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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Generación del Extracto Metanólico y sus Fracciones
Los especímenes de Acalypha californica fueron colectados en Septiembre del 2009 en
el cerro del Bachoco, ubicado en los alrededores de Hermosillo (29º8’51.3’’ N,
110º57’0’’O) con ayuda del Ing. Jesús Sánchez, taxónomo del herbario de la
Universidad de Sonora. El número de clasificación de Acalypha californica en dicho
herbario es el 06686.
El rendimiento del proceso de obtención del extracto metanólico fue del 13%
(193.68 g de 1.5 Kg de materia vegetal seca) debido a que la planta presentó una gran
cantidad de material insoluble en metanol, mientras que en las fracciones fue de 1.7%
para la de hexano, 4.7% para la de acetato de etilo, 45% para la de etanol y 6.74% para
la fracción residual.
Cambios Morfológicos Inducidos por el Extracto Metanólico de Acalypha
californica y sus Fracciones en la Línea Celular M12.Ak.C3.F6
En los diferentes cultivos bajo tratamiento se observaron cambios morfológicos que
sugieren que el extracto y las fracciones poseen actividad antiproliferativa. Los
mencionados cambios se presentaron con distinta magnitud dependiendo de la fracción y
de la concentración de la misma.
Se realizó un análisis microscópico de los cultivos a las 24 horas de aplicación
del extracto y sus fracciones, resultando que los cultivos control (con DMSO y sin
tratamiento) no mostraron evidencias de cambios morfológicos o de daño celular, ya que
en condiciones normales las células de esta línea se adhieren a la superficie plástica de la
placa de cultivo, presentado una morfología alargada similar a la de los fibroblastos,
condiciones similares a las que se presentaron en el experimento.
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En el caso de las poblaciones celulares que recibieron tratamiento con el extracto
metanólico de Acalypha californica y la fracción residual presentaron cambios
significativos tanto en el número de células viables como en la morfología de las
mismas, comparando con los controles, ya que las células perdían su capacidad de
adherencia y cambiaban de la forma habitualmente alargada a una redonda pequeña y
con la membrana deforme; también se pudo observar una gran cantidad de detrito
celular, sobre todo en la fracción residual.
Williams (2004) señala que los cambios observados, tales como el encogimiento
de las células, la deformación de la membrana celular, así como la condensación nuclear
obedecen a la activación de vías bioquímicas de la apoptosis.
Conforme se disminuyó la concentración del extracto metanólico y de la fracción
residual los cambios morfológicos también disminuyeron, los pozos que contenían los
cultivos tratados con el extracto metanólico a las concentraciones de 400 y 200 μg/mL y
con la fracción residual a las concentraciones 400, 200, 100 y 50 μg/mL seguían
mostrando una cantidad considerable de detrito celular, sin embargo la adherencia de las
células se fue recuperando conforme disminuía la concentración. En cuanto al resto de
las fracciones estos cambios se observaban a una escala menor a la de las ya
mencionadas.
Lo anterior evidencia que existe un efecto dosis dependiente por parte del
extracto metanólico y la fracción residual, a la vez obtenemos seguridad en que los
cambios presentados por las células son propiamente causadas por interacción de los
compuestos del extracto y sus fracciones con la célula y no a la cantidad aplicada del
mismo, ya que, con excepción de los cultivos tratados con la fracción residual, el resto
de las células se encontraban levemente dañadas. Las concentraciones con las cuales se
trabajó en este experimento han sido ampliamente utilizadas en la búsqueda de
compuestos con actividad antiproliferativa derivados de plantas, con los que se brinda un
sustento al diseño experimental (Abbu y col., 2007; Dermitas y col., 2009).
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Reducción del MTT por Compuestos Presentes en el Extracto Metanólico de
Acalypha californica
Una vez que se realizó el análisis microscópico de los cultivos del experimento se
procedió a evaluar la actividad antiproliferativa por medio del método de reducción del
MTT. Este es un ensayo para cuantificar la viabilidad y la proliferación celular y debido
a que es una técnica no radiactiva y económica, es el ensayo más utilizado en la
detección de compuestos con actividad antiproliferativa. Sin embargo, existen
substancias con potencial reductivo intrínseco que pueden generar malas
interpretaciones de los resultados (Bruggisser y col., 2002).
Como se señaló en la sección de materiales y métodos, la actividad
antiproliferativa del extracto metanólico y sus fracciones químicas en las líneas celulares
L-929, HeLa y RAW 264.7 fueron evaluadas por medio del método de reducción del
MTT, mientras que para el caso de la línea celular M12.Ak.C3.F6 se utilizó citometría
de flujo.
En un estudio anterior (Rascón, 2009), y en el presente, se observó que el
extracto metanólico de Acalypha californica tenía la capacidad de reducir la sal MTT.
Por medio de observaciones morfológicas y cuentas celulares con tinciones supravitales,
nos percatamos de que en los cultivos tratados con el extracto el número de células
disminuía, pero la formación de formazan incrementaba, sugiriendo una interacción
directa de algún componente del extracto con la sal de MTT que causaba la reducción de
esta última. Midiendo la absorbancia, el potencial reductivo fue observado en sistemas
libres de células, lo que confirmó la intervención del extracto en la formación del
formazan.
En la literatura, se ha reportado que agentes antioxidantes tales como los
flavonoides pueden interferir directamente con el ensayo del MTT. Las propiedades de
reducción de la sal por los flavonoides pueden ser debidas a la hidroxilación en la
posición 3, ya que se ha observado que la flavona kaempferol muestra interacción
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directa con la sal de MTT, mientras que la isoflavona genisteina no lo hace. Esta última
está substituida en el anillo B en la posición 3 (Natarajan y col., 2000).
Un estudio publicado por Plumb y colaboradores (1999), acerca de las
propiedades antioxidantes del kaempferol y la quercitina en forma de glicósidos y no
glicósidos, mostró que los glicósidos fueron menos activos que la forma no glicosilada
que posee su grupo hidroxilo libre en la posición 3. Con lo que explican la leve
interferencia del extracto de Ginkgo biloba con el ensayo del MTT. Los flavonoides de
Ginkgo biloba son principalmente glicósidos de quercitina, kaempferol e isorhamnetina,
los cuales en su forma no glicosilada reducen fuertemente el MTT tetrazolio
convirtiéndolo en formazan. Así, pues, aunque no existen estudios referentes al potencial
antioxidante de Acalypha californica, podemos argumentar que posiblemente ésta
contenga flavonoides en forma no glicosilada capaces de interferir con el ensayo.
Por la razón anterior, el ensayo de reducción del MTT no pudo implementarse
para medir el potencial antiproliferativo del extracto en la línea celular M12.Ak.C3.F6;
sin embargo, para el caso de las mediciones de la actividad en las líneas celulares
adherentes L-929, RAW 264.7 y HeLa, pudieron realizarse modificaciones a la técnica
(retirar el extracto y hacer lavados con PBS antes de la aplicación del MTT) los cuales
permitieron suprimir el efecto reductor de los componentes del extracto. En la línea
celular M12.Ak.C3.F6 estas modificaciones no podrían realizarse, pues es una línea
celular que no se adhiere fuertemente al fondo de los pozos de la placa y con simple
agitación mecánica las células serían resuspendidas. Así, la actividad antiproliferativa en
líneas celulares adherentes pudo ser evaluada por el método de reducción del MTT,
mientras que en la línea que no se adhiere fuertemente se tuvo que buscar otra estrategia.
Debido a que la mayoría de los métodos para medir la proliferación celular tienen
como base la reducción de algún compuesto (azul de alamar, resazurina) se optó por
utilizar la citometría de flujo. Cuando una célula entra en apoptosis suceden una serie de
cambios en su fenotipo, entre ellos se encuentra el encogimiento celular y un incremento
temporal en la granularidad. Estos cambios permiten la distinción entre las células
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viables y las apoptóticas con base a las propiedades de dispersión de la luz, lo cual puede
ser medido por el citómetro.
Con el objetivo de comparar los resultados entre el método de reducción del
MTT y el de citometría de flujo se realizaron ensayos de viabilidad utilizando la línea
celular no cancerosa L-929. En la tabla I, se puede observar como en ambos métodos se
obtuvieron resultados muy parecidos, por lo cual se procedió a utilizar esta metodología
para evaluar la actividad antiproliferativa del extracto metanólico y sus fracciones en la
línea celular M12.Ak.C3.F6.
Evaluación de la Actividad Antiproliferativa del Extracto Metanólico de Acalypha
californica y sus Fracciones en la Línea Celular M12.Ak.C3.F6 por Citometría de
Flujo
Para medir la actividad antiproliferativa del extracto metanólico y de sus fracciones en la
línea M12.Ak.C3.F6 se realizaron ensayos de citometría de flujo. El parámetro evaluado
fue el porcentaje de viabilidad celular, el cual se estableció con base a las variables de
tamaño y complejidad de las células, las cuales fueron analizadas mediante gráficos de
puntos.
Coincidiendo con los resultados de la observación microscópica, fueron el
extracto metanólico y la fracción residual quienes mostraron actividad antiproliferativa.
