laboratorio de histocompatibilidad dra susana elgueta miranda

LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD

Dra Susana Elgueta Miranda

RESPUESTA INMUNE El sistema inmunológico está

programado para: Diferenciar entre lo propio y lo extraño Defensa contra agentes externos

Las Moléculas responsables de estos eventos, pertenecen al MHC

LEUCOCITOS PASAJEROS

ALORECONOCIMIENTO RESPUESTA MUY VIGOROSA. 1-10%

DE LT RESPONDEN A ALOANTIGENO CLONES RESTRINGIDOS POR MHC

PRESENTAN ALOREACTIVIDAD PORCION TCR INVOLUCRADO EN

RECONOCIMIENTO DE Ag+AUTOMHC RECONOCE ALOANTIGENO

RESPUESTA A ALOANTIGENOS

GRAN EXPRESION MOLECULAS CMH, RECONOCIMIENTO DIRECTO POR REACCION CRUZADA, ESTIMULA CLONES DE BAJA Y ALTA AFINIDAD

RESPUESTA POLICLONAL Y POLIESPECIFICA

FUNCIONES LABORATORIO ISP

Laboratorio Nacional y de Referencia: *Estudio de histocompatibilidad a

Receptores (potenciales) y Donantes *Asignación de riñón de donante cadáver

*Tipificación HLA en enfermedades: B27, DR

Lleva la Lista Nacional de Receptores de Organos (en espera y trasplantados)

Otros: PEEC B27, Capacitación etc

BARRERAS ANTIGENICAS EN TRASPLANTE DE ORGANOS

Grupo sanguíneo ABO

Antígenos del CMH (HLA)

Antígenos de Complejos Menores de Histocompatibilidad

Requerimientos variables según órgano o tejido

OTROS ALOANTIGENOS

LEWIS

ANTIGENOS ENDOTELIO VASCULAR

MICA / MICB (MICC, MICD, MICE son pseudogenes

)

VIMENTINA

REQUERIMIENTOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD

HIGADO

CORAZON

RIÑON

MEDULA OSEA

ANTIGENOS

ANTICUERPOS

LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD

Estudios

RECEPTOR Tipificación HLA Existencia de anticuerpos anti-HLA (panel de

anticuerpos reactivos o PRA) pre-transplante Detección de la aparición de anticuerpos

anti-HLA post-transplante DONANTE

Tipificación de HLA RECEPTOR/DONANTE

Prueba cruzada (crossmatch XM)

EFECTO HLA EN TRASPLANTE RENAL

SOBREVIDA INJERTO FRECUENCIA RECHAZOS AGUDOS GRADO INMUNOSUPRESION DISMINUYE RIESGO DE

SENSIBILIZACION (IMPACTO ECONOMICO)

Donante vivo/ donante cadavérico

HERENCIA CMH

a b c d

ac, ad , bc, bd

A1B5DR8

A2B8DR3

A9B12DR2

A3B16DR4

HLA-A1,B5,DR8/ A9,B12,DR2 A1,B5,DR8/ A3,B16,DR4 A2,B8,DR3/ A9,B12,DR2 A2,B8,DR3/ A3,B16,DR4

25% idénticos25% 0 match50% semiidenticos

Tipificación de HLA

Métodos serológicos: CDC: citotoxicidad dependiente de

complemento

Métodos moleculares: PCR-SSP (iniciadores secuencia-

específicos) PCR-SSO (sondas secuencia-

específicas)

• Identificacion AntigenosPlacas con antisueros especificos(a-HLA A2, A3, B5, B7 etc)Celulas con antigenos a identificar

