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ÍNDICE
AUTORIDADES
Presidente de la Nación Ing. Mauricio MACRI
Jefe de Gabinete de Ministros Lic. Marcos PEÑA
Ministro de Salud Prof. Dr. Jorge LEMUS
SecretariodePolíticas,RegulacióneInstitutos Dr. Raúl Alejandro L. RAMOS
AdministraciónNacionaldeMedicamentos, AlimentosyTecnologíaMédica Dr. Carlos CHIALE - Administrador Nacional Dr. Roberto LEDE - Sub Administrador Nacional EQUIPO EDITORIAL
DireccióndeRecursosHumanosyOrganización Sra. Nélida MORINIGO CoordinacióndeCapacitacióneInvestigaciónCientíficaSanitaria Lic. Karina BALBUENA ServiciodeInvestigación Bioq. Leandro LEPERA Farm.BetinaDOCTOROVICH Lic.CeciliaVÁZQUEZ
DISEÑO Y DIAGRAMACION
DireccióndeRelacionesInstitucionalesyRegulaciónPublicitaria Lic.SebastiánDUARTE Lic. Rodrigo PIÑEIRO D.G.FedericoTORRADO
Trabajos Originales
Fumonisinas en alimentos a base de maíz:Desarrollo y validación analítica de la metodología ............................ 06Sonia Fuertes y Col.
Metodología Analítica para el Análisis de Multirresiduosde Pesticidas en Harina de Trigo y Productos Derivados .................. 10 Jonathan Pietronave y Col.
Desarrollo de una Metodología por Cromatografía Gaseosaacoplada a Espectrometría de Masas (GC-MS) para el Análisisde Benzodiacepinas en Productos Farmacéuticos .............................. 14 Mariela Baldut y Col.
Revisión Sistemática
Cannabinoides y Epilepsia ........................................................................ 19ProgramadeEvaluacióndeTecnologíasSanitarias
Estado de Situación
Informe de Gestión: Registro de Medicamentos(Primer Semestre Año 2017) ................................................................... 24Margarita Melgarejo - Roberto Sierras
Vigilancia de Mercado (Corte Horizontal)
Control del Mercado Argentino de EspecialidadesMedicinales que contienen Orlistat ....................................................... 32 Maria Pilar Alvarez y Col.
Articulos de Gestión
Incorporación de Nuevas Tecnologías: Optimización delAnálisis de Muestras Mediante Incorporación de la TécnicaCromatografía Líquida de Alta Performance Ultrarrápida ................... 34 MarcelaI.García,NadiaS.Villar,MaríaC.DeAngelisyCol.
Octubre 2017 | REVISTA CIENCIAREGULADORADELAANMAT | 5
EDITORIAL
iHoward PC, Tong W, Weilchold F, Healy M, Slikker W. Global Summit on Regulatory Science 2013.
Regul Toxicol Pharmacol. 2014 Dec;70(3):728-32.iiCiencia Reguladora (Editorial). Revista Ciencia ANMAT. 2012 Sep;0(1).
E nestosdíasnuestrainstituciónviveunmomentohistórico,susprimerosveinticin-coañosdevida.Sinlugaradudas,elloconstituyeunmotivodeinmensaalegríay
orgulloparatodosaquellosqueformanoformaronpartede laconstrucciónyde lahistoriaANMAT.Alolargodetodosestosañoslainstituciónsehaconstituidoenunorganismo de referencia nacional e internacional a través sus acciones esenciales en el cuidadodelasaluddelacomunidad,garantizandoconelloelaccesoaproductossegu-ros,eficacesydecalidad.Estorepresentaunlogroeindiscutiblementelesperteneceatodosycadaunodelosquehandadosuaporteparaelcrecimientoinstitucional.
Enestemarco,tenemoslagransatisfaccióndepresentarelprimernúmerodela“Revis-taCienciaReguladora”,lacualconstituiráuncanaldecomunicacióndeaquellostraba-joscientíficosydedivulgacióndesarrolladosportodaslasáreasdenuestroorganismo.
ElconceptodeCienciaReguladoraescentralparalasagenciassanitariasypuedeserdefinidodesdedistintasperspectivas.Así,dentrodelmarcodelaCoalición Internacional para la Investigación en Ciencia Reguladora1, aquella sedefinecomo la “ciencia que se ocupa del desarrollo de métodos, herramientas, estándares y criterios para evaluar la se-guridad, eficacia, calidad y la performance de los productos sanitarios”i. Porotrolado,unadefiniciónmásaplicadarefierealaCienciaRegulatoriacomolavíaoelmediopara“la toma de decisiones regulatorias basada en la mejor evidencia científica disponible”. Ambas definiciones sonválidasy se complementan,poniendode relieve la importanciadelusodelmétodocientíficoparalageneracióndeevidenciaysurelevanciaenlatomade decisiones.
Elmarcode lacienciareguladoraesamplio,sepuededarendiferentesámbitosyadistintosnivelesenunaagenciasanitaria.Constituyelabaseparaestablecermétodos,criterios,enfoquesynormasconquelasagenciasdesarrollansustareas.Sinlugaradu-das,larepercusióndecadaacciónregulatoriapresentauncorrelatomultidimensional,porloqueesnecesariaunaevaluaciónprevia,demaneradepreverelimpactosobrelosdiversosactoresimplicados,fundamentalmentesobrelasaluddelosciudadanos(porestemotivo,elprincipiodeprecauciónescentral).
Dr. Carlos A. Chiale
Septiembre,2017
Enestecontextoyenelprocesodedesarrollarunagestiónquerespondaaestasne-cesidades,larecopilacióndedatoseinformaciónsevuelveesencial.Paraelloseapelaaungrannúmerodefuentesdeinformación,teniendoelaportemultidisciplinariodereguladores,sociedad,académicoseindustriaregulada,entreotros.
Deestamanera,elanálisisdelainformacióngeneradayrecolectada,juntoalconoci-mientoprevio(formación-capacitación-entrenamiento)ylaexperienciaconstituyenelinsumoindispensableparalatomadedecisiones.
Talcomofuedescriptoenpublicacionesinstitucionalesanterioresii,enCienciaRegula-doralosmárgenesdeincertidumbrepuedensermásampliosqueenlacienciaacadé-micadebidoalaescasezdedatosoalasmúltiplesvariablesinvolucradas.Asimismo,seremarcaqueenmuchasocasioneseltiempodisponibleparalatomadedecisiónpuedeseracotadodebidoalaurgenciaoceleridadderespuestarequerida.Porestemotivoelconceptodelmanejoderiesgoescentralylaaplicacióndemetodologíasdeanálisisygestiónderiesgoresultanesencialesparamaximizarlaecuaciónbeneficio/riesgoantecada decisión regulatoria.
Finalmente,esnecesariomencionarlanotableinnovacióntecnológicadelosúltimosañosylanecesidaddeacompañar,evaluaryfomentareldesarrollodeestastecnolo-