proteinas de membrana externa de la familia omp25/omp31 de brucella ovis y otros factores de...
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PROTEINAS DE MEMBRANA EXTERNA DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 DE Brucella ovis
Y OTROS FACTORES DE VIRULENCIA EN Brucella spp.
Paola Andrea Caro-Hernández PhD.
Brucella melitensis
Brucella suis
Brucella abortus
Brucella canis
Brucella ovis Brucella neotomae
Brucella ceti
Brucella pinnipedialis
Brucella microti
GÉNERO Brucella spp.
Brucella inopinata
Herida de implante mamario
LA LA ENVOLTURAENVOLTURA CELULAR DE CELULAR DE BrucellaBrucella spp. spp.
PME
Extraido de: Int J Microbiol. Haag AF., et al (2010)
OMPs
Profundizar en el estudio de las proteínas homólogas de la familia Omp25/Omp31 para establecer el papel que juegan en la virulencia de Brucella ovis y su potencial como antígenos protectores o de diagnóstico.
OBJETIVOOBJETIVO
B. ovisB. ovis Cepa virulenta que no presenta
cadenas O Las OMPs podrían tener mayor
relevancia en el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Extraido de: Salhi et al. (2003)
PRESENCIA DE LAS OMPS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN EL GÉNERO Brucella
omp31omp31 omp31bomp31b omp25omp25 omp25bomp25b omp25omp25cc
omp25domp25d omp22omp22
B. melitensisB. melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B. abortusB. abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B. suisB. suis ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++B. neotomaeB. neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++B. ovisB. ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B. canisB. canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B. B. pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B. cetaceaeB. cetaceae(mayoría de cepas)(mayoría de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B. cetaceaeB. cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ -?-?
Microbes and Infection 6: 821–834 Vizcaíno N., et al 2004
FRAGMENTO DE ADN DE 15.1 Kb AUSENTE EN B. ovis
Extraído de: Microbes and Infection 6: 821–834 Vizcaíno N., et al 2004
Obtención de cepas mutantes y complementadas en B. ovis PA
Obtención de anticuerpos policlonales en conejo Detección inmunológica mediante Western blot
∆omp22
Cepas kanr, sacs y ampr
RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DOBLERECOMBINACIÓN HOMOLOGA DOBLE
DenominaciónDenominación Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31, kanomp31, kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25:: :: kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c, kanomp25c, kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d, kanomp25d, kanrr
∆∆omp22omp22 omp22, kanomp22, kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma de Cromosoma de B. ovisB. ovis PA PA
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
2 1
kan r
CEPAS MUTANTES TRANSFORMADAS CON EL GEN SILVESTRE
DenominaciónDenominación
∆∆omp31-omp31-ComCom
∆∆omp25-omp25-ComCom
∆∆omp25c-omp25c-ComCom
∆∆omp25d-omp25d-ComCom
∆∆omp22-omp22-ComCom
C/u de los gen silvestre omp25/omp31B. ovis clonados en el vector
pBBR1MCS-4pBBR1MCS-4
amp r
omp25/omp31
LacZ
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
pNV31b-compNV31b-com
omp31b
amp r
pNV 998-10pNV 998-10
kan r
omp25b
Gen omp31b B. abortus clonado en pBBRMCS-4
Fragmento de ADN de 15kb B. melitensisclonado en pBBRMCS-2
PA omp31b-Com PA 998-10(Vizcaíno et al., 2004)
B. ovis PA COMPLEMENTADA CON omp31b y omp25b
(Caro-Hernández P., et al 2007)
Expresión de las OMPs DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 en E. coli
OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES FRENTE A LAS OMPS
DE LA FAMILIA Omp25/Omp31
INÓCULOcélulas
suspensión D. O. = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ª inoculación 2ª inoculación 3ª inoculación
Obtención de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Punción cardiaca
Intradérmica Subcutánea Subcutánea
IPTGE. coli
Adsorción de sueros
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B. ovis PAB. ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- ++B. ovis PA 25b B. ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B. ovis PA 31b B. ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
WESTERN BLOT
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
PAPEL DE LA FAMILIA PAPEL DE LA FAMILIA Omp25/Omp31Omp25/Omp31 EN LA EN LA VIRULENCIA DE VIRULENCIA DE B. ovis PAB. ovis PA
Evaluación de virulencia en ratones BALB/c de los mutantes B. ovis PA en los genes de la familia omp25/omp31 de
EVALUACIÓN DE VIRULENCIA EN EL MODELO
DEL RATÓN BALB/c
Vía de InoculaciónVía de Inoculación IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFC/ratón UFC/ratón
Ratones BALB/cRatones BALB/c 35 ratones/cepa 35 ratones/cepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1, 2, 3, 5, 7, 9 y 11 p.i.1, 2, 3, 5, 7, 9 y 11 p.i.
n=5n=5
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
ANÁLISIS DE LA IMPLICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN LA
VIRULENCIA DE B. ovis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
S e m a n a p .i.
log
UF
C/b
az
o
B. o v is P A
B. o v is ∆ o m p 2 5
B. o v is ∆ o m p 2 5 c
Análisis estadístico PLSD de Fisher
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana p.i.
log
UF
C/b
azo
B. ovis PA
B. ovis ∆omp31
ANÁLISIS DE LA IMPLICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN LA
VIRULENCIA DE B. ovis
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana p.i.
