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“Producción en soya (Glycine max L.) de proteínas

multiepítope neutralizantes de varios aislados del Virus de la

Inmunodeficiencia Humana (HIV) como una estrategia de

inmunización de bajo costo”

Dr. Sergio Rosales Mendoza

M.C. Lucía Orellana Escobedo

Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Laboratorio de Biofarmacéuticos Recombinantes

Agosto 2, 2012

Virus de la InmunodeficienciaHumana (VIH)

• VIH causante del SIDA.

• 33.4 millones de personas viven con VIH (UNAIDS).

• La vacunación se considera el método de elección para su erradicación.

Vacunas

• Vacunas de virus atenuados

– Riesgoso

• Vacunas de virus inactivados

– Poco inmunogénicas

• Vacunas de subunidades

– Péptidos sintéticos (Agrawal et al., 2003; Bradney et al., 2002; Varona-Santos et al., 2006)

– Proteínas recombinantes (completas o quiméricas) (Pantaleo et al., 2004; Shu et al., 2007)

Infección de linfocitos T

Región C4 y el asa V3

C4: constituye una parte importante del sitio de unión (CD4) en la envoltura viral. V3: inducción de anticuerpos neutralizantes y capacidad inmunogénica(Gray et al., 2010; Haynes et al., 2006; Rerks-Ngarm et al., 2009; Varona-Santos et al., 2006).

Epítope neutralizante ELDKWA

Regiones conservadas, inducción de anticuerpos neutralizantes (Bomsel et al., 2011; Coutant et al., 2008; Delcroix-Genete et al., 2006; Dong et al., 2005; Yu et al., 2008).

Epítopes del asa V3 de gp120 inducen respuestas neutralizantes

Zolla-Pazner et al., 2008. Virology.

Región variableEstrategias:•repetidos en tándem de variantes•Secuencias consenso

Inmunización oral con CVLPs-ELDKWA induce anticuerpos neutralizantes

Zhang et al., 2004. Journal of Virology.

Plantas: Plataforma para la producción de proteínas

• Producción a gran escala

• Bajos costos

• Habilidad de producir proteínas objetivo con las funciones biológicas y estructurales deseadas

• Ausencia de patógenos humanos o animales

• Desarrollo de vacunas orales

(Mason and Herbst-Kralovetz, 2012; Sharma and Sharma, 2009)

Plantas: plataforma para producciónde proteínas

• Vacunas basadas en plantas

• Producción de antígenos (VIH)

– p24 (Gonzalez-Rabade et al., 2011)

– Tat (Cueno et al., 2010)

– Nef (de Virgilio et al., 2008)

Vacunas, anticuerpos y proteínas terapéuticasbasadas en plantas

• E.coli LT-B (papa; diarrea; oral) Fase 1• Rabia GP/NP (espinaca; rabia; oral) Fase 1• H1N1 (tabaco; influenza; intramuscular) Fase 1

• Anti-CCR5 (tabaco; HIV; tópico) Pre-clínico• Anti-HIV gp120 (maiz; HIV; tópico) Pre-clínico

• Insulina (azafrán; diabetes; subcutáneo) Fase 2• Factor intrínseco (Arabidopsis thaliana; def B12; oral)

Fase 2

Yusibov et al., 2011

Plantas transgénicasVector de expresión

Transferencia de vector Planta transgénica

Fase de cultivo in vitro

Fitohormonas

• Derivadas del metabolismo secundario

• Papel central en la fisiología de plantas– Eventos de crecimiento, elongación, división y diferenciación

celular

• Inducen señalización a través de una variedad de receptores. – Modificación en la expresión de ciertos genes

Fitohormonas

– Auxinas: Regulan expansión y son determinantes en la estatura de la planta y tamaño de los órganos.• Ácido naftalenacético (ANA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-

D), ácido indolbutírico (IBA).

– Citocininas: Controlan crecimiento a través de la divisióncelular y diferenciación.• Benciladenina (BA, BAP)

Tabaco (Nicotiana tabacum)

Garbanzo (Cicer arietinum L.) y Soya(Glycine max L.)