En la tabla II se puede observar que el extracto metanólico presentó un valor de IC50 de
247.22 μg/mL, mientras que la fracción residual disminuyó aún más su IC50 a 59.90
μg/mL, posiblemente debido a la concentración de los compuestos con actividad. En el
resto de las fracciones no se pudo evaluar el valor de IC50, debido a que a la
concentración más alta existía un porcentaje mayor al 50% de células viables. El
comportamiento del extracto metanólico y sus fracciones fue que a mayor concentración
mayor actividad antiproliferativa, evidenciando un efecto dosis dependiente.
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Tabla I. Comparación de resultados de la determinación de la actividad
antiproliferativa del extracto metanólico de Acalypha californica en la línea L-929,
entre el método de reducción de MTT y el de citometría de flujo.
Concentración
del extracto
% de células viables por
reducción del MTT
% de células viables por
citometría de flujo
25 87.00 83.10
50 66.28 68.00
100 55.09 54.95
200 42.94 41.02
400 25.12 22.63
800 7.31 10.94
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Evaluación de la Actividad Antiproliferativa del Extracto Metanólico de Acalypha
californica y sus Fracciones en la Líneas Celulares L-929, RAW 264.7 y HeLa
Mediante el Ensayo de Reducción del MTT
Una vez que se evaluó el potencial antiproliferativo del extracto metanólico de Acalypha
californica y sus fracciones químicas en la línea celular M12.Ak.C3.F6 , se procedió a
determinar si en otras líneas celulares cancerosas (RAW 264.7 y HeLa) poseían el
mismo efecto; así también se evaluó la citotoxicidad de los mencionados en una línea
celular no cancerosa, L-929, con la finalidad de valorar una posible selectividad de los
compuestos presentes en las fracciones hacia las células cancerosas.
Se evaluó el crecimiento de las células RAW 264.7, que fueron tratadas con dosis
desde 12.5-400 µg/mL del extracto y sus fracciones; así como de los cultivos control que
contenían DMSO. Como se observa en la tabla II el extracto metanólico tuvo un efecto
antiproliferativo superior en esta línea que en la M12.Ak.C3.F6, con un IC50 de 100.50
µg/mL; la fracción con mayor actividad fue la de hexano con un IC50 de 52.08 µg/mL,
seguida en efecto por la fracción de acetato de etilo (IC50 57.54 µg/mL) y la residual
(IC50 58.93 µg/mL); por su parte la fracción etanólica presentó un IC50 muy cercano al
del extracto sin fraccionar.
Al igual que en la línea RAW 264.7, el extracto metanólico y la fracción de
etanol presentaron un valor de IC50 más altos (151.35 y 116.95 µg/mL, respectivamente)
en la línea celular de cáncer cérvico uterino, HeLa; las fracciones con mayor actividad
fueron la residual (IC50 50.11 µg/mL) y la de hexano (IC50 46.77 µg/mL), seguida por la
de acetato de etilo con un IC50 57.41 µg/mL (tabla II).
En la línea celular no cancerosa L-929, de tejido conectivo de ratón, la tendencia
del extracto metanólico fue similar a las líneas anteriores; la fracción hexánica no fue
selectiva ya que presentó un IC50 de 46.03 µg/mL , el cual es, muy cercano e incluso
menor al que se presenta en las líneas cancerosas; la fracción de acetato de etilo también
afecta igualmente a la línea no cancerosa y a las cancerosas; en tanto las fracciones de
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Tabla II. Actividad antiproliferativa del extracto metanólico de Acalypha
californica y sus fracciones de solventes en diversas líneas celulares.
Extracto o
Fracción
IC50 ± desviación estándar (µg/mL)
M12.Ak.C3.F6 RAW 264.7 HeLa L-929
Extracto
metanólico
247.22 ± 1.16 100.50 ± 1.16 151.35 ± 1.86 130.26 ± 1.091
Fracción de
hexano
-o- 52.08 ± 1.06 46.77 ± 1.09 46.03 ± 1.15
Fracción de
Acetato de etilo
-o- 57.54 ± 1.057 57.41 ± 1.14 59.98 ± 1.07
Fracción de etanol
-o- 103.51 ± 1.41 116.95 ± 1.05 139.86 ± 1.10
Fracción residual 59.90± 1.05 58.93 ± 1.26 50.11 ± 1.135 100.00 ± 1.09
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etanol y residual mostraron cierta selectividad, debido a que sus valores de IC50 (139.86
µg/mL y 100 µg/mL respectivamente) fueron mayores en esta línea que los de las
células cancerosas. Esta propiedad, en las terapias contra el cáncer es muy requerida, ya
que permite atacar a las células con cáncer, dañando en menor grado a las células sanas.
Las diferencias en la susceptibilidad de estas líneas celulares a las distintas
fracciones del extracto radica en la naturaleza de las mismas; en el estudio se incluyeron
líneas de diferentes especies (humano y ratón), orígenes y propiedades (sensibilidad a
hormonas, tasa de crecimiento, tumorigenicidad), los cuales las convierten en más o
menos propensas a la acción de ciertos compuestos; así bien, una sustancia puede
presentar gran efecto en una línea y en otra ser totalmente inactiva.
Observamos que el valor de IC50 disminuyó en el caso de las fracciones activas
con respecto al extracto metanólico, esto podría ser debido a que mediante los lavados
con solventes de distinta polaridad los metabolitos secundarios, los cuales son
responsables de la actividad biológica, se concentraron, según su naturaleza, y por tanto
poseen un mayor efecto, pues se encuentran sin tantos compuestos que interfieran.
A causa de los efectos secundarios de las drogas y a la resistencia que algunos
tipos de cáncer presentan hacia ellas, se requieren nuevos agentes que posean
selectividad contra las células malignas. La fracción residual del extracto metanólico de
Acalypha californica mostró actividad diferencial, siendo más efectiva en las líneas
celulares cancerosas que en la que no lo es, razón por la cual se eligió para fraccionarla
por cromatografía en columna.
Separación de los Componentes de las Fracciones con Actividad por
Cromatografía de Adsorción
La fracción residual del extracto metanólico de Acalypha californica generó 198
fracciones, de las cuales se generaron 61 grupos de fracciones de acuerdo al perfil
mostrado en la cromatografía en capa fina después de la observación en el UV y el
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revelado con sulfato cérico. El fraccionamiento tuvo un rendimiento del 72.4%. En la
tabla III se muestran los agrupamientos de las fracciones así como sus condiciones en las
que fueron eluidas.
Actividad Antiproliferativa de las Fracciones Derivadas de la Cromatografía de
Adsorción de la Fracción Residual
Con el objetivo de rastrear los grupos de compuestos responsables de la actividad
antiproliferativa en la fracción residual, se midió la proliferación de cultivos de la línea
M12.Ak.C3.F6 previamente tratados por 48 horas con cada uno de los 61 grupos de
fracciones cromatográficas; esto a una única dosis de 100 µg/mL; posteriormente, los
diez grupos que exhibieron mayor actividad antiproliferativa fueron probados a una
concentración de 200 µg/mL.
Ninguno de los 61 grupos de compuestos obtenidos del fraccionamiento por
cromatografía de adsorción presentó una actividad antiproliferativa superior a la fracción
residual, que fue la que le dio origen. El grupo con mayor actividad fue el perteneciente
a F122-F141, con un porcentaje de inhibición del 36.31% a la concentración de 100
µg/mL, mientras que bajo estas condiciones la fracción residual exhibió un porcentaje de
inhibición aproximado al 63%, razón por la que no se descartan efectos de sinergia entre
los compuestos que constituyen la fracción residual (tabla IV).
El concepto de que medicinas derivadas de plantas dependen, únicamente, de los
principios activos ha sido modificado; en muchos casos, substancias adyuvantes
presentes en la planta mejoran la actividad de los compuestos responsables del efecto.
Esta sinergia puede involucrar protección de una substancia activa de la
degradación por enzimas, facilitar el transporte a través de barreras tales como las
membranas de las células u organelos, superar los mecanismos de resistencia a múltiples
medicamentos o proporcionar otras señales a las células que se traducen en una mayor
eficacia de la droga cruda, en comparación con los componentes aislados (Gilbert y col.,
2003).
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Tabla III. Separación de la fracción residual por cromatografía.