• Pesquisa de AnticuerposSuero para determinar existencia

anticuerposCélulas con Antigenos conocidos

Métodos serológicos

2 x 106/ml lymphocytes

Dispense 1 l of T or B lymphocytes

Dispense 10 l of Stain-Fix™

or5 l of Fluoroquench™

Evaluation and

Reporting

1 hour incubation

30 minutesincubation

Dispense 5 l of Class I or II rabbit complement

RabbitComplement

Tipificación:Métodos serológicos

“1” Reaction“1” Reaction

0–10% Dead Cells0–10% Dead Cells

“2” Reaction“2” Reaction

11–20% Dead Cells11–20% Dead Cells

“4” Reaction“4” Reaction

21–50% Dead Cells21–50% Dead Cells

“6” Reaction“6” Reaction

51–80% Dead Cells51–80% Dead Cells

“8” Reaction“8” Reaction

81–100% Dead Cells81–100% Dead Cells

Tipificación:Métodos serológicos

TECNICAS MOLECULARES

BAJA RESOLUCION: INFORMACION SIMILAR A LA SEROLOGIA

kits CTS Biotest One Lambda

RESOLUCION INTERMEDIA: PERMITE IDENTIFICAR GRUPOS DE ALELOS

ALTA RESOLUCION: PERMITE IDENTIFICAR ALELOS Y SUS VARIANTES

Micro SSPTM ProcedimientoMicro SSPTM Procedimiento 2. Agregar 10 ul de la

solucion que contiene el DNA/mezcla-D a cada uno de los pozos de la micro-placa del SSP, con excepción del pocillos que es el control negativo.

1. Agregar Amplitaq de Perkin-Elmer y la muestra de DNA en el tubo de D-Mix

3. Termociclador (Perkin Elmer 9600)

4. Transferir el producto de la reacción de PCR en un gel.

Micro SSPMicro SSPTMTM Procedimiento ProcedimientoMicro SSPMicro SSPTMTM Procedimiento Procedimiento

6. Analizar los patrones de bandeo y asignar los alelos correspondientes.

5. Correr la electroforesis.

11223344

55667788

99101011111212

7. Interpretación

TIPIFICACION HLA-A,B,DR

Tipificación SerológícaAntígeno A28 B40 DR5Subtipos A68 B61 DR11

Tipificación MolecularBaja resolución A*68 B*40 DRB1*11

Intermedia A*6801/6804 B*4001/4006 DRB1*1101/1104/1106

Alta resolución A*6801 B*4006 DRB1*1104

MATCH O COMPATIBILIDADANTIGENOS PRESENTES EN EL RECEPTOR Y EN EL DONANTE

MISMATCH O INCOMPATIBILIDAD

ANTIGENOS PRESENTES EN EL DONANTE Y AUSENTES EN EL RECEPTOR

EJEMPLO HLA-A1,3/ B8,16/ DR3,5 RECEPTOR HLA-A3,9/ B7,16/ DR5,8 PADRE

HLA-A1,19/ B5,B8/ DR3,5 HERMANO

EJEMPLO R: HLA-A2, 9; B5, 44; DR5, 6

MADRE HLA-A3,9; B5,8 ; DR4,5 HNO1. HLA-A2,3; B5,8; DR4,8 HNO2. HLA-A2,9; B5 ; DR5,8 HNO3. HLA-A2,3; B8, 44; DR4,6

COMPATIBILIDAD (MATCH) E INCOMPATIBILIDAD (MISMATCH)

RECEPTOR : HLA A1,2 ; B5,8 ; DR1,3 ;

DONANTE 1: HLA A2,9 ; B8 ; DR1,3DONANTE 2: HLA A2,9 ; B8 ; DR3DONANTE 1 MATCH : 1A 1B 2DR MM : 1A 0B 0DRDONANTE 2 MATCH : 1A 1B 1DR MM : 1A 0B 0DR

UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1.UN EJEMPLO (1)

CLASE II POR SSP BAJA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1*PACIENTE 23, 24 49, 62 04, -HERM. A 23, 24 49, 62 04, -HERM. B 23, 24 49, 62 04, -MADRE 23, 32 49, 60 04, -PADRE 24, - 62,- 04, -

UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1.UN EJEMPLO (2)

CLASE II POR SSP ALTA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1*PACIENTE 23, 24 49, 62 0405, 0407HERM. A 23, 24 49, 62 0404, 0407HERM. B 23, 24 49, 62 0405, 0407MADRE 23, 32 49, 60 0404, 0405PADRE 24, - 62,- 0404, 0407

Antigenos y alelos

Antigenos y alelos

HLA-DR HLA-DR

COMPATIBILIDAD DONANTE RECEPTOR

MEDIBLE EN DISTINTOS NIVELES DE RESOLUCION DE ANTIGENOS HLA

EN DISCUSION EL NIVEL AL CUAL EL MATCH HLA ES BENEFICIOSO

INMUNOGENICIDAD HLA MM PERMITIDOS MM PROHIBIDOS B7 en RECEPTOR A1 FENOTIPO RECEPTOR DR6: a-A10, A11, A19, B35 OTROS : Cw, DQ, DP

SENSIBILIZACION

PRESENCIA DE

ANTICUERPOS ALOREACTIVOS

CONSECUENCIAS DE LA SENSIBILIZACION

Menor posibilidad de trasplante (XM positivo)

