métodos de estudio en biología celular1

OBJETIVOSDescribir los fundamentos de las siguientes metodologías:

Identificar las utilidades de cada una, evaluando su grado de complejidad

- microscopía óptica y electrónica

- centrifugación total y fraccionada - ultracentrifugación

Bibliografía: H. Curtis, B. Alberts

- cultivos celulares

- electroforesis

‘micros’ = pequeño

‘scopein’ = ver

Kepler1611

SimpleUtilizan una sola lente (lupas)

Compuesto

Utilizan dos sistemas de lentes

ocular objetivo

LUPA La lente se sitúa entre el ojo y el objeto

Aumenta el ángulo visual 4 a 60 aumentos

Aumento

Cantidad de veces que se ve mayor el objeto

0,1 a 0,2 mm

Resolución

Capacidad de percibir dos puntos de una muestra separadamente (criterio Rayleigh)

Identifica objetos que estén separados al menos 100 micrones

Óptica

Electrónica

Transmisión (TEM)

Barrido (SEM)

Campo claro

Campo oscuro

Contraste de fase

Fluorescencia

Aportan información descriptiva y estructural

Confocal

Microscopio óptico

Campo claro

Campo oscuro

Contraste de fase

Fluorescencia

Microscopio electrónico de transmisión

TEM

SEM

Microscopía Laser Confocal

SEM Aumenta 10X sobre MO

TEM

Aumento de 1000 x sobre MO

TEM

Preparación de las muestras para microscopía

• Fijación

• Teñidos

•Deshidratados

•Incluidos

•Cortes finos

De transmisión De barrido

MOME

Réplicas de superficie

habitualmente bañadas en oro

Rotor

Motor

Cabezal

Refrigeración

Vacío

Unidades Rpm.

La fuerza centrífuga está determinada por el diámetro del rotor y la velocidad de rotación.

TOTAL

FRACCIONADA

FRACCIONADA

Separación en base a

• tamaño

• densidad

Utilidad:

separación de organelas celulares

EN GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

Muestra de Proteínas

Moléculas lentasMoléculas rápidas Separa en base a

• tamaño

• forma

EN GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

Utilidad separación de diferentes proteínas

Separación de proteínas y ADN por su PM

SOPORTES

Acetato de

celulosaUso clínico

Acrilamida

(Proteínas)

Agarosa

(ADN)

Investigación

Buffer

Ánodo (+)

Caja acrílica

MuestraCátodo (-)

Acrilamida (gel)

SDS-PAGE

SDS-PAGE

3EIMMBLOT.MOV

Células frecuentemente utilizadas

• fibroblastos

• macrófagos

•células de tumores

Utilidad

• interacción célula-célula.

• Procesos celularesVentaja

Estudio sobre células vivas

Células CHO - Rab22-GFP

MÉTODOS PARA ÁCIDOS NUCLEICOS

ADN

Aislamiento Del Material Genético

ARN

RibosomasCromosómicos - Minicírculos,

• Detección de ADN/ARN

Fenol/cloroformo

Lisis celular y extracción con resina

Amplificación de ADN

• Detección de ADN/ARN

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Hebras = cadenas

Polimerasa

Nucleótidos

Iniciadores = cebadores = primers

Estructura del ADN

Amplificación de ADN

• Detección de ADN/ARN

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Iniciadores = cebadores = primers

Hebras = cadenas

Amplificación de ADN

• Detección de ADN/ARN

Reacción en Cadena de la Polimerasa

PolimerasaNucleótidos

Amplificación de ADN

• Detección de ADN/ARN

Reacción en Cadena de la Polimerasa

PCR

Amplificación de ADN

• Detección de ADN/ARN parasitario

Reacción en Cadena de la Polimerasa

PCR anidada

PCR en tiempo real

Bromuro de etidio

ANÁLISIS DE LAS BANDAS DE AMPLIFICACIÓN OBTENIDAS.

REA (restriction enzime analysis)

RFLP (restriccion fragment length polymorphims)

RADP-PCR (randomprimed)