Fracciones ( Peso en mg) Fase móvil
(Columna)
Fase móvil
(TLC)
Solvente,
recuperación
F1(4.9), F2-F3(5.1),F4-F7(4.3), F8(0.5), F9-
F18(11.1)
Acetato de etilo 5 hexano/5
acetato de etilo
Diclorometano
F19(1.5), F20(0.3),F21-F25(27.6) 95 acetato de
etilo/5 metanol
3 metanol/7
acetato de etilo
Metanol
F26(9), F27(3.5),F28(10.7) 90 metanol/10
acetato de etilo
3 metanol/7
acetato de etilo
Metanol
F29(95),F30(80.1),F31-F32(56.3),F33(7.9)
,F34(1), F35(8.1)
50 acetato de
etilo/ 50
metanol
3 metanol/7
acetato de etilo
Metanol
F36-F37(19.5), F38-F44(26.1), F45-
F48(12), F49-F54(21.5)
50 acetato de
etilo/ 50
metanol
5 metanol/5
acetato de etilo
Metanol
F55-F62(10.5), F63(12),F64-F69(15.5),
F70(16.8),F71(1.6),F72(24.9), F73(8.1),
F74-F75(9.8), F76-F78(5.6)
50 acetato de
etilo/ 50
metanol
6 metanol/4
acetato de etilo
Metanol
F79(6.5), F80(6.7), F81(12.9), F82-
F86(3.8),F87(1.3), F88(4.1), F89-F91(1)
25 acetato de
etilo/ 75
metanol
6 metanol/4
acetato de etilo
Metanol
F92-F95(82.1), F96(8.7), F97-F99(35.1),
F100-F101(5.1), F102-F103(14.1), F104-
F106(3.5), F107-F109(5.4), F110(1.5),
F111-F121(38.3)
Metanol 7 metanol/3
acetato de etilo
Agua
F122-F141(35.8), (F142-F146-F148-
F150)(21.1) F147(11.1), F151-F159(8.1),
F160-F161(1.4), F162-F166(16.5)
Metanol Metanol Agua
F167-F176(93.5) 10 agua/90
metanol
Metanol Agua
F192(105.4), F193(58.6), F194(35.1),
F195(12.8), F196(25.6), F197(16.2),
F198(3.7)
50 agua/ 50
metanol
Metanol Agua
44
Tabla IV. Grupos de compuestos obtenidos de la separación en columna de la
fracción residual que presentaron mayor actividad antiproliferativa en la línea
celular M12.Ak.C3.F6.
Grupo de fracciones % de inhibición
(100µg/mL)
% de inhibición
(200µg/mL)
30 38.31 48.00
31-32 25.50 44.00
38-44 23.60 49.47
45-48 23.46 58.00
49-54 20.88 38.00
100-101 28.92 43.60
102-103 25.51 14.40
111-121 25.12 42.27
122-141 36.31 61.74
151-159 23.77 53.87
45
Existen algunos casos de interacciones sinérgicas entre los componentes de los
extractos de plantas. Actualmente, el ejemplo más ilustrativo de este tipo de mecanismos
lo brinda el jugo de granada, al cual se le atribuyen propiedades como antioxidante y
anticancerígeno. Se ha observado que el jugo sin fraccionar posee una mayor actividad
antiproliferativa sobre las líneas de cáncer de colon (HT29, HCT116, SW480, SW620) y
de próstata (RWPE-1, 22Rv1) que los compuestos que han sido purificados del mismo.
Por lo que no se excluye la posibilidad de que en el caso de la fracción residual del
extracto metanólico de Acalypha californica suceda una situación similar (Seeram y col.,
2005).
Estudios Fitoquímicos de las Fracciones Químicas del Extracto Metanólico de
Acalypha californica
Con la finalidad de elucidar los compuestos presentes en el extracto metanólico de
Acalypha californica, que como se ha mencionado anteriormente posee actividad
antiproliferativa, se realizaron una serie de estudios químicos encaminados a cumplir
este objetivo. En todos los experimentos se trabajó con las fracciones generadas por los
lavados con hexano, acetato de etilo y etanol del extracto metanólico, así como con la
fracción residual, nos referiremos a ellas como las fracciones químicas para evitar
confusiones con las fracciones generadas por procesos cromatográficos.
Prospección Preliminar de las Fracciones Químicas
La investigación fitoquímica persigue elucidar los constituyentes químicos de las
especies vegetales con las cuales se esté trabajando o bien evaluar la presencia de los
mismos. Cuando no se dispone de estudios químicos anteriores de las especies que
direccionen el trabajo a desarrollar, como es el caso de Acalypha californica, un análisis
de prospección preliminar es muy importante.
Así, con la finalidad de identificar los grupos de metabolitos secundarios
relevantes presentes en las fracciones químicas del extracto metanólico de Acalypha
46
californica se realizaron ensayos de cromatografía en capa fina usando como
reveladores agentes específicos para alcaloides (reactivo de Dragendorff), para
triterpenos/esteroides (reactivo de Lieberman Burchard) y para taninos (solución de
cloruro férrico).
La primera parte de los ensayos se realizaron para encontrar los sistemas de
solventes que ofrecieran una mejor resolución en las placas cromatográficas,
evaluándose por manchas definidas y la menor cantidad posible de muestra retenida en
el punto de aplicación. Después de varias pruebas, se concluyó que el mejor sistema para
el desarrollo de las muestras de la fracciones de hexano y acetato de etilo fue una mezcla
de cloroformo/metanol 98:2 v/v (figura 5A). En tanto, en las fracciones de etanol y
residual no se obtuvo buena resolución, inclusive con sistemas tan polares como alcohol
butílico/ácido acético/agua 4:1:5 v/v (figura 5B).
Por lo anterior, las fracciones de etanol y residual fueron sujetas a un
procedimiento de limpieza en un cartucho de sílica C-18, para esto 20 mg de las
muestras fueron diluidos en la fase agua/metanol 8:2, con auxilio del sonicador. Las
muestras fueron aplicadas en los cartuchos y se eluyeron con agua/metanol 8:2, 1:1 y
metanol. Cada elución fue colectado como una fracción separada y monitorizado por
cromatografía en capa fina como una fracción diferente. El revelado fue hecho con
anisaldehído sulfúrico.
Como se observa en la figura 9C, la fracción de etanol obtuvo una mayor
resolución al eluirse con el sistema 6 metanol: 4 acetato de etilo, en tanto que la fracción
residual mantuvo la mayor parte del material en el punto de aplicación, lo que demuestra
la alta polaridad de los compuestos presentes en ella y mismo que se evidenció por la
gran cantidad de material retenido en el cartucho de SPE (figura 5D).
47
Figura 5. Elución de las fracciones químicas del extracto metanólico de Acalypha
californica. A. Elución cloroformo/metanol 98:2 v/v. B. Elución alcohol
butílico/ácido acético/agua 4:1:5 v/v. Leyendas. 1. Extracto metanólico, 2.
Fracción de hexano, 3. Fracción de acetato de etilo, 4. Fracción de etanol, 5.
Fracción residual. C.Elución metanol/acetato de etilo 6:4, de las fracciones de
limpieza de la fracción de etanol. D. Elución metanol/acetato de etilo 6:4, de
las fracciones de limpieza de la fracción residual. Leyendas. 1. Fracción de
etanol o residual, 2.Fracción agua/metanol 8:2, 3. Fracción agua/metanol 1:1,
4. Fracción metanol, 5. Fracción cloroformo.
48
Una vez definidos los sistemas de solventes se utilizaron diferentes agentes
reveladores específicos para una clase de metabolitos secundarios. Los resultados fueron
considerados positivos por el surgimiento de una coloración naranja para alcaloides,
verde o azul para triterpenos/esteroides y azul para taninos. Las tablas V y VI resumen
los tipos de metabolitos presentes en cada fracción.
Es de notar que el perfil químico de la fracción de hexano y acetato de etilo es
similar, además el patrón de manchas de los ensayos en cromatografía en capa fina es el
mismo, razón por la cual estas dos fracciones se juntaron, el grupo se denominó fracción
hexano-acetato de etilo.
Debido a la metodología con la que se obtuvieron las fracciones químicas del
extracto metanólico (lavados de este con hexano, acetato de etilo y etanol) eran de
esperarse los resultados obtenidos. En el revelado con los distintos reactivos pudimos
percatarnos de que la fracción hexánica y de acetato de etilo poseen sustancias como
terpenos o esteroides, principalmente, sin embargo, no posee compuestos del tipo de los
alcaloides y taninos, situación que no sorprende ya que estos últimos son de polaridad
alta y por lo tanto fueron encontrados en las fracciones de etanol y residual.
Así, una técnica de prospección preliminar como la cromatografía en capa fina
permite realizar un abordaje acerca del comportamiento químico de los extractos con los
cuales se trabaja. Con base a lo anterior se trabajó en dos líneas principales para la
purificación y caracterización de compuestos, una representada por la fracción hexano-
acetato de etilo (polaridad baja) y otra por las fracciones de etanol y residual (polaridad
alta).
49
Tabla V. Análisis fitoquímico por prospección preliminar de las fracciones de
hexano y acetato de etilo del extracto metanólico de Acalypha californica.
Metabolitos Fracción de hexano Fracción de acetato
de etilo
Alcaloides x x
Esteroides/triterpenos
Taninos x x
50
Tabla VI. Análisis fitoquímico por prospección preliminar de los grupos resultados
del proceso de extracción por fase sólida de la fracción de etanol y
fracción residual de la planta Acalypha californica.
Metabolitos Fracción de etanol Fracción residual
Crudo 8agua:
2metanol
5agua:
5metanol
Metanol CHCl3 Crudo 8agua:
2metanol
5agua:
5metanol
Metanol CHCl3
Alcaloides x x x x x x x x x x
Esteroides/
triterpenos
x x x x x x x x x x
Taninos x x x
51
Identificación de Compuestos de las Fracciones Químicas Polares (Etanol y
Residual) del Extracto Metanólico de Acalypha californica
Los ensayos de prospección preliminar permitieron evidenciar la complejidad de las
fracciones químicas de etanol y residual. Los metabolitos presentes en ellas son de
naturaleza muy polar, lo que quedó reflejado mediante los ensayos de cromatografía en
capa fina, ya que una gran cantidad de material se mantenía retenido en el punto de
aplicación, aún utilizando sistemas de elución fuertemente polares. El revelado con los
agentes específicos para determinados grupos de metabolitos secundarios demostró que
taninos se encuentran presentes en ambas fracciones químicas. Contando con esta
información se procedió a iniciar la investigación fitoquímica de dichas muestras, con la
finalidad de caracterizar los compuestos presentes en ellas.