Mayor tiempo en lista de espera

Sobrevida menor del injerto renal

HIPERSENSIBILIZADO (50%, 60%, 75%, 80%)

ANTICUERPOS ANTI-HLA

RECHAZO HIPERAGUDO DEL INJERTO

RECHAZO AGUDO HUMORAL

DAÑO CRONICO DEL INJERTO

CADA MOLECULA HLA PUEDE TENER MUCHOS DETERMINANTES ANTIGENICOS DIFERENTES

ANTICUERPOS ANTI-HLA ANTIGENOS HLA SON ANTIGENOS T DEPENDIENTES RESPUESTA PRIMARIA IgM RESPUESTA SECUNDARIA IgG PRODUCCION DE CELULAS DE

MEMORIA

VIAS DE SENSIBILIZACION

EMBARAZOS

TRANSFUSIONES

TRASPLANTES (ANTICUERPOS NATURALES)

Detección de anticuerpos anti-HLA y especificidad

Metodología CDC ELISA Citometria de flujo Detección por luminex

(LABSCREEN®)

Detección de anticuerpos anti-HLA por CDC

Panel de células (congeladas) PRA ( panel reactive antibody)

Paneles diseñados para asegurar una cobertura máxima de antígenos

Porcentaje de anticuerpos a-HLA 0% 100%

Anfígenos son purificadas de líneas de células transformado por EBV.

Detección de IgG o IgM – depende en el anticuerpo secundario que usan.

Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e identificación

de especificidad de los anticuerpos.

Detección de anticuerpos anti-HLA por ELISA

Detección de anticuerpos anti-HLA por FlowPRA™

Antígenos purificados acoplados a microperlas que pueden ser detectadas en un citómetro de flujo.

Detección de anticuerpos IgG, IgM o IgA Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e

identificación de especificidad de los anticuerpos.

CDC

ELISA

FlowPRA

Menor sensibilidad

Mayor sensibilidad

Sensibilidad en detección de anticuerpos anti-HLA

CROSSMATCH (PRUEBA DE REACCION CRUZADA XM)

Pesquisa de anticuerpos anti HLA en el suero del receptor, contra los antígenos del donante

DISTINTOS METODOS:CDC: distintas células, tiempos de

incubación, lavados, etc.CITOMETRIA FLUJO: mayor

sensibilidad

IMPORTANCIA DE XM POSITIVO

DEFINIR ESPECIFICIDAD

DE LOS ANTICUERPOS

SENSIBILIZACION Y TRASPLANTE RENAL

ANTICUERPOS anti-HLA

ANTICUERPOS anti-NO HLA

• ANTIGENOS MENORES DE HISTOCOMPATIBILIDAD

• AUTOANTICUERPOS

XM (+) CONTRAINDICACION Tx

XM (- ) BAJO RIESGO

CAMBIO DE CONCEPTO

ANTIGUO ESCENARIO

ANTICUERPOS Y CROSSMATCH

ANTICUERPOS (–) XM (–)

ANTICUERPOS (–) XM (+)

ANTICUERPOS (+) XM (+)

ANTICUERPOS (+) XM (–)

TOMA DE DECISION

DEFINIR RIESGO

EXITO FRACASO

Risk assessment for antibody-mediated rejection

Crossmatch result: IgG HLA-specific antibodies

Contra High risk Intermediate Low risk indicated

Current positive

Cytotoxicity

Flow cytometry

Historical positive

Cytotoxicity

Flow cytometry

Current and historical negative

Cytotoxicity

Flow cytometry Transplantation 2004, 78(2): 186

TIPOS DE DONANTES

DONANTE VIVO

DONANTE CADAVERICO

ORGANIZACIÓN PROGRAMA TRASPLANTE

HISTOCOMPATI-BILIDAD. I.S.P. Estudio DC Selección R

CORPORACION TXPesquisa, procuramientoCoordinación

CENTROS CENTROSTRASPLANTES PROCURA

LAB. VALDIVIARegional

MINSALFONASA

LISTA ESPERA D.CADAVER ABO ABO HLA-A,B,DR HLA-A,B,DR

PRA ESPECIFICIDAD XM LT-LB

HISTOCOMPATIBILIDAD Y TRASPLANTES

RELACION INJERTO/RECEPTOR

HUESPED RECHAZA INJERTO

INJERTO RECHAZA HUESPED

TOLERANCIA

INMUNOSUPRESION

¡ G R A C I A S !