metodos de enumeracion

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Métodos de enumeraciónviablesBIOL4029

Dr. Héctor L. Ayala del Río

Determinar la densidad de procariotasen una muestra desconocida

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Enumeración viable

• Principio: crecimiento como indicadorde densidad– Separación de microorganismos en

unidades independientes– Probabilistico

• Medio de Cultivo (sólido o líquido)• Estrategias principales

– Crecimiento y enumeración en platos– El número mas probable (NMP o MPN)

Separación: Diluciones en serie

• Base de todos losmétodos

• Solución salina -- evitarchoque osmótica

• Aspectos técnicos– Procedimientos asépticos– Cambiar pipetas / dilución– Pipetas TD/TC– Mezclar cada tubo– Factor de 10 a diferentes

escalas– Rango amplio

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Como medimos 0.1 ml

Crecimiento y enumeración enplatos

• Crecimiento sobre o dentro del agar• Asumpción básica: cada colonia surge

de un solo microorganismo.• Límites de conteo: 30-300

colonias/plato• Medida: Unidades Formadoras deColonia (ufc)/unidad de materia

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Spread Plate (Plato disperso)

Pour Plate (Plato vertido)

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Pour plate

Filtración en membrana

6

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Dilución en agar

Rolling chips

“boillingchips” estériles

Rotar placaRemover

asépticamente los“boiling chips”

invertirplaca

muestra

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Ventajas/Desventajas

• Ventajas– Sencillos– Estima células

viables– Sensitividad– Medio selectivo

• Desventajas– 1 col -> célula– Sobrevivencia– Patrón de

crecimiento– Laboriosos– Selectividad medio

de cultivo

El número mas probable(MPN)

• Atributos fisiológicos• Método basado en probabilidad que

requiere:– diluciones– replicación de inoculo– criterio positivos / negativos

• Crecimiento en medio líquido• Mas laborioso

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Factores importantes

• Número de diluciones• Número de replicas• Tamaño del inoculo

MPN en agar10-1

10-2

10-310-4

10

MPN en agar10-1

10-2

10-310-4

• Anotar # de colonias que crecieron y lasque no

Como leer los resultados de elNúmero más probable (MPN)

• Determinar el numero de tubos positivos• Codificar numéricamente• Identificar diluciones con menos de 5 pero > 0• Buscar # en la tabla de MPN• Calcular densidad utilizando correcciones

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

Rep

lica 12345

Dilución

5 5 5 5 5 5 2 1 0

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Estimados de densidadutilizando MPN

1. Leer número de la tabla: 69,1482. Identificar factor de dilución en el que

comenzamos a contar: 10-3

3. Volumen del inóculo usado / replica:0.1 ml

1. Factor de dilución 1/0.1 = 1/104. Calculo:

1. 69,148 x 103 x 10 = 6.9 x 108

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Ventajas / Desventajas

• Ventajas– Medio liquido– Selectivo /

Diferencial– Atributos fisiológicos

• Desventajas– Aproximado– ¿Que es un positivo?– Tiempo y material si

no es miniaturizado

ResumenFactores que afectan la

enumeración viable• Tamaño del inoculo• Condiciones de cultivo (medio temperatura)• Tiempo de incubación• Tamaño de las colonias• Diluciones• Patrón de crecimiento del organismo