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Introducción a la enzimología

• Definiciones importantes• Parámetros que afectan la actividad enzimática

• Cinética enzimática• Inhibición de la actividad enzimática

• Enzimas inmovilizadas

Enzima

Catalizador biológico de naturaleza proteica.

E + S ⇄ ES ⇄ EP ⇄ E + P

Energía de activación

Estructura química de las proteínas

• Estructura primaria.

• Estructura secundaria.

• Estructura terciaría.

• Estructura cuaternaria.

Sitio activo

Grupo prostético

Sustancia orgánica, dializable, termoestable que se une firmemente a al porción proteica

de la enzima

Coenzima

Sustancia orgánica no proteica, dializable, termoestable que se une a la porción

proteica de la enzima con enlaces débiles.

COFACTOR

• Iónes metálicos de bajo peso molecular:

K, Fe, Cu, Co, Zn. Mn, Mg, Ca y Mo

ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS

1) Especificidad absoluta: la enzima solo puede catalizar una reacción.

2) Especificidad a grupo funcional: la enzima solo puede actuar en moléculas que presentan un grupo funcional específico.

3) Especificidad por tipo de enlace: la enzima solo puede actuar en un tipo de enlace sin importar la estructura del resto de la molécula.

4) Especificidad estereoquímica: la enzima solo puede actuar en un isómero óptico o estérico en particular

IMPACTO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA Y DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES EN EL METABOLISMO

MICROBIANO

FisiologíaCelular

NUTRIENTES:

Carbono

Nitrógeno

Fósforo

Azufre

Metales traza

Oxigeno

Dióxido de carbono

PRODUCTOS:

EnzimasAntibióticos

Hormonas

Lípidos

CONTROL GENÉTICO

CONDICIONES DE CRECIMIENTO:

pH

Temperatura

Luz

Oxigeno disuelto

Presión osmótica

Concentración de sustrato

E

E

E

E

E

S

SS

S S

SS

SS

Condiciones requeridas para que una reacción enzimática se

desarrolle.• Que exista una concentración

catalítica de E y S.

• Que se tengan los cofactores requeridos.

• Que se tengan las condiciones de pH, temperatura, etc. adecuadas para la enzima estudiada.

• Que no existan inhibidores en el sistema.

Factores que afectan la actividad enzimática.

• Temperatura• pH• Fuerza iónica• Tipo de buffer• Concentración de sustrato

Heterogenidad en el reporte de la actividad enzimática

• Una unidad de actividad es la cantidad de enzima que bajo condiciones estándar (40°C, pH=4.7 y 30 minutos) forma en un minuto el hidrolizado con el equivalente en absorbancia, leida a 275 nm, de una solución de tirosína en ácido clorhídrico 0.006N. Este valor de absorbancia es de 0.0084

Heterogenidad en el reporte de la actividad enzimática

• Una unidad de actividad enzimática es la cantidad de enzima que bajo condiciones estandar (37°C y pH=5.7) libera 5.26 miligramos de almidón por hora.

Actividad Volumétrica

• Unidades de actividad enzimática presentes en un volumen definido de:– Una preparación enzimática comercial– Un extracto de un tejido animal o vegetal– Un filtrado obtenido de un proceso

fermentativo

Unidad internacional de actividad enzimática (U).

Cantidad de enzima requerida para liberar un µmol de producto por minuto bajo las condiciones de ensayo.

Actividad específica

• Unidades de actividad enzimática por mg de proteina, presente en:– Una preparación enzimática comercial– Un extracto de un tejido animal o vegetal– Un filtrado obtenido de un proceso

fermentativo

Significado de la actividad específica.

• Porción de la proteína total existente en la preparación enzimática con la actividad deseada.

Proteína total Actividad

enzimática deseada

Criterios para la compra de preparaciones enzimáticas.

• Las enzimas se deben comprar tomando como criterio la actividad enzimática presente en la preparación.