Objetivo General

• Producir una proteína multiepítope del VIH en semillas de tabaco, garbanzo y soya y caracterizarlas en un modelo de inmunización en ratones BALB/c

Objetivos específicos

• Diseño y obtención del gen sintético– Optimizado para su transcripción y traducción en plantas

• Clonación, transferencia y expresión del gen en modelos vegetales– Diferentes promotores y señales de retención

• Caracterización molecular de las líneastransgénicas– Comprobar presencia del transgén, niveles de expresión de la proteína y

su antigenicidad

• Caracterización de las propiedadesinmunogénicas de la proteína– Evaluación de la respuesta humoral en intestino y suero

Metodología y Resultados

Diseño del gen sintético

Construcción de vectores de expresión

Transformación genética de tabaco,

garbanzo y soya

Análisis molecular de plantas

transgénicas

Análisis de Inmunogenicidad

Optimización y síntesis por la compañía GenScript.

Confirmación mediante secuenciación.

C4Epítopes de V3

Epítope de gp41

Péptido señal de la glicinina

Sitio NcoICodón de incio

Sitio BstEIICodón de paro

Etiqueta de Histidinas

Diseño del gen sintético sHIV

M A K L V F S L C F L L F S G C C F A C M P L V K Q I I N M W Q E V G K A M Y A L L A R P N N N T R K S I H I G P G R A F Y A T E A G A G G I K Q L Q A R V L A V E R Y A G G G N E Q E L L E L D K W A S L W N A G G G L K L D Q W A A G G A A L D S W N A G G A A L D K W D N G A G G A E L D K W A G A G A G P G R A F G P G R A F G P G R A F H H H H H H Stop

Péptido señal de la glicininaRegión C4Secuencia consenso V3 de HaynesEpítope ELDKWA de gp41Repeticiones de secuencias de V3M metionina de inicioStop paro

Gen sHIVPromotor 35 S

Promotor Glicinina

Ncol y BstEII BamHI y BstEII BamHI y Ncol

Vector Gen sHIV Vector pCAMBIA 1304 Vector pCR-GPro

Ligación

pGly

Reportero GUS

Transformación E. coli y A. tumefaciens

• Transformación E. coli mediante choquetérmico

• Transformación A. tumefaciens medianteelectroporación

Antes del pulso Durante el pulso Después del pulso

Membrana celular

Introducir genes

Campo eléctrico induce un voltaje a través de la

membrana celular

Vector entra en la célula

Electroforesis y digestión con enzimas NcoI y BstEII (E. coli)

1000 bp

500 bp

Vector

Inserto sHIV

Transformación genética de tabaco

Medio SelectivoBenciladenina 1 μg/ml

Acido naftalenacético0.1 μg/ml

Horsch et al., 1985No reguladores

Plantas transgénicas de tabaco

• Generación de 20 líneas y se seleccionaron 4 de ellas para su análisis (T-0)

• Las plantas no han mostrado alteraciones fenotípicas

• Obtención de semillas de la generación T-1 para obtenerplantas generación T-2

PCR (Tabaco)

MarcadorPM + 1 2 3 4 - 5 6 7 8 9

Amplificación del gen de resistencia a higromicina

Western Blot Anti-histidinas (Tabaco)

+ 1 2+ _

25 kD

Preliminar

Transformación genética de soya

Acido 2,4- Diclorofenoxiacético40 mg/L 20 mg/L

Medio de Maduración Ko et al., 2006

Histodiferenciación

Transformación genética de garbanzo

Benciladenina 3 mg/L

Benciladenina 1 mg/L Polowick et al., 2004

Transformación genética de garbanzo

Experimentos pendientes

• ELISA

– Detección de proteínas heterólogas y estimarniveles de expresión.

Experimentos pendientes

• Análisis molecular de plantas transgénicas:

– Confirmar mediante PCR la presencia de transgén en plantas regeneradas de garbanzo y plantas T-2 de tabaco

Análisis de inmunogenicidad Ratones BALB/c

Inmunizaciones en investigacionesparalelas

4 inmunizaciones por la vía oral4 inmunizaciones por la vía subcutánea• Sacrificio de ratones• Colección de suero y lavados

intestinales

UNAM. Facultad de Estudios Superiores de Iztacala

Dra. Leticia Moreno Fierros

Universidad de Illinois, IL, USA

Dr. Schuyler S. Korban

INSTITUCIONES PARTICIPANTES

GRACIAS POR SU ATENCIÓN