recursos genéticos en el perú y patrimonio genético

FORO: “ DEFENSA DEL PATRIMONIO CULTURAL Y PATRIMONIO

GENÈTICO DEL PERÙ”

RECURSOS GENÈTICOS DESARROLLADOS EN

EL PERÙ Y SU CARACTERIZACIÒN PARA SER

CONSIDERADOS PATRIMONIO GENÈTICO

EXPOSITOR : NICOLAS A. ROMÁN CABELLO

ENTER THE NEW WORLD !!

SON LA BASE FUNDAMENTAL PARA EL DESARROLLO DENUEVAS RECOMBINACIONES DEL MATERIAL GENÈTICO;VARIEDADES, HÌBRIDOS Y SUS MUCHAS APLICACIONES:MEDICINA, AGRICULTURA, INDUSTRIAS DE ALIMENTOSBIORREMEDIACIÒN CONTROL DE PLAGAS Y ENFERMEDADESDE TODO TIPO.

TALLER LINEA DE BASE (22 Y 23/102013. MINISTERIO DEL AMBIENTE

PRIORIDAD CULTIVO N. CIENTÌFICO GRUPOS P

1 PAPA Solanum sp 4

2 MAIZ Zea mays 4

3 ALGODÒN Gossipium sp 3

4 PAPAYA Carica papaya 3

5 AJIES Capsicum sp 3

6 FREJOL Phaseolus vulgaris 3

7 CACAO Theobroma cacao 2

8 QUINUA Chenopodium quinoa 2

9 TOMATE Solanum lycopersicum 2

10 CALABAZA Cucurbita sp 2

.Azotobacter- Alu I

Coefficient0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

E.coli

21112

21151

24114

24113

22215

21152

24115

24133

21123

21243

E.coli

. CEREALES: Trigo, cebada, avena, centeno,

triticale, maíz (amiláceo, duro)

. GRANOS: quinua, cañihua, kihuicha

. LEGUMINOSAS: Frejol, haba, soya, arveja

. RAICES Y TUBEROSAS: papa, oca, mashua, olluco,

arracacha, chicuro, yacòn

. PASTOS Y FORRAJES: Costa sierra y selva

. MICROORGANISMOS: Azospirillum, Azotobacter,

Pseudomonas, Rhizobium.

.

ES UN CONJUNTO DE METODOS Y TECNICAS OPERACIONES Y PROCEDIMIENTOS DESTINADOS AL AISLAMIENTO, CLONAJE CARACTERIZACION, MODIFICACION, Y EXPRESION DEL MATERIAL GENETICO (DNA)

ES UN AMPLIO RECETARIO QUE INCORPORA PROCEDIMIENTOS MUY DIVERSOS Y EN CONSTANTE ACTUALIZACION.

SUS LIMITES SE VEN MODIFICADOS DIA A DIA LO QUE HACE MUY DIFICIL LA PRESENTACION

ACTUAL Y COMPLETA QUE INCLUYE:

* Electroforesis en geles y capilar

* Electroforesis de geles en gradientes

denaturantes (DGGE)

* DNA complementario (DNAc)

* Banco genómico y banco de genes.

* Mapeo de genes: mapas físicos, de

genes.

* Hibridación “in situ” fluorescente (FISH)

* Transgénesis

BANCO DE GENES ENZIMAS DE RESTRICCION

Secuenciación del DNA y de genomas

Enzimología del DNA

Enzimas de restricción

Vectores de clonación: Plásmidos, BACs, YACs,

Charon, Virus, Lanzaderas etc.

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

Espectrofotometría UV

Microarrays (“chips” de DNA)

MARCADORES MOLECULARES DE DNA

El DNA unido a una matriz proteica forma el cromosoma en los eucariotas y en las bacterias (procariotas) se presenta “desnudo”

La información para construir proteínas está contenida en la secuencia de bases del DNA

y es traducida a partir de un código de señales.

Son segmentos o fragmentos de DNA obtenidos o identificados por cualquier procedimiento y que corresponden a regiones expresadas o no del genoma de un individuo.

Generalmente son fragmentos de zonas no expresadas del genoma o sea cualquier fragmento o segmento o “pedazo” de DNA

Incluso hasta de dos simples nucleótidos (SSR)

Si el fragmento de DNA incluye a una zona expresiva del genoma se le denomina “marcador genético” o “marcador de expresión”

El DNA es una molécula gigantesca y de

una increíble longitud.

El DNA de una sola bacteria mide

alrededor de un metro!!! (una bacteria

mide 1 micra )

El DNA de un cerebro humano, o de una

planta de maíz extraído y puesto en

línea

tiene una longitud de…

…CIENTO CINCUENTA MILLONES DE KILOMETROS MULTIPLICADO X 15!!!!

O SEA QUE ESTE DNA PODRIA IR Y VOLVER DE

LA TIERRA AL SOL UNAS…150 VECES!!!

