pcr enrique arce sophie ouabbou mónica penón celina vargas

PCR• Enrique Arce• Sophie Ouabbou• Mónica Penón• Celina Vargas

Generalidades

• PCR: Reacción de la cadena de polimerasa

• Descrita en 1985 por Kary B. Mullis• Objetivo: obtener mediante amplificación in

vitro, cantidades “masivas” de ADN a partir de muestras de ADN

• Cuantitativo o cualitativo

PCR cuantitativo

• Apoyo pronóstico

• Cuantificar cargas virales: control terapéutico de virosis crónicas y pacientes inmunosuprimidos

PCR cualitativo

• Genotipaje

• Apoyo diagnóstico

¿Qué caracteriza al PCR y lo diferencia de otras técnicas

moleculares?

1. Específico

2. Sensible

3. Exacto

4. Preciso

5. Resultados relativamente rápidos

PROCEDIMIENTO

Materiales y reactivos

• Desoxinucleotidos trifosfato ( dNTPs).• Primers , cada uno complementario a una de

las dos hebras de ADN.• Iones divalentes y monovalentes (cofactores

de la polimerasa).• Solución buffer (mantiene pH adecuado).• ADN molde.• ADN polimerasa.• Termociclador.

Pasos a seguir

• Paso 1: Desnaturalización por calor (>90°C). Se parte la doble cadena de ADN para que nucleótidos queden expuestos a la polimeraza.

• Paso 2:

Hibridación del Primer (unión a su secuencia complementaria en el ADN molde) (40°C-65°C).

• Paso 3:

Extensión con la DNA polimerasa (72 °C).

Actúa tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del Primer como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN.

** Siempre se debe utilizar doble cadena de ADN, por lo tanto para virus hay que hacer primero un proceso de transcripción.

• Los Primers los hacen casas comerciales que estudian zonas muy bien conservadas de los virus.

• La prueba debe estandarizarse: buscar la cantidad exacta de reactivos para obtener el producto exacto.

• Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis.

TÉCNICAS DE PCR

• Retrotranscriptasa PCR (RT-PCR)• In situ PCR• Real time PCR• PCR anidada• Multiplex PCR• End-point quantitative PCR• Rapid cycle PCR

Según el objetivo del examen, la prueba puede ser:

• Cualitativa

• Cuantitativa

VIH: RT-PCR

Pasos

• Retrotranscripción

• Amplificación

La técnica de PCR se usa más para pronóstico de VIH que para diagnóstico.

LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR DEL HOSPITAL

SAN JUAN DE DIOS

• Referencia a nivel regional (Centroamérica) para pruebas diagnósticas de VIH.

• En Costa Rica, es el único laboratorio haciendo cargas virales con propósito diagnóstico, el tratamiento y monitoreo de pacientes.

• Tienen la capacidad de analizar citomegalovirus, herpes, VIH, genotipos, entre otros.

El laboratorio

1. Extracción (el material genético de lasmuestras)

2. Amplificación (donde se lleva a cabo la PCR)

3. Detección (con secuenciador)

Para evitar la contaminación del material genéticodebenhaber al menos 2 áreas de trabajo, sin embargo el hospital cuenta con tres:

Separar el AND o ARN de la célula de donde reside. Se pueden utIlizar muchas técnicas diferentes para este paso.

1. Área de extracción

2. Amplificación

Ciclador automatizado que repite numerosas veces los cambios de temperatura para amplificar la carga viral de la muestra.

3. DetecciónSecuenciador y detector.

GRACIAS