maldi tof t - fbioyf.unr.edu.ar
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SU
SA
NA
A
MIG
OT
MALDI TOF
IDENTIFICACION FUNGICA
GENOTIPICO PATRON
PROTEICO
FENOTIPICO
IDENTIFICACION FUNGICA
MALDI TOF
18S rRNA ITS 1 O ITS 2
Internal transcribed
spacer regions 1 Y 2 Pruebas manuales,
Semi automatizadas
o automatizadas
MALDI
Matriz asistida por laser
desorción/ionización
TOF
Tiempo de vuelo (tiempo
que tarda cada ión en
llegar al detector)
Analiza proteínas intrínsecas
(ribosomales) de los microorganismos por
EM
El patrón proteico (ESPECTRO) se compara
con base de datos.
La concordancia de los Espectros
(microorganismo / base datos) se representa
con números 0-3
BACTERIAS
LEVADURAS
HONGOS
FILAMENTOSOS
MICOBACTERIAS
ID
MICROORG = ARMAS
BIOLOGICAS NO ID
Proceso Tecnología MALDI TOF MS
(Bruker Biotyper ).
α ciano-4
hidroxi - trans
cinámico
Biotyper
•Espectrometro Hardware+ Software + base datos (1960 ESP)
Proteínas
•2.000 a 200.000 Da
soporte
•Placa con 96pocillos reutilizable
lectura
•96 pocillos /h
Compara espectros
•1,7 a 3 fiabilidad
matriz
•Ac #ciano 4- hidroxi trans cinamico
Saramis
•Espectrometro Hardware+ Software : SHIMATZU.
• base datos SARAMIS (1160 ESP)
Proteínas
•2.000 a 200.000 Da
soporte
•Placa con 48pocillos NO reutilizable
lectura
•76 pocillos/h
Compara espectros
• CONFIABLE : SUP AL 70%
matriz
•2,5 DIHIDROBENZOICO
Plataformas comerciales
2.300 a 3.000
• Alta probabilidad de ID de especie
2.000 a 2299
• ID Género segura, especie probable
1.700 a 1.999
• ID de género probable
0.000 a 1.699
• Identificación no confiable
Score (confiabilidad de los
resultados)
(1) Aislamiento de cultivo primario
(2) Seleccionar 1colonia
(3) Realizar extendido (capafina) en un pocillo de la placaMaldi) (4) Agregar ac. Fórmico 70%
(5) Agregar Matriz HCCA(Ac. Alfa ciano-4-hidroxi cinámico)
(6) Generar perfil-espectro Por MALDI-TOF (7) Interpretación de datos
por MALDI Biotyper RTC 3.0
(8) Interpretación de resultados
Tiempo de resultado para una muestra: 5-8 minutos vs. horas o días para otros métodos de ID
BrukerMALDI Biotyper: Flujo de trabajo
MICROORGANISMOS
bacterias
Hongos
Método de extracción de proteínas
Directo – Spot
Extracción : fabricante
LIBERACIÓN DE PROTEÍNAS RIBOSOMALES
BASE DE DATOS BRUKER MALDI TOF Biotyper*
3900 microorganismos
318 géneros
1900 especies
Puntos críticos
En argentina RENAEM: RED NACIONAL MALDITOF (USUARIOS)
1 2
LEVADURAS
MEDIO CULTIVO: Sb gluc/ Chrom /AS
CULTIVO JOVEN (24 -48-72hs)
PROTOCOLO DE TRABAJO Spot directo • Sin pico o ID no confiable (2min)
Extracción Recomendada. • (20 min).
Evaluación score • .
IDENTIFICACION
Permite discriminar especies
relacionadas
C parapsilosis / C orthopsilosis / C metapsilosis
C glabrata / C bracarensis / C nivariensis
C albicans / dubliniensis
C haemulonii / C auris
C guillermondii / C famata
C neoformans / C gatti
Candida o Aspergillus
CRITERIOS DE INFORME PARA LEVADURAS POR MADI-TOF
Para la interpretación: score
≥ 1,7como identificación aceptable a nivel de especie y género, entre1,5-1,6 identificación aceptable a nivel de género menor a 1,5 como identificación NO CONFIABLE
Score menor a1,5 realizar extracción en tubo.
Para establecer un género Y/o especie diferente, diferencia mínima de10% entre el punto de corte superior y el más próximo.
Levaduras que no son identificadas, pero si obtenemos picos, enviar a
centro de referencia (Malbrán) para ser ingresadas en la base de datos
nacional
Colonias aisladas preferentemente de Sb 24-48h incubación.
FILAMENTOSOS
PLACAS
2, 5 Y 7 días
Sb, Lac, APD
Extrac Tubo C/ Zirconio,
• Mayor complejidad
para la extracción
• Conidios baja la discriminación
• Melanina impide la ionización
• Medio líquido disminuye la prod
de melanina
• Mejor técnica de extracción es
C/perlas de zirconio
Bruker aplica criterios muy estrictos ya que:
Identificación aceptable a nivel de género y
especie scores ≥ a 2,0
Identificación solo a nivel de género, 1,7- 2,0
Rechazables inferiores a 1,7 como poco
fiables
identificación como correcta a nivel de
género un score ≥ 1,6 y para especie ≥ 1,7
Las mayores limitaciones del uso de la espectrometría de masas para la identificación de los hongos filamentosos son la extracción de proteínas en la etapa pre analítica y el número de espectros en la base de datos.
FILAMENTOSOS
• El agregado de base de datos IN HOUSE mejora el rendimiento del
equipo (cepas de diferentes colecciones y regionales)
Estudios epidemiológicos
Identificación en muestras clínicas
Mecanismos de resistencia
Otras aplicaciones
Diferentes autores demuestran que se mejora el rendimiento de esta tecnología con el agregado de una base de datos in house y con cepas bien caracterizadas de colecciones de cultivos de diferentes
regiones geográficas, con el fin de reflejar la diversidad natural de las
especies Otras aplicaciones como la tipificación de aislamientos de brotes y/0 pruebas
de sensibilidad antifúngica son prometedores en Micología Clínica,
pero están todavía en etapa de desarrollo
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