n efecto adverso sobre sus actividades.
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0-isten varias venta&as al usar enzimas inmovilizadas por e&emplo, las enzimas
pueden reutilizarse y usarse de manera continua, reduce el costo de
procesamiento, me&or recuperación del producto, eficiencia del tiempo,
estabilidad de la enzima, me&or control de cat)lisis, eficiencia en los procesos y
sistemas de diagnóstico r)pidos (Crroyo, *++$.
:uchos m'todos han sido usados para la inmovilización de enzimas, algunos
m'todos importantes son descritos a continuación.
5.1. Adsorción
La adsorción est) mediada por enlaces iónicos, enlaces hidrofóbicos o puentes
de hidrógeno. La agitación de la enzima con una resina de intercambio iónico
puede causar su adsorción. ?ambi'n se puede hacer mediante cambios en el
p<, fuerza iónica de la solución o alterando la concentración.
0l proceso es venta&oso ya que, es simple y de ba&o costo, requiere
tratamientos suaves, se puede aplicar en c'lulas enteras, así como enzimas
aisladasH sin embargo, hay algunas desventa&as que incluyen, la enzima unida
se puede li-iviar durante el cambio en el p<, y si el sustrato tiene una carga
similar puede interferir con la unión de la enzima (=arcía, et al., !""B$.
5.2. ;or$ación de enlaces iónicos
/e utiliza una matriz de soporte que tenga un grupo iónico adecuado o, a su
vez las mol'culas inertes son etiquetadas con un residuo iónico adecuado que
permite la unión de la enzima con la matriz. (/i la enzima lleva una carga
positiva, entonces la matriz debe llevar cargas negativas para asegurar la unión
iónica$. 0sta es tambi'n una t'cnica de superficie.
Las venta&as de la t'cnica incluyen, mayor especificidad, menor contaminación,
incluso me&or distribución a lo largo de la superficie o sección transversal de la
columna. Las desventa&as son, requerimiento de materiales de soporte
específico, alto costo de las columnas, la susceptibilidad de las mol'culas
cargadas puede interferir con la unión iónica (Ichoa, et al., !"**$.
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5.3. ;or$ación de enlaces co/alentes
0s la t'cnica m)s ampliamente utilizada. La enzima se une a las mol'culas de
soporte a trav's de enlaces covalentes, mediante la activación del polímero
con un grupo reactivo. Los materiales utilizados como matriz incluyen, celulosa,
agar, agarosa, u otros polímeros. Las cadenas laterales de amino)cidos
contienen grupo hidro-ilos y aminos que se unen con el soporte o el reactivo
utilizado como puente.
La t'cnica tiene las siguientes venta&as2 la unión es específica, hay poco o
nada de elución, hay una amplia variedad de soportes, materiales de matriz y
agentes puente. Las desventa&as de la t'cnica incluyen2 el procedimiento
requiere de mucho traba&o, los costos son altos, los procedimientos son
complicados, requieren ambientes severos y son difíciles de replicar (Ichoa, et
al., !"**$.
5.4. ;or$ación de enlaces cru#ados
Las enzimas pueden unirse alternadamente a un soporte mediante el uso de un
reactivo bifuncional que se une al polímero por un lado y la enzima de inter's
en el otro. 0l reactivo act5a como un puente entre el polímero y la enzima. 0l
agente preferido es el glutaraldehído sin embargo tambi'n se utilizan otros
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reactivos como adipimato de dimetilo. ?ambi'n se ha utilizado alternativamente
la copolimerización con proteína inerte como la alb5mina (Kularni y
Deshpande, !""#$.
5.5. Atra,a$iento
0l m'todo se basa en el atrapamiento de las enzimas o c'lulas completas
dentro de los polímeros de matrices insolubles. La enzima se incorpora dentro
de la matriz, a diferencia de la unión superficial en la t'cnica de adsorción. La
enzima se mezcla inicialmente con la solución del monómero y luego se activa
la polimerización durante la cual la enzima queda atrapada dentro de la matriz
formada. La polimerización puede efectuarse mediante reacciones químicas,
cambio en el p<, o cambio en la temperatura (Crroyo, *++$.
Las venta&as del atrapamiento son2 es un procedimiento sencillo, requiere poca
instrumentación, se basa en tratamientos leves, no inactiva la enzima, no crea
ninguna restricción en las enzimas. Las desventa&as del m'todo son2 se
pueden crear impedimentos est'ricos para grandes sustratos que interfieren
con la velocidad de reacción, en los casos en que los geles se compacten
puede afectar a la actividad en un grado menor, en algunos casos los poros de
la matriz son lo suficientemente grandes y se puede producir la elución de la
enzima.
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5.6. !nca,sulación
Las enzimas son muchas veces encerradas dentro de estructuras
membranosas que permiten la entrada de sustratos y la salida de productos, y
adem)s las enzimas no son capaces de pasar a trav's de ellas. Diversos
materiales como el nylon, silicatos, nitrato de celulosa, fosfolípidos o liposomas
se pueden utilizar para la fabricación de materiales de encapsulación.
La t'cnica tiene las venta&as siguientes2 el proceso es simple, es barato,
proporciona un )rea superficial grande con respecto a volumen, no requiere
aparatos costosos e instrumentación. Las desventa&as son las siguientes2 las
enzimas pueden no ser estables, no se puede utilizar en gran escala (Crroyo,
*++$.
6. Conclusiones
Las enzimas se encuentran en todos los sistemas vivos y se las ha utilizado
desde que se encontró que pueden funcionar fuera de las c'lulas.
0l uso de enzimas tiene diversas aplicaciones entre las principales tenemos2
diagnóstico de enfermedades, propósitos terap'uticos, aplicaciones
industriales, fermentaciones procesamiento de alimentos, entre otros.
La e-tracción de enzimas e-tracelulares es m)s sencilla porque la enzima es
e-cretada al medio y no se necesita de procesos para la destrucción de te&idos.
=eneralmente las enzimas vegetales y microbianas son m)s baratas que las
enzimas de origen animal.
3ara la producción de una determinada enzima generalmente se usa el
siguiente proceso2 identificación de la fuente de enzimas, procedimientos de
mane&o generales para e-tractos de origen y crudo, m'todos para la e-tracción,
m'todos para la purificación, desarrollo de ensayos2 cualitativos y cuantitativos,
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estabilización y cristalización, criterios de pureza y m'todos para la
preservación de enzimas aisladas.
Los m'todos de e-tracción enzim)tica pueden ser divididos en m'todos
químicos (uso de enzimas hidrolíticas, detergentes, disolventes org)nicos,
soluciones hipotónicas y alteración de p<$ y m'todos físicos (vibracionesultrasónicas, homogenización, congelación$.
Los m'todos de purificación enzim)tica pueden dividirse dependiendo de las
propiedades de la enzima de inter's como el tamao o masa, carga, solubilidad
y sitios de unión específicos.
0ntre los m'todos de inmovilización enzim)tica m)s comunes tenemos a la
adsorción, formación de enlaces iónicos, covalentes y cruzados, atrapamiento y
encapsulación, que incrementan el n5mero de aplicaciones del uso de
enzimas.
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