log
UF
C/b
azo
B. ovis PA
B. ovis ∆omp25d
B. ovis ∆omp22
ANÁLISIS DE LA IMPLICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA FAMILIA Omp25/Omp31 EN LA
VIRULENCIA DE B. ovis
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
LAS PROTEÍNAS Omp25 y Omp22 INFLUYEN EN LA CAPACIDAD INVASIVA Y DE PROLIFERACIÓN
CÉLULAS HELA MACRÓFAGOS MURINOS J774A.1
Microbes and Infection 10:706-710 Martín-Martín., et al (2008)
INFECCIÓN DE INFECCIÓN DE BrucellaBrucella spp. EN MACROFAGOS spp. EN MACROFAGOS
Extraido de: Int J Microbiol. Haag AF., et al (2010)
S-LPS dependiente de la activación de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3-K) y no
induce la activación del macrófago
Microbes and Infection 12:246-251 Martín-Martín., et al (2010)
La entrada de B. ovis y B. canis en el macrófago es independiente de la activación de P13-K
SR-A
TRÁFICO INTRACELULAR DE Brucella spp.
virB,
OMP25, OMP22Sistema de Secreción Tipo 4 (T4SS)
Codificado por vir
El sistema regulador de dos
componentes BvrR/BvrS
La proteína BacA
Los periplasmáticos glucanos ciclicos ß-1,2 (CßGs),
Han demostrado estar involucrados en supervivencia dentro de los fagocitos en modelos animales
Martin-Martin ., Et al (2010) (2012)
Extraido de: . Med Microbiol Immunol. 198(4):221-38 R. Martin Roop II., et al (2009)
Microbes and Infection 12:246-251 Martín-Martín., et al (2010)Infection and Immunity 1783-1793 Martín-Martín., et al (2012)
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Los genes que codifican para la familia Omp25/Omp31 se encuentran conservados en el género Brucella, sin embargo, varias diferencias importantes en su secuencia de ADN fueron encontradas entre la especies. Este polimorfismo podría estar involucrado en la diferencia de virulencia y preferencia de hospedador existente entre las especies de Brucella
Los sueros obtenidos en conejo frente a las PME de la familia Omp25/Omp31 de Brucella spp. han permitido determinar que las proteínas Omp31, Omp25, Omp25c y Omp22 se sintetizan en B. ovis PA. Por el contrario, las proteínas Omp31b y Omp25b no se han detectado en esta bacteria, resultados esperados teniendo en cuenta observaciones previas a nivel del ADN, pero sí se han detectado en la cepas de B. ovis PA complementadas con genes Omp31b y Omp25b funcionales, lo que comprueba su antigenicidad.
A pesar de que Brucella spp. no posee los típicos factores de virulencia, presenta factores de virulencia especializados como son: LPS, cadenas O, OMPs, BacA, T4SS, BvrR/BvrS, (CßGs)
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
El papel de las proteínas Omp31, Omp25 y Omp25c en la virulencia en ratón de B. ovis PA parece poco relevante. Sin embargo, no se puede descartar su implicación en el establecimiento de un proceso infeccioso en carneros, aspecto que sería interesante evaluar.
Las proteínas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B. ovis en ratón, por lo que sería interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B. ovis en carneros y también su implicación en la virulencia de otras especies del género Brucella.
Omp25Omp25 31
21,5
kDa MP
Suero anti-Omp25 y AcM anti-Omp25
B. ovis PA
Δomp25 Δ25-Com
Omp25Omp25
Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): 74-82. (2009) Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species.
Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino
31
kDa
21,5
Suero anti-Omp25b
PA Δ25c Com
Omp25bOmp25b Omp25c Omp25c
MP
Suero anti-Omp
31 25 25b 25c
PA 998-10 (omp25b)
Omp25b
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
WESTERN BLOT
21,5
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Omp25c presenta 2 bandas entre 27.5 29.5 a 30.5 kDa y debido a la similitud de antigenicidad se observa la banda de 25.9 KDa de la proteína Omp25
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
WESTERN BLOT
31
21,5 B. ovis PA Δomp31
Suero anti-Omp31 y AcM anti-Omp31
MPkDa
Δ31-Com
Omp31Omp31Omp31 Omp31
Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): 74-82. (2009) Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species.
Infect Immun. 75 (8): 4050-61 (2007). Role of the Omp25/Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernández P, Fernandez-Lago L, de Miguel MJ, Martin-Martin AI, Cloeckaert A, Grillo MJ, Vizcaino
31
kDa
21,5
Suero anti-Omp31bMP
PA Δ31
Omp31
Omp31bOmp31bOmp31b Omp3
1Omp31
31Com
31b Com
PA
AntiOmp31
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
WESTERN BLOT
Suero anti Omp22 purificada
PA Δ22 Com E. coli /Omp22
C(-)
Omp22Omp22
Vet. Microbiol 137:74-82, Martín-Martín AI., et al (2009)
Infection and Immunity 8:4050–4061, Caro-Hernández P., et al (2007)
WESTERN BLOT
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Martín-Martín AI, Caro-Hernández P, Sancho P, Tejedor C, Cloeckaert A, Fernández-Lago L, Vizcaíno N. (2009). Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25/Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species. Vet Microbiol. 28; 137 (1-2): 74-82. (2009)
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