Cromatografía de exclusión molecular para la fracción de etanol. Para iniciar
el estudio cromatográfico de las fracciones químicas polares se hizo uso de la técnica de
cromatografía de permeación en gel o de exclusión molecular, utilizando sephadex LH-
20 como fase estacionaria; ésta constituye una de los procedimientos de aislamiento de
metabolitos secundarios más efectivos y más utilizados en el área de los productos
naturales (Qa’Dan y col, 2010; Shu y col, 2010; Wan y col, 2011).
Sephadex LH-20 ha sido ampliamente empleado para la cromatografía de
sustancias polares desde 1974, utilizando fases móviles como metanol y mezclas de
metanol- agua y metanol-acetona, lo que permite la elución de compuestos polares.
Razón por la cual fue elegido como método de trabajo para las fracciones en cuestión
(Lea y col.,1974; El-Alfy y col., 2011; Shu y col, 2011).
La primera de las fracciones químicas que se sometió a análisis fue la generada
con etanol. Se obtuvieron 600 fracciones, que fueron analizadas por cromatografía en
capa fina, utilizando mezclas de metanol y acetato de etilo como fase móvil, éstas fueron
reveladas con anisaldehído sulfúrico. De acuerdo al perfil presentado en las placas
cromatográficas las fracciones fueron reunidas en 31 grupos.
52
Mediante los ensayos anteriores se observó que el patrón de los grupos de
fracciones era muy complejo. Las sustancias eran altamente polares y se encontraban en
mezclas que difícilmente se separarían por métodos tradicionales. Por lo que se
consideró que posiblemente las muestras contenían taninos condensados.
Estudios realizados por Andrade (2002), acerca de la constitución química del
extracto etanólico de la corteza de Harconia speciosa mostraron que dicha especie
presenta un elevado contenido de taninos condensados, este autor empleó la técnica de
cromatografía contracorriente de alta velocidad (HSCCC), resultando en la obtención de
fracciones impuras de las cuales no se consiguieron aislar metabolitos. Situación que se
presentó en el análisis de la fracción de etanol de Acalypha californica.
Así, la complejidad de esta fracción no permitió un estudio fitoquímico más
profundo de este material con la utilización de las técnicas de uso común para el
aislamiento. La tentativa de utilizar cromatografía de permeación en gel usando
sephadex LH-20 no fue eficiente en la separación de los metabolitos de la fracción de
etanol. Se presentó una fuerte adsorción del material en la matriz, se utilizaron grandes
cantidades de solventes para la elución del material retenido y se requirió la
regeneración de la fase estacionaria. Debido a lo anterior y al hecho de que en la
fracción residual se encuentran metabolitos con naturaleza similar a la fracción de etanol
no se realizó la separación mediante esta metodología para la primera.
En la literatura, se reporta que taninos condensados difícilmente son separados
usando técnicas cromatográficas de fase normal, fase reversa o exclusión por tamaño,
estas metodologías solo permiten una buena separación de sustancias sencillas, y
comienzan a ser ineficientes para taninos condensados con un grado de polimerización
elevado. Aunado a esto, este tipo de sustancias son difícilmente aisladas, generalmente
solo se realiza una identificación de las mismas (Rodrigues, 2007; Shu y col., 2011).
Las experiencias anteriores direccionaron el estudio hacia el establecimiento de
una nueva estrategia de investigación para la identificación de los metabolitos presentes
en las fracciones químicas polares de Acalypha californica.
53
Perfil cromatográfico por HPLC-PAD de las fracciones etanólica y residual
del extracto metanólico de Acalypha californica. En un intento por realizar una
identificación directa de los metabolitos contenidos en las fracciones etanólica y residual
del extracto metanólico de Acalypha californica y con la finalidad de generar el perfil
químico de las mismas se optó por implementar metodologías basadas en el análisis por
HPLC-PAD. La identificación de los metabolitos sería realizada por la comparación de
los espectros de ultravioleta de los picos principales presentados en los cromatogramas
con aquellos de la biblioteca generada por la inyección de patrones auténticos y/o
sustancias previamente aisladas y caracterizadas.
Para iniciar los análisis de la fracción etanólica y residual fue disuelto 1 mg de
cada fracción en 1 mL de la mezcla agua- metanol 95:5 (v/v), seguido de una filtración
en membrana de PTFE con poro de 0.45 µm. La primera evaluación de los perfiles
cromatográficos fue realizada inyectando 20 µL de la solución en HPLC analítico. Fue
utilizada una columna RP18 y se empleó un gradiente exploratorio lineal con variación
del solvente B (metanol) en un intervalo de 5-100% en 60 minutos.
Al observar los cromatogramas de ambas fracciones se denotó la clara
complejidad de las matrices. Una baja resolución cromatográfica y una elución
característica de una banda alargada en la región entre tr= 10-35 minutos fueron otros
indicativos de la presencia de taninos condensados en ambas fracciones (figura 6 y 8).
Cabe señalar, que comparando los perfiles cromatográficos de la fracción
etanólica (figura 6) y de la fracción residual (figura 7), la primera presentó un
comportamiento cromatográfico más afectado, lo que se denota en la altura mayor de la
rampa del cromatograma y que indica que la concentración de taninos condensados debe
de ser mayor en esta fracción. Sin embargo, es preciso señalar que debido a la alta
polaridad de los compuestos presentes en la fracción residual se presentaron problemas
en la disolución de ésta, y al filtrar la muestra por medio de la membrana de PTFE gran
cantidad del material quedo retenido en ella; por lo que las sustancias contenidas en
54
dicha fracción son muy complejas, probablemente, taninos con alto grado de
polimerización que no atravesaron la membrana y por tanto, no fueron analizados.
Haciendo uso del detector PAD, el cual realizó un barrido de 200-600 nm, tres
clases de metabolitos fueron identificados en las fracciones químicas del extracto
metanólico de Acalypha californica, en estudio. Catequinas monoméricas y oligoméricas
(taninos condensados o proantocianidinas) fueron determinados con base a sus espectros
de absorción en la región UV; estos exhiben una banda débil cerca de 280 nm, un
pequeño hombro próximo a 220 nm y una máxima entre 205-210 nm. En tanto, los
derivados del ácido gálico presentan bandas de máxima absorción intensas en 215 y 271
nm. Los flavonoides, por su parte, presentan una Banda II, con máximos en la región
espectral de 240-290, atribuida al anillo A y de la banda I, con máximos en la región
espectral de 300-390 nm, atribuida al anillo B. Así, los picos 1,2,3 de la fracción
etanólica (figura 7) y 1,2,3 de la fracción residual (figura 9) exhibieron espectros
similares a compuestos derivados del ácido gálico, mientras los picos 4,5 de la fracción
etanólica (figura 7) y 4,5,6 de la fracción residual (figura 9) mostraron el espectro
característico de los taninos condensados; el pico 6 de la fracción etanólica (figura 7)
coincide con el espectro de los flavonoides (Merken y col., 2000; Rohr y col., 2000;
Wang y col., 2000).
Por medio de experimentos de co-inyección de patrones y mezclas de
metabolitos conocidos se identificó el pico 4 (tr= 29.52 min) y el pico 5 (tr= 30.76 min)
de la fracción etanólica (figura 7) como catequina y epicatequina, respectivamente.
En el estudio de Rodrigues (2007) se señala que el largo período de tiempo que
transcurre entre la producción, almacenamiento y secado de los extractos contribuye a la
polimerización de los taninos condensados, y consecuentemente en la dificultad de un
análisis cromatográfico uniforme. A la par, el autor sugiere implementar etapas de
extracción en fase sólida (SPE) para obtener resultados más informativos con relación a
la composición química de los extractos.
55
Figura 6. Perfil cromatográfico de la fracción etanólica del extracto metanólico de
Acalypha californica obtenidos por HPLC-PAD. Sistema de elución
gradiente: 5-100% de metanol en 60 minutos; columna Phenomenex®
Luna
(2) RP18 (250 x 4.6 mm di; 5 µm), HPLC (Jasco®
), flujo 1 mL/min, = 254
nm.
Minutos
56
Figura 7. Espectros en la región de UV para los principales picos eluídos en el
cromatograma de la figura 6. Los espectros 1, 2, 3 fueron atribuidos a
derivados del ácido gálico, 4 y 5 fueron identificados como catequina y
epicatequina respectivamente.
18.52 min 19.76 min
21.12 min 29.52 min
30.76 min 31.43min
57
Figura 8. Perfil cromatográfico de la fracción residual del extracto metanólico de
Acalypha californica obtenidos por HPLC-PAD. Sistema de elución
gradiente: 5-100% de metanol en 60 minutos; columna Phenomenex®
Luna
(2) RP18 (250 x 4.6 mm di; 5 µm), HPLC (Jasco®
), flujo 1 mL/min, = 254
nm.
