resultados de purificación de proteínas (ldh)

Resultados de purificación de Proteínas (LDH)

a) Curva estándarb) Interpolar valor de peso molecular LDHc) Geles de poliacrilamida de cada equipod) Identificar la banda de interés en el gel de su equipo

Septiembre, 2010

Instrucciones

Hacer curva de calibración con los estándares de peso molecular que se proporcionan en la siguiente transparencia,

Calcular los Rfs,

Rf =distancia recorrida de la proteína de interés

distancia total recorrida por el colorante

Realizar el gráfico del log del peso molecular vs Rf

Proteínas KDa

Miosina 250

Fosforilasa B

148

BSA 98

Glutámico DH

64

Alcohol DH

50

Anhidrasa carbónica

36

Mioglobina 22

Lisozima 16

Aprotinina 6

Cadena B de insulina

4

PESOS MOLECULARES ESTÁNDAR

Estás proteínas se salen del gel, ya que migran más rápido que el colorante que el azul de bromofenol, colorante que usamos de indicador de la corrida de las proteínas

Curva std de proteínas1. Para encontrar en

donde está la banda de interés se hace una curva estándar.

2. interpolar el log del peso molecular y conocer en que posición o Rf debe estar la proteína

Equipo 1 Equipo 2

Equipo 3 Equipo 4

Equipos 1 a 4Recuerden la banda anaranjadita es la fosforilasa B

36

36

36

36

Equipo 5

FosforilasaBSAGlutDHAlcohol DHAnhidrasa Carbon

No se logra observar la primera banda de alto peso molecular pero les puse las que yo puedo distinguir, son suficientes para producir la gráfica de calibración

Les coloque los estándares que pude detectar.

Equipo 7

MiosinaFosforilasa

BSAGlutDH

Alcohol DHAnhidrasa Carbonica

Excelente gel del equipo 6. El gel que corrieron hoyComentarios Le falto correrse

pero quedo precioso, supongo que las fracciones menos puras son las que tienen bandas de peso molecular más alto.

¿Qué resina usaron para la purificación? Fue intecambio iónico?

Std FPA FPB F4 F3 F2 F1 F0

75

25

Mi gel

COMENTARIOS: Yo use otros estándares

de peso molecular Como ven al pasar de

la F2 a la 3 se pierden proteínas de alto peso molecular

Y al pasar al intercambio iónico perdemos una banda gorda arriba de 37,

Mientras que en afinidad se purifica una banda preferencial a los 37 kDa de peso molecular

Stds usados en el gel del equipo 6 y el mío

Reporte

Recuerden que la entrega del reporte será hasta pasando el puente del 15 y 16 de septiembre.

Y llevará en los resultados:A) La concentración de proteína en cada una de las

fracciones obtenidas de la purificación, B) El gel de las fracciones (pueden usar otro gel para

comparar lo que ustedes obtuvieron con lo que se debería de ver),

C) La curva patrón del estándar del gel con la predicción de la localización de la proteína y

D) la actividad total de cada fracción o de las que alcancemos a medir