• La actividad de la enzima se puede medir como:– Actividad volumétrica (U/ml)– Actividad específica (U/mg de proteína)

Cinética enzimática

• Estudio del impacto de los factores ensayados (pH, temperatura, fuerza iónica, etc) sobre la velocidad de reacción.

Curva de progreso de una reacción enzimática.

Tiempo

Pro

duct

o

Pendiente=Velocidad inicial (Vo)

Efecto de la concentración de sustrato.

Efecto de la temperatura

Temperatura

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a

• El primer evento que se da es un incremento de la entrópia del sistema que favorece la formación de ES

• El segundo evento es un proceso de desnaturalización térmica de la proteína.

Efecto del pH sobre la actividad enzimática

• Primer evento, arreglo de la estructura proteíca que favorece la integración del sitio activo.

• Segundo evento, proceso de desnaturalización de la proteína.

pH

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a

La molécula de agua.

O

H H

::-

++

Menos electronegatívo

Mas electronegatívo

Asociación de las moléculas de agua

-

O H+

++

+ O

H

H

H

///////

-

Puente de hidrógeno

Hidratación de iones.

- +

Efecto de la fuerza iónica

++

+ ++- -

-

Fuerza iónica

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a

La presencia de sales favorece la solvatación de las proteínas y en consecuencia su solubilidad. (salting in)

Los iones en exceso compiten por las moléculas de agua asociadas a la proteína y esta se desolvata. (salting out)

Michaelis-Menten

S1

S2S3

S4

S5

Tiempo

Con

c. P

rodu

c to

Vo

Conc. sustrato

Km

Vmax

1/2 Vmax

Familia de curvas de progreso para una enzima dada a diferentes concentraciones de sustrato

Lineweaver-Burk

Principal limitación de la cinética de Michaelis

• Fué desarrollada para sistemas en donde participa una sola enzima u un solo sustrato, ambos solubles en agua.

En la industría de alimentos se manejan materiales que son complejos, algunos son

sólidos y otros insolubles en agua.

Inhibición competitiva

REPRESENTACIÓN GRAFICA DE INHIBICIÓN COMPETITIVA

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA TIPOS DE INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

Mérida, Yuc, 2008

Inhibición no competitiva.

Inhibición competitiva y no competitiva

Inhibición Acompetitiva

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA

Mérida, Yuc, 2008

TIPOS DE INHIBICIÓN ENZIMÁTICA

INHIBICIÓN MIXTA

Inhibición mixta

Inhibición irreversible

TABLA DE DIFERENCIACIÓN DE TIPOS DE INHIBICIONES .

Enzimas inmovilizadas

• Enzima fija a un soporte sólido.Perlas de cristalPerlas de alginato

Enzima confinada en un espacio definido.Reactores de

membrana de ultrafiltración

Enzima fija en un soporte soluble.

Polietilenglicol

Métodos para la inmovilización de enzimas.

Inmovilización de enzimas

AtrapamientoEnlace

Atrapado en Gel

Atrapado en fibras

Microencapsulado

Enlace al soporte Entrecruzamiento

Adsorción física

Enlace iónico

Quelación o enlace con metal

Enlace covalente

REACCIONES QUÍMICAS Y BIOQUÍMICAS DE LOS ALIMENTOS

Obscurecimiento no enzimático Reacción de Millard

Obscurecimiento enzimático Acción de polifenol oxidasas

Hidrólisis de lípidos Ácida

Acción de lipasas

Oxidación de lípidos Acción de lipooxidasas

Desnaturalización de proteínas Condiciones de procesamiento

Hidrólisis de oligo y polisacaridos Acción de amilasas

Acción de pectinasas

Hidrólisis de proteínas Acción de proteasas

ALGUNAS ENZIMAS IMPORTANTES EN LOS ALIMENTOS

CARBOHIDRASAS PROTEASAS ESTERASAS

Amilasas Renina Lipasas

Celulasas Pepsina Fosfatasas

Pectinasas Tripsina

Maltasa Papaina

Lactasa

Invertasa