Minutos
58
Figura 9. Espectros en la región de UV para los principales picos eluídos en el
cromatograma de la figura 8. Los espectros 1, 2, 3 fueron atribuidos a
derivados del ácido gálico, y 4, 5, 6 fueron a taninos condensados.
19.62 min 20.86 min
22.09 min 30.47 min
30.89 min 31.85min
59
Justamente, con la finalidad de obtener un perfil cromatográfico de las fracciones
etanólica y residual con mayor resolución se realizaron ensayos de SPE. Durante la
realización del procedimiento de SPE para la fracción etanólica no se presentó
inconveniente alguno. El análisis por cromatografía en capa fina mostró una mejor
resolución a lo largo de las eluciones, sugiriendo una mayor concentración en la fracción
eluída con agua-metanol 8:2 v/v. Otro factor importante del proceso fue la eliminación
de material apolar, el cual permaneció retenido en el cartucho y fue evidenciado por la
desorción con cloroformo; este tipo de sustancias deben de evitarse en los análisis por
HPLC fase reversa, pues podrían comprometer la vida útil de la columna.
Por otro lado, en el procedimiento con la fracción residual acontecieron una serie
de problemas relacionados a la baja solubilidad de la fracción aún en mezclas con alta
proporciones de agua. El material, altamente polar, no consiguió internalizarse en la
matriz del cartucho y quedó retenido en el filtro poroso; al final del proceso el cartucho
permaneció impregnado con gran cantidad de material aplicado. La fracción
aparentemente más rica en manchas fue la eluída con la mezcla agua-metanol 8:2.
Así, las tres fracciones resultantes para cada una de las fracciones químicas en
cuestión fueron analizadas por HPLC bajo las condiciones señaladas anteriormente para
las fracciones etanólica y residual.
Los cromatogramas de las figuras 10 y 12 muestran el perfil de las fracciones
obtenidas mediante la SPE de la fracción de etanol, se observa como existe una mayor
cantidad de picos que en la fracción de origen, así como una mayor resolución de los
mismos. En la fracción de la SPE eluida con agua-metanol 8:2 v/v (fracción de SPE 8:2)
las sustancias eluyeron en los primeros 20 minutos del desarrollo del método, en tanto en
la fracción de la SPE eluida con agua-metanol 1:1 v/v (fracción de SPE 1:1) aconteció
de los 20-30 minutos, lo que evidencia la naturaleza altamente polar de las sustancias
presentes en la fracción de SPE 8:2. A la par, en el cromatograma de la figura 12 fue
advertida la presencia de taninos condensados, reflejada en el alargamiento de la banda
60
cromatográfica que va de 20 a 30 minutos, comportamiento típico de este tipo de
compuestos.
Mediante la comparación de los espectros en la región del ultravioleta para los
picos principales presentes en los cromatogramas de las fracciones de SPE 8:2 y 1:1 de
la fracción etanólica con los de la literatura y la biblioteca de padrones del equipo fueron
identificados taninos condensados (figura 11: 1,4,5) (figura 13: 1,5,6,7) y derivados del
ácido gálico (figura 11: 2,3) (figura 13: 2,3,4). Estos datos son consistentes con los
obtenidos para la fracción total de etanol.
El cromatograma presentado en la figura 14 pertenece al perfil generado para la
fracción de SPE 8:2 derivada de la fracción residual. Se observa un mejor desarrollo y
resolución de los picos de las sustancias comparando con el cromatograma de la fracción
residual total, las sustancias eluyeron dentro de los primeros 30 minutos de la
implementación del método, debido a su polaridad elevada. Mediante los espectros en la
región del ultravioleta de los principales picos señalados en el cromatograma fue
determinado que esta fracción contiene taninos condensados (figura 15: 1,2,4,5) y fue
identificado el flavonoide quercitina-3-O-α-L-ramnopiranósido (figura 15:3).
La fracción de SPE 1:1 de la fracción residual produjo un cromatograma con
mucho ruido, en el cual sobresalían tres picos, sin embargo ninguno de ellos fue
identificado.
Las fracciones eluidas con metanol en el procedimiento de SPE tanto de la
fracción etanólica como de la residual mostraron un perfil cromatográfico poco
informativo por lo que no fueron considerados para la presente discusión.
Posteriormente, se realizaron ensayos para optimizar las condiciones del método
de elución en la HPLC con la finalidad de lograr una mejor resolución de los picos del
cromatograma de las fracciones y así, continuar con una separación mediante un equipo
de HPLC preparativa; sin embargo no se tuvo éxito en las separaciones cromatográficas,
aún intentando reproducir fases móviles descritas en la literatura.
61
Figura 10. Perfil cromatográfico de la fracción de SPE eluida con agua:metanol 8:2
v/v de la fracción etanólica del extracto metanólico de Acalypha
californica obtenidos por HPLC-PAD. Sistema de elución gradiente: 5-
100% de metanol en 60 minutos; columna Phenomenex®
Luna (2) RP18 (250
x 4.6 mm di; 5 µm), HPLC (Jasco®
), flujo 1 mL/min, = 254 nm.
Minutos
62
Figura 11. Espectros en la región de UV para los principales picos eluídos en el
cromatograma de la figura 10. Los espectros 1, 4, 5 fueron atribuidos a
taninos condensados, y 2, 3 fueron a derivados de ácido gálico.
3.95 min 9.03 min
17.96 min 20.72 min
22.09 min 24.42 min
63
Figura 12. Perfil cromatográfico de la fracción de SPE eluida con agua:metanol 1:1
v/v de la fracción etanólica del extracto metanólico de Acalypha
californica obtenidos por HPLC-PAD. Sistema de elución gradiente: 5-
100% de metanol en 60 minutos; columna Phenomenex®
Luna (2) RP18 (250
x 4.6 mm di; 5 µm), HPLC (Jasco®
), flujo 1 mL/min, = 254 nm.
Minutos
64
Figura 13. Espectros en la región de UV para los principales picos eluídos en el
cromatograma de la figura 12. Los espectros 1, 5, 6, 7 fueron atribuidos a
taninos condensados, y 2, 3, 4 a derivados del ácido gálico.
3.12 min 9.03 min
17.83 min 19.06 min
20.59 min 29.52 min 31.02 min
65
Figura 14. Perfil cromatográfico de la fracción de SPE eluida con agua:metanol 8:2
v/v de la fracción residual del extracto metanólico de Acalypha
californica obtenidos por HPLC-PAD. Sistema de elución gradiente: 5-
100% de metanol en 60 minutos; columna Phenomenex®
Luna (2) RP18 (250
x 4.6 mm di; 5 µm), HPLC (Jasco®
), flujo 1 mL/min, = 254 nm.
Minutos
66
Figura 15. Espectros en la región de UV para los principales picos eluídos en el
cromatograma de la figura 14. Los espectros 1,2, 4, 5 fueron atribuidos a
taninos condensados, y 3 fue identificado como quercitina-3-O-α-L-
ramnopiranósido.
11.91 min 21.55 min
21.95 min 26.21 min
29.93 min 31.16 min 32.12 min
67
Figura 16. Perfil cromatográfico de la fracción de SPE eluida con agua:metanol 1:1
v/v de la fracción etanólica del extracto metanólico de Acalypha
californica obtenidos por HPLC-PAD. Sistema de elución gradiente: 5-
100% de metanol en 60 minutos; columna Phenomenex®
Luna (2) RP18 (250
x 4.6 mm di; 5 µm), HPLC (Jasco®
), flujo 1 mL/min, = 254 nm.
Minutos
68
Lo anterior posee una explicación; como se abordó en párrafos pasados las
fracciones en cuestión generaron espectros en la región de ultravioleta característicos de
taninos condensados; estos son polifenoles constituidos por unidades de flavan-3-ol, los
cuales se encuentran unidos a través de enlaces C4-C6 o C4-C8, formando oligómeros y
polímeros de alto peso molecular. La elucidación estructural de estos compuestos,
principalmente de aquellos con alto grado de polimerización, es difícil debido a su
carácter heterogéneo, es esta complejidad y diversidad exhibida por los taninos
condensados lo que causa que su caracterización permanezca sin muchos cambios, así
como que sus relaciones estructura-actividad sean poco conocidas (Shu y col., 2010).
Otra de las dificultades de este tipo de compuestos (taninos condensados) es que
no son completamente resueltos durante las separaciones cromatográficas por HPLC.
Generalmente, existe la necesidad de análisis muy largos, principalmente para garantizar
que los analitos sean eluidos del sistema cromatográfico. Además, los análisis de los
espectros en la región del ultravioleta dan apenas una orientación sobre el tipo de
compuestos presentes y no permiten saber cuántas unidades componen la estructura total
del compuesto; un monómero, dímero, trímero o un polímero, generan un espectro en
ultravioleta similar, esto debido a que la constitución del cromóforo es la misma (Wu y
col., 2005; Karonen y col., 2006).
La elucidación de las estructuras de taninos condensados se realiza comúnmente
por medio de una purificación extensiva, por métodos espectrales y degradación química
con aducción tiolítica o fluroglucinol. Sin embargo, la multiciplidad de la resonancia y
los problemas asociados con el isomerismo rotacional y conformacional a menudo
complican la interpretación de sus secuencias. La degradación química requiere de una
tediosa separación a grande escala, purificación múltiple y varias reacciones químicas, y
al final, muchas identidades estructurales pueden permanecer sin resolver por la carencia
de muestras auténticas (Hui y col., 2007).
De esta forma, teniendo en vista la dificultad de aislamiento de los metabolitos
de las fracciones etanólica y residual del extracto metánolico de Acalypha californica
69
sea por cromatografía de adsorción o por cromatografía de partición, la etapa siguiente
consistió en hacer uso de la espectrometría de masas en tándem para investigar la
constitución química de las fracciones.
Análisis por FIA-ESI-IT-MS. La espectrometría de masas con ionización por
electrospray se ha convertido en uno de los métodos más populares para la
caracterización de productos naturales, incluyendo polifenoles (Hui- Jing y col., 2008).
Catequinas y taninos condensados son frecuentemente analizados en los modos
positivo y negativo, y varias interfaces son empleadas para la generación de estos iones,
siendo, como ya se mencionó, la ionización por electrospray la más común. Esta técnica
es reconocida por permitir la investigación de los tipos más diversos de matrices en fase
gaseosa, incluyendo analitos que exhiben alta polaridad, permitiendo así, la
caracterización estructural con cantidades mínimas de muestra ( Rodrigues, 2007).
En años recientes, el acoplamiento de la cromatografía líquida y la
espectrometría de masas con ionización por electrospray, han proveído una poderosa
herramienta para la caracterización de los taninos condensados. Sin embargo, como ya
se comentó, los análisis por HPLC demoran mucho tiempo lo que constituye una
desventaja cuando se busca la obtención de un perfil químico de cierta matriz en un
tiempo relativamente corto (Roopesh y col., 2010).
Diversos trabajos han demostrado que análisis por espectrometría de masas
utilizando el modo de inserción directa de la muestra (FIA), se han distinguido como una
forma más representativa y rápida para establecer la composición química de una
determinada matriz (Catharino y col., 2006; Rodrigues y col., 2007).
Tomando en cuenta las observaciones anteriormente expuestas y teniendo una
idea de la composición química de las fracciones, se realizó una caracterización química
de los metabolitos secundarios presentes en las fracciones etanólica y residual mediante
70
la técnica de espectrometría de masas con ionización por electrospray y trampa de iones
(ESI-IT-MS) empleando el modo de inserción directa.
Comparado con el modo positivo, el modo negativo generó resultados más útiles
acerca de la composición química de las fracciones etanólica y residual del extracto
metanólico de Acalypha californica. De esta manera, aunque se realizaron los espectros
de masas en modo positivo, solamente los resultados en modo negativo serán
presentados y discutidos. Así, el modo negativo fue seleccionado teniendo en cuenta el
conocimiento previo de la composición fenólica de la fracciones, dada por los espectros
en la región de UV obtenidos de los análisis por HPLC-PAD. Esta clase de metabolitos
secundarios ionizan fácilmente por la desprotonación de los hidróxilos fenólicos,
posteriormente estas moléculas desprotonadas son transferidas eficientemente para la
fase gaseosa como iones negativos.
En la figura 17 se muestra el espectro de masas de barrido completo presentando
los iones de las moléculas desprotonadas ([M-H]-) de la fracción etanólica de Acalypha
californica.
Para proporcionar una mayor selectividad y especificidad de los iones
precursores observados y para tener más indicios sobre la naturaleza química de esta
matriz, fueron generados espectros de segundo orden (MS/MS) de los principales iones
diagnósticos. En la tabla VII se resumen las principales características sobre los iones
producidos durante los análisis por FIA-ESI-IT-MS/MS de la fracción etanólica. Fueron
realizadas comparaciones de los espectros MS2 con los presentados en la literatura.
El primero de los picos del espectro al que fue atribuido un compuesto fue el de
m/z 183 el cual fue asignado al galato de metilo cuya estructura se muestra en la figura
18A; este hallazgo va soportado a su vez por la información proporcionada por los
espectros UV de los análisis en HPLC-PAD, ya que estos resultaron en perfiles
característicos de compuestos derivados del ácido gálico.
La estructura mostrada en la figura 18B fue propuesta para generar el ión de m/z
593; esta pertenece a la familia de las proantocianidinas y se encuentra constituida por
71
un dímero de [epi]catequina- [epi] galocatequina. Cabe señalar, que la estereoquímica de
los carbonos C2 y C3 de las catequinas no se puede determinar en experimentos de MS,
esto a causa de que el único dato que se genera sobre la estructura es precisamente la
masa que esta posee; esta es la razón por la cual al compuesto se le denomina
[epi]galocatequina.
Otro de los picos relevantes referentes a proantocianidinas, mostrados en el
espectro de masas fue el de m/z 609 y se atribuyó a dos unidades de [epi] galocatequina,
la estructura de este compuesto se muestra en la figura 18C.
El ión perteneciente a m/z 301 fue identificado como el flavonoide quercetina. Al
igual que este último el ácido elágico genera un ión en m/z 301, sin embargo cuando se
realizó el MS2
de dicho ión no se registraron iones producto, lo que confirma que se trata
de quercetina y no del ácido elágico el cual genera iones de m/z 257,229 y 185 en el
espectro MS2 (figura 18D) (Kajdzanoska y col., 2010).
El fragmento m/z 633 fue identificado como galoil-HHDP-glucopiranosa; en la
figura 19 se muestra el espectro de MS2 de este ión; se puede observar que sobresalen
dos fragmentos de ión, uno m/z 463 el cual es debido a la pérdida de ácido gálico (170
uma) y otro de m/z 301 después de la pérdida de galoilglucosa (332 uma) (Soong y col.,
2005; Kajdzanoska y col., 2010).
Se encontraron evidencias de que en la muestra se encontraba presente el
compuesto sulfoquinovosil diacilglicerol teniendo esterificados el ácido palmítico y el
ácido linóleico; en el espectro de MS2 de la figura 20 se observa el ión base en m/z 815,
así como los iones productos de m/z 599, que revela la pérdida de ácido palmítico, y el
de m/z 537 generado por la pérdida del ácido linóleico (Gage y col., 1992).
De esta forma los experimentos que fueron realizados empleando la técnica FIA-
ESI-IT-MS/MS generaron datos importantes que permitieron identificar las clases de
sustancias presentes en la fracción etanólica. Estos mostraron que dicha fracción se
encuentra constituida principalmente por flavonoides, proantocianidinas y derivados del
72
Figura 17. Espectro de masas de primer orden, en modo de barrido completo de la
fracción etanólica del extracto metanólico de Acalypha californica. Los
iones señalados ( ) fueron identificados mediante su espectro de MS2 o por
comparación con la literatura.
F.EtOH.esineg25V_0305201 101_110408093345 #1-17 RT: 0.00-0.27 AV: 17 NL: 1.8E2 T: ITMS-cESI Fullms [150.00-
2000.00]
73
Tabla VII. Datos espectrométricos de los compuestos identificados durante los
experimentos de FIA-ESI-IT-MS/MS de la fracción etanólica.
Compuesto Ión precursor
(m/z)
Iones productos (MS2)
(m/z)
Ácidos fenólicos
Galato de metilo 183
Proantocianidinas
Dímero [epi] catequina,
[epi] galocatequina
593
Dímero [epi] galocatequina 609
Flavonoides
Quercitina 301
Glicósidos
Galoil-HHDP-
glucopiranosa
633 463, 301
Otros
Sulfoquinovosil
diacilglicerol (R1= ácido
palmítico, R2=ácido
linoleico)
815 559, 537
74
Figura 18.Metabolitos secundarios identificados en la fracción etanólica mediante
análisis de FIA-ESI-IT-MS/MS. A. Galato de metilo, B. Dímero de
[epi]catequina- [epi]galocatequina, C. Dímero [epi]galocatequina, D.
Quercetina, E. Galoil-HHDP-glucopiranosa, F. Sulfoquinovosil diacilglicerol
HO
OH
COOCH3
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
HO
OH
OH
OH
OH
O
OHHO
O
S OHO
O R2
O
O
R1
O
O
R1 = Ácido palmítico
R2= Ácido linoleico
A B
C
D
EF
75
ácido gálico. Estos resultados son consistentes con los obtenidos mediante la técnica de
HPLC-PAD.
En cuanto a la fracción residual, ésta también fue analizada por FIA-ESI-IT-
MS/MS en modo negativo; en la figura 21 se muestra el espectro de masas en “full-
scan” para esta fracción y se señalan los iones que fueron identificados; también en la
tabla VIII se exhiben las características de los compuestos identificados.
El ácido quínico, perteneciente al grupo de los ácidos fenólicos, fue identificado, su
presencia es denotada por el ión en m/z 191 que se muestra en el espectro de la figura 21.
La estructura de este compuesto es presentada en la figura 22A.
Del grupo de las proantocianidinas solo fue posible identificar el dímero de
[epi]galocatequina, el cual generó una molécula desprotonada con m/z 609 y cuya
estructura es mostrada en la figura 22B.
Varios flavonoides fueron determinados mediante los espectros de masas. El
primero de ellos fue la quercitina, en cuyo MS2 no generó fragmento del ión m/z 301,
bajo las condiciones de trabajo (figura 22C) (Rodrigues, 2007).
La fragmentación de segundo orden de la molécula desprotonada de m/z 433
resultó en el espectro de iones producto mostrado en la figura 23, el cual ilustra
informaciones estructurales compatibles con el compuesto quercitina-3-O-arabinósido.
Como se observa, se genera el pico máximo en m/z 301 perteneciente a la fracción de
quercitina después de la pérdida de la unidad de arabinosa (figura 22D) (Kubomura y
col., 2006).
El compuesto quercitina-3-O- ramnósido fue postulado a encontrarse en la
fracción residual debido a la presencia del pico del ión m/z 447, mostrado en el “full-
scan” de la figura 21. La estructura de este compuesto se puede ver en la figura 22E.
Al igual que en la fracción etanólica, el compuesto galoil-HHDP-glucopiranosa
fue detectado en la fracción residual en m/z 633.
76
Figura 19. Espectro de masas de segundo orden del ión precursor de m/z 633
atribuido a la molécula galoil-HDDP-glucopiranosa. El ión producto de
m/z 463 es debido a la pérdida de ácido gálico, en tanto el ión de m/z 301 es
causado por la pérdida de la fracción galoilglucopiranosa. El espectro fue
obtenido en modo negativo, con energía de colisión del 25%.
77
Figura 20. Espectro de masas de segundo orden del ión precursor de m/z 815
atribuido a la molécula sulfoquinovosil diacilglicerol. El ión producto de
m/z 599 es debido a la pérdida de ácido palmítico, en tanto el ión de m/z 537
es causado por la pérdida del ácido linoleico. El espectro fue obtenido en
modo negativo, con energía de colisión del 33%.
78
Figura 21. Espectro de masas de primer orden, en modo “full- scan” de la fracción
residual del extracto metanólico de Acalypha californica. Los iones
señalados ( ) fueron identificados mediante su espectro de MS2 o por
comparación con la literatura.
79
Tabla VIII. Datos espectrométricos de los compuestos identificados durante los
experimentos de FIA-ESI-IT-MS/MS de la fracción residual.
Compuesto Ión precursor
(m/z)
Iones productos (MS2)
(m/z)
Ácidos fenólicos
Ácido quínico 191
Proantocianidinas
Dímero [epi] galocatequina 609
Flavonoides
Quercetina 301
Quercetina-3-O-
arabinósido
433 301
Quercetina-3-O-ramnósido 447 301
Glicósidos
Galoil-HHDP-
glucopiranosa
633 463, 301
80
Así, al comparar las figuras 17 y 21 se observa que los espectros de masas
indican que existe una gran similitud entre los metabolitos secundarios de ambas
fracciones, ahora bien, pensado en la actividad biológica, estas dos fracciones exhiben
propiedad antiproliferativa muy diferente, siendo la fracción residual la más activa.
Al revisar los procesos a los cuales dichas fracciones fueron sometidas se encuentra una
explicación a lo anteriormente expuesto. Tanto para los análisis de espectrometría de
masas como para los de HPLC-PAD, se precisa que las muestras sean disueltas y,
posteriormente, filtradas mediante membrana de PTFE con tamaño de poro de 0.45 µm,
esto con la finalidad de no dañar los equipos. Este proceso fue llevado a cabo sin
contratiempos para la fracción etanólica, sin embargo, y como ya se había mencionado,
con la fracción residual surgieron muchos problemas, ya que debido a la alta polaridad
de sus constituyentes fue difícil de disolver, y al ser filtrada la gran mayoría del material
fue retenido en la membrana, por lo que los constituyentes mostrados en los perfiles son,
apenas, aquellos que no fueron retenidos.
Observando las características físicas de la fracción residual; sólido quebradizo
de color rojo, se piensa que la muestra contiene una gran cantidad de taninos
condensados con alto grado de polimerización, los cuales no fueron analizados y,
posiblemente sean los responsables de la actividad antiproliferativa que exhibe dicha
fracción.
Con la información obtenida por HPLC-PAD como por MS se reveló que la
fracciones etanólica y residual contienen, mayormente, compuestos fenólicos, los cuales
se caracterizan por ser altamente hidroxilados; así surge otra respuesta a eventos
presentados en las pruebas de actividad biológica. Recapitulando, el extracto metanólico
de Acalypha californica posee la capacidad de reducir la sal de MTT, también se
comentó que metabolitos como los flavonoides con un hidroxilo libre en la posición 3
causan dicho efecto. Ahora, observando las estructuras identificadas para ambas
fracciones nos percatamos de que gran parte de ellas poseen la característica mencionada
y probablemente sean las responsables de reducir el MTT.
81
Figura 22. Metabolitos secundarios identificados en la fracción residual mediante
análisis de FIA-ESI-IT-MS/MS. A. Ácido quínico, B. Dímero
[epi]galocatequina, C. Quercetina, D. Quercitina-3-O-arabinósido, E.
Quercitina 3-O-ramnósido, F. Galoil-HHDP-glucopiranosa.
82
Figura 23. Espectro de masas de segundo orden del ión precursor de m/z 433
atribuido al compuesto quercitina-3-O- arabinósido. El ión producto de
m/z 301 es debido a la pérdida de la porción de arabinosa .El espectro fue
obtenido en modo negativo, con energía de colisión del 22%.
83
Relacionando las clases de metabolitos que se encuentran presentes en las
fracciones etanólica y residual con la actividad antiproliferativa del extracto resulta que,
ha sido reportado que compuestos fenólicos poseen propiedades antiinflamatorias,
inmunomoduladoras y antioxidantes. Este grupo ha sido postulado como el más
promisorio para ser utilizado en la quimioprevención. Existe evidencia de que estas
sustancias suprimen, retardan y revierten el proceso de carcinogénesis (Nichols y col.,
2010; Forambi y col., 2011; Kilami y col., 2011; Tan y col., 2011).
Entre los flavonoides, la quercitina es considerada un excelente antioxidante,
además ejerce un efecto pro-apoptótico directo en las células tumorales y puede
bloquear el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer de humano en diferentes
fases del ciclo celular. El efecto de la quercitina es selectivo, ya que exhibe una alta
toxicidad en las células de cáncer, en tanto, en las células normales, no transformadas,
muestra una casi total ausencia de daños (Gibiellini y col., 2011). Dicho compuesto se
encuentra presente en la fracción etanólica y residual.
Son encontradas un gran número de publicaciones que evidencian la propiedad
antiproliferativa de las proantocianidinas. Vaid y col. (2011) señalan que las
proantocianidinas presentes en las semillas de las uvas poseen efecto sobre la migración
celular en mielomas, el cual está asociado con la reducción de los niveles de COX-2 y la
expresión y producción de prostaglandinas. También, se reportan efectos de éstas en
cáncer colorrectal y de pulmón, donde actúan a través de la modulación de la expresión
de genes y por una rápida inducción de la apoptosis (Pan y col., 2010; Bobe y col., 2011;
Kresty y col., 2011).
Estudios han demostrado que el ácido gálico y sus derivados evitan la invasión
de las células de melanoma a través de la inhibición de la metaloproteinasa-2 y Ras.
Otras investigaciones muestran que este induce la muerte de las células de cáncer de
pulmón por el incremento de especies reactivas de oxígeno y por la depleción del
glutatión (Lo y col., 2011; You y col., 2011).
84
De esta forma se concluye que los metabolitos secundarios pertenecientes a los
grupos de los flavonoides, proantocianidinas y ácidos fenólicos pueden ser los
responsables de la actividad anticancerígena de las fracciones etanólica y residual.
Purificación y Caracterización de Compuestos de la Fracción Hexano-Acetato de
Etilo
Cromatografía de exclusión molecular para la fracción hexano-acetato de
etilo. Una vez que se realizaron los análisis de prospección preliminar, los cuales
permitieron generar una idea acerca de la composición química de la fracción hexano-
acetato de etilo, se efectuaron procedimientos para la purificación de los compuestos
presentes en ella, dando así la pauta para posteriores etapas de elucidación estructural.
La separación de la fracción hexano-acetato de etilo se realizó por cromatografía
de exclusión molecular, utilizando sephadex LH-20, el cual fue empaquetado con el
sistema de solventes n-hexano/cloroformo/metanol 2:2:1 v/v. Así, 3 g de la muestra
fueron aplicados y eluídos en un gradiente de polaridad creciente.
Fueron obtenidas 420 fracciones de aproximadamente 5 mL cada una, éstas se
colectaron en tubos de ensayo. Después de la reducción de la cantidad de solvente, todas
fueron analizadas por cromatografía en capa fina, usando como fase móvil mezclas de
hexano - acetato de etilo, y cloroformo-metanol. Se utilizó como revelador la solución
de anisaldehído sulfúrico.
Las fracciones que presentaron manchas con valores de Rf’s y coloraciones
semejantes fueron reunidas y secas, dando así un total de 39 grupos, todos con
características de polaridad muy distintas, debido al gradiente de elución utilizado.
Las fracciones eluidas con los sistemas menos polares mostraron masas
mayoritarias, esto debido a la naturaleza no polar de los solventes utilizados para el
fraccionamiento del extracto metanólico (en este caso hexano y acetato de etilo).
También fueron eluidas sustancias de naturaleza polar, posiblemente arrastradas del
85
extracto metanólico por los lavados con acetato de etilo; sin embargo, su masa fue
despreciable lo cual imposibilitó continuar con la purificación de las mismas.
Los primeros 10 grupos obtenidos mostraron matrices complejas de sustancias y
rindieron masas importantes, razón por la cual se comenzó a trabajar con dichos grupos.
Cromatografía líquida de media resolución de la fracción G5. El grupo G5
proveniente de la columna de sephadex de la fracción de hexano-acetato de etilo rindió
una masa de 0.753 g. Esta fracción contenía una gran cantidad de sustancias en su
matriz, características que permitieron seguir la purificación de los compuestos presentes
en ella.
Debido a la naturaleza no polar de la fracción no fue viable trabajar con HPLC,
ya que el equipo utiliza columnas de fase reversa y solventes como agua, metanol y
acetonitrilo, que no son apropiados para el análisis de esta tipo de muestras; sin embargo
se pudo trabajar con cromatografía líquida de media presión (MPLC) con la cual se
realizan separaciones en fase normal.
Se obtuvieron 120 fracciones de aproximadamente 5 mL cada una; de las cuales
se generaron 27 grupos de fracciones según el perfil en cromatografía en capa fina
después del revelado con anisaldehído.
De las 120 fracciones de la 8-13 y de la 41-43 precipitaron en forma de cristales
color blanco en forma de agujas finas. Sin embargo, estos se encontraban inmersos en
una gran cantidad de sustancias que constituían la misma fracción, como es posible
observar en las cromatoplacas presentadas en la figura 24, A y B.
Con la finalidad de recuperar dichos cristales se adicionó metanol frío para
aumentar la polaridad y promover la cristalización; el sobrenadante fue retirado y los
cristales fueron de nuevo lavados con metanol frío; este proceso se repitió hasta que los
cristales se encontraban aparentemente libres de impurezas.
86
A. B.
C. D.
Figura 24. Purificación de cristales. En A y B se muestra el perfil de manchas de
cromatografía en capa fina de las fracciones que precipitaron cristales, en C y
D se muestran las manchas generadas por los cristales purificados. A.
Fracciones 8-13 eluidas con hexano/acetato de etilo 75:25 v/v. B. Fracciones
41-43, eluidas con cloroformo/metanol 98:2 v/v. C. Perfil cromatográfico de
los cristales de las fracciones 8-13, elución con hexano/acetato de etilo 75:25
v/v. D. Perfil cromatográfico de los cristales de las fracciones 41-43, elución
con cloroformo/metanol 98:2.
87
Los cristales fueron disueltos en hexano y su purificación se monitorizó por
cromatografía en capa fina. Como se observa en la figura 24, C y D, se generó solo una
mancha violeta muy intensa con Rf’s similares en todas las muestras, lo cual indica que
son pertenecientes a una misma sustancia.
Comparando las manchas generadas por los cristales purificados con las manchas
de las fracciones que les dieron origen (figura 24) se observó que los cristales eran
responsables de la mancha más prominente en las cromatoplacas. De acuerdo a la
literatura, las características de los cristales obtenidos bajo las condiciones de estudio, y
la apariencia de las manchas generadas en cromatografía en capa fina, son un fuerte
indicativo de sustancias esteroidales (Fierro y col.,2004; Salas y col., 2009).
Coincidiendo con los análisis preliminares, se encontraron esteroides/triterpenos
en la fracción de hexano-acetato de etilo. Así, para corroborar lo anterior, las muestras
de cristales fueron identificadas por métodos de elucidación estructural.
Resonancia magnética nuclear. Con la finalidad de obtener cantidad suficiente
de cristales para los análisis de resonancia magnética nuclear se reunieron los
precipitados de las fracciones 8-13 en un grupo llamado AC1, en tanto que los cristales
de las fracciones 41-43 formaron el grupo AC2. Ambos agrupamientos fueron diluidos
en cloroformo deuterado y analizados por 1H-RMN, para su posible identificación.
En la figura 25 se muestran los espectros de 1H-RMN para AC1; en tanto el
espectro para AC2 se muestra en la figura 26. Nótese que tanto AC1 como AC2
generaron espectros con desplazamientos similares.
Por lo tanto, esto confirmó los hallazgos de la cromatografía en capa fina de los
cristales, ya que AC1 y AC2 presentaban el mismo valor de Rf y coloración semejante
de las manchas reveladas. Las sustancias identificadas fueron -sitosterol y
estigmasterol. Se describirá solo el espectro de AC1.
88
Figura 25. Espectro de 1H- RMN de la fracción AC1. Mediante la interpretación de las señales se identificó como una
mezcla de -sitosterol y estigmasterol (Condiciones: 500 MHz, CDCl3).
89
Figura 26. Espectro de 1H- RMN de la fracción AC2. Mediante la interpretación de las señales se identificó como una
mezcla de -sitosterol y estigmasterol (Condiciones: 500 MHz, CDCl3).
90
En el espectro de 1H-RMN de AC1 (figura 25) se observa un perfil característico
para compuestos esteroidales, Las señales en 4.95 y 5.1 (integrando cada una para
1H) son características de los protones vinílicos sobre C-22 y C-23 del estigmasterol; en
la ampliación de esta zona es posible conocer la ubicación espacial de H-22 y H-23 por
las constantes de acoplamiento de ambos, dobletes de dobletes, con un valor
característico de 15 Hz el cual es un intervalo para hidrógenos en posición trans. Otra
señal característica es la de 5.29, que integra para 1H, que genera un doblete y es
correspondiente al H oleofínico en la posición 6 del núcleo esteroidal, En 3.5 (1H) se
observa un multiplete dado por un H sobre un carbono unido a un oxígeno, característico
de un hidroxilo en la posición 3 del anillo esteroidal, y de acuerdo a las constantes de
acoplamiento permiten ubicar el grupo OH en posición axial.
El resto de los H se ubican en un campo más alto (entre 0.62 y 3) la cual es una
zona característica de H de grupos metilenos y metilos, con señales muy intensas.
Dentro de esta zona, específicamente entre 1.4 y 2.4, se encuentran presentes los
hidrógenos alfa a dobles enlaces, en este caso, H-4, H-7 y H-20 (Salas y col., 2009;
Viera, 2010).
Ensayos de cromatografía en capa fina para AC1 y AC2. Una vez que se
caracterizaron las sustancias que se encuentran presentes en las fracciones AC1 y AC2,
se llevaron a cabo ensayos de cromatografía en capa fina haciendo uso de patrones de -
sitosterol y estigmasterol, esto con la finalidad de observar si las muestras exhiben el
mismo perfil de manchas que los patrones y de esta forma dar otro soporte a la
identificación de las sustancias de las muestras.
Como se observa en la figura 27, el Rf de las muestras coincidió con el de los
patrones, además el color y forma de las manchas, generadas por el revelado con
anisaldehído, fueron similares, por lo que se puede concluir que, precisamente, las
sustancias encontradas en las fracciones AC1 y AC2 son -sitosterol y estigmasterol.
91
Figura 27. Características en CCF de las fracciones AC1 y AC2 y patrones de -
sitosterol y estigmasterol. En la primera línea se colocó el patrón de -
sitosterol, en la segunda el de estigmasterol, en tanto AC1 y AC2 se muestran
en las líneas 3 y 4. La elución fue llevada a cabo con hexano/acetato de etilo
75:25 v/v.
92
En un principio, se consideró realizar solo los estudios fitoquímicos para la
fracción residual esto debido a la selectividad que ésta presenta hacia las células
cancerosas, propiedad que no fue mostrada por la fracción hexano-acetato de etilo ya
que daña igualmente a las células de la línea L-929. Sin embargo, no implica que esta
última no sea una buena candidata para la generación de compuestos activos. Las células
L929 (control) han sido inmortalizadas, lo que significa que aunque no provienen de
cáncer, no son células normales, sino que su maquinaria celular ha sido alterada, esto
podría explicar los efectos de las fracciones mencionadas. Para establecer
comparaciones lo óptimo sería trabajar con la línea cancerosa y su contraparte no
cancerosa.
Mediante técnicas cromatográficas fue posible aislar de la fracción de hexano-
acetato y, posteriormente por 1H-RMN, identificar una mezcla de los esteroides -
sitosterol y estigmasterol. Las características de los cristales, así el espectro de 1H-RMN
fue comparado con los de la literatura (Fierro y col., 2004; Salas y col., 2009).
Numerosos estudios experimentales han demostrado los efectos antiproliferativos
del -sitosterol y estigmasterol sobre los cánceres de colon, de mama, próstata,
estómago y pulmón. Así también, se ha estudiado el efecto de reducción de la metástasis
que presentan estas sustancias. Los mecanismos de acción por lo que se logra la
mencionada actividad antitumoral han sido elucidados, estas sustancias pueden
modificar las membranas de las células tumorales, pueden activar el ciclo de la
esfingomielina, activar las caspasas, suprimir la expresión de bcl-2 e incrementar la
expresión de bax (Awad y col., 2000; Imanaka y col., 2008; Rubis y col., 2008; Choon y
col., 2009; Younghuan y col., 2009).
Lo anterior es una evidencia muy fuerte de que probablemente la actividad
antiproliferativa mostrada por la fracción de hexano-acetato de etilo sea debida a la
presencia de dichas sustancias.
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