Si utilizamos un enzima de restricción y cortamos el DNA de un individuo en 20,000 o 30,000 fragmentos de diferente longitud, tamaño o peso (fragmentos de restricción)…

Entonces tendríamos unas 20,000 o 30,000

“huellas digitales” moleculares o “finger

printings”…

Cualquiera de esos fragmentos puede servir para identificar a un individuo (sea humano, planta o microorganismo) aunque no se sepa su secuencia de bases

En la actualidad se utiliza esta tecnología llamada de “marcadores moleculares” para identificar, caracterizar individuos de todo tipo incluyendo virus con un margen de seguridad de… 99,99999%

Los marcadores moleculares son en la actualidad una tecnología fundamental e indispensable para:

Determinación de las relaciones filogenéticas y taxonómicas entre individuos

La estimación de la semejanza genética

Análisis de la diversidad genética

Identificación de genes

Organización del germoplasma

Caracterización de cepas de microorganismos

Múltiples aplicaciones en la medicina, industria alimentaria, terapia génica, transgénicos, medio ambiente, genética, bioingeniería etc.

Técnicas basadas en sondas radioactivas (RFLPs)

Técnicas basadas en la PCR (RAPiDs)

Mixtos

Microarrays

QTLs

RFLPs: Polimorfismo en la longitud de Fragmentos de Restricción

RAPDs: DNA Polimórfico Amplificado al Azar

SSRs: Secuencia Simple Repetida (microsatélites)

VNTRs: Número Variable de Secuencias Repetidas en Tándem (Minisatélites)

AFLPs: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados

Otras Técnicas: SNPs, STS, FLAPs, GRAPs etc.

A la fecha se reportan alrededor de unas 40 técnicas que combinan uno o varios procedimientos y la tendencia es mejorar la discriminación del polimorfismo, la repetitibilidad, la Codominancia, la automatización, simplicidad y el costo.

• Caracterizar (identificar) molecularmente individuos y/o colecciones de individuos (plantas, animales, microorganismos etc

• Identificar secuencias de DNA en el genoma de los individuos que permitan su diferenciación y su utilidad potencial.

• Almacenar información en banco de datos a nivel local, regional y nacional para su uso y para su identidad como propiedad de uso.

EXTRACCION DE DNA

DIGESTION

PCR

DGGE

VISUALIZACION EN UV

ANALISIS DE BANDAS (NTSYS/ UPGMA)

EVALUACION Y RESULTADOS

1. EXTRACCION DE DNA

Eliminación de la matriz proteica, RNAs y componentes celulares; paredes, membranas celulares órganos etc.

Se utilizan sustancias que atacan a las proteínas y las precipitan y procesos físicos como la homogenización y centrifugación

Identificación molecular

___________________________________

AISLAMIENTO DE

DNA

Figura 4.4: DNA genómico de cepas Azospirillum sp, Azotobacter sp. y Pseudomonas sp. visto enelectroforesis en gel de agarosa al 1%, (M) Marcador de peso molecular Lambda DNA/Hind III, (1) 11225,(2) 23134, (3) 14242 (4)32155 , (5) 34235.(6) E coli

LOS ENZIMAS DE RESTRICCION CORTAN AL DNA EN SITIOS ESPECÍFICOS Y ORIGINAN MILES DE FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAÑOS Y PESOS

ESTOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION PUEDEN SER SEPARADOS DE ACUERDO A SU PESO Y TAMAÑO.

SE UTILIZAN COMO MARCADORES O HUELLAS DACTILARES (“fingerprintings”) PARA IDENTIFICAR INDIVIDUOS

La PCR es una técnica poderosa que permite multiplicar, clonar fragmentos de DNA: de un solo fragmento se pueden obtener hasta 30 000 000 fragmentos en un tiempo determinado

Para clonar el DNA se necesita:Desnaturalizar al DNA (el DNA se abre en dos

hebras)) a una temperatura de 92-94 ºC

• Un iniciador o primer, (un pequeño fragmento de DNA) que permite la actividad del enzima Taq polimerasa y se “pega” a una de las hebras del DNA a una temperatura de 40 -57 ºC.

• Taq polimerasa: Enzima que es capáz de sacar “copias” del una hebra del DNA y actúa a 72 ºC

Cada ciclo comprende tres pasos:

Desnaturalización: (92-94 ºC)

Alineación/Hibridación ( 47-56 ºC)

Extensión (72ºC)

Estas tres temperaturas son conjugadas en un termociclador.

También se necesita:

ClMg 2 mM

DNTP (oligonucleótidos)

Solución buffer 10X

Estos elementos forman el “máster mix” que se mezclan en un tubo Eppendorf y se disponen en el termociclador

PERKINS ELMER 2400

MEZCLA DE REACCION

Reactivos Volumen c.c. final

H2O 11,3

Buffer 10x 2,6 1X

DNTP 1 mM 5,2 0,2 Mm

PRIMER 10uM 1,3 0,5 Mm

MgCl2 23 mM 1,6 1,5 ng

DNA 1,0 30 ng

Taq DNA pol 0,36 uL

Nº PASOS Tº (º C) T (min) nº CICLO1 94 1.0 12 37 1.0 13 72 1.0 14 94 0.5 405 37 1.0 30 6 72 1.5 307 72 5,0 1

4. ELECTROFORESIS en geles de gradiente denaturalizante (DGGE)

El DNA amplificado vía PCR incluido en un soporte (gel de poliacrilamida) es sometido a un campo eléctrico en una cámara i en la cubeta DGGE que incluye un sistema para producir gradientes lineales denaturantes de temperatura (Tm).

El DNA corre hacia el polo positivo a través del gel en este ambiente denaturante diferencial debido a que posee una carga neta total negativa .

Los fragmentos pequeños corren mas de prisa y quedan en la parte inferior del gel.

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR

___________________________________

AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN 9-27-1542 DE LA

ZONA 16S rDNA

Figura 4.5 Productos de PCR de la región 9-27-1542 M Marcador 100bp DNA ladder

plus (cada banda representa 100pb) 1) Ecoli , carril 3,6,9,10,11,13,15,16,18

resultado de Pseudomona fluoresces (60ng/µL) carril 4,5,7,8,12,14,17 resultado de

Azotobacter (40ng/µL).

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR___________________________________

RFLP – RNA ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE

RESTRICCIÓN DE LA REGIÓN 9-27 – 1542 DE

BACTERIAS Azotobacter sp

Figura 4.6: Resultados de los cortes con las enzimas de restricción Alu I, Hpa

II y Rsa de los amplificados de Azotobacter.

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR

___________________________________

RFLP – rDNA ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE

RESTRICCIÓN DE LA REGIÓN 9-27 – 1542 DE

BACTERIAS Azospirillum sp.

Figura 4.6 . Resultados de los cortes con las enzimas de restricción Alu I, Hpa II y

Rsa de los amplificados de Azospirillum

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR

___________________________________

RFLP – RDNA ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE

RESTRICCIÓN DE LA REGIÓN 9-27 – 1542 DE

BACTERIAS Pseudomonas fluorescens .

Figura 4.6 . . Resultados de los cortes con las enzimas de restricción Alu I, Hpa II y

Rsa de los amplificados de Pseudomona fluorescens (resultado negativo).

GENE BANK

BLAST

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

ANALISIS BIOINFORMÁTICO ________________________

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

___________________________________

_________________________________Agrupamiento UPGMA de las cepas de Azospirillum realizado con

los cortes de la enzima de restricción Alu I, Hpa II,

Azospirillum - Alu I

Coefficient

0.35 0.49 0.63 0.78 0.92

11242

11242

12141

11232

14211

12121

12145

13245

11241

Azospirillum-Hpa ll

Coefficient

0.29 0.39 0.49 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00

E.coli

11242

12141

12121

12145

13245

11241

11232

E.coli

14211

__________

Agrupamiento UPGMA de las cepas de Azotobacter realizado con Alu I y Hpa II s

cortes de la enzima de restricción Alu I, Hpa II, Rsa IAzotobacter- Alu I

Coefficient0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

E.coli

21112

21151

24114

24113

22215

21152

24115

24133

21123

21243

E.coli

Azotobacter- Hpa II

Coefficient

0.5 0.6 0.7 0.7 0.8 0.9 0.9 1.0

E.coli

21112

21151

24114

24113

22215

21152

24115

24133

21123

21243

E.coli

Azotobacter - Rsa I

Coefficient

0.2 0.3 0.4 0.5 0.7 0.8 0.9 1.0

21112

21112

24113

24114

21151

24115

21123

21243

22215

21152

Ecoli

24133

. Determinar políticas y estrategias, acciones para la colección, caracterización y evaluación de los R.G. para promover su uso respetando el derecho de pueblos y naciones involucrados.

. Unificar Instituciones y tecnologías para el manejo, utilización y conservación de los R.G. Compartir información.

. Desarrollar Proyectos Integrales de gestión, colección, caracterización (morfológica, bioquímica, molecular) y conservación.

.Desarrollar proyectos de transferencia tecnológica.

Fuga y apropiación ilìcita de genes y/o material genético

18 casos relacionados con maca, Sachainti (2)

Yacòn, camu camu y pasuchaca.

Hay muchos otros casos reportados de fuga de genes: Quinua, oca, mashua, olluco, arracacha, sachatomate, aguaymanto etc

En el caso de maca una empresa patentó un extracto (2012) y desarrolló productos que le reportaron $ 200,000 mensuales, y en un año 2,4 millones de dólares y en 10 años 20 millones de dólares, los cuales no fueron redituados al Perú (Andina. Agencia Peruana de

Noticias)

1. capacitación continua y permanente de recursos humanos.

2. Equipamiento.

3. Medios de integración

4. Investigación compartida en autopistas informáticas veloces.

5. Estandarizaciòn de métodos y técnicas.

.

ENTER THE NEW WORLD!!

IR HACIA ADELANTE Y HACER MEJOR LA

MISMAS COSAS…O IR HACIA ARRIBA Y

HACER COSAS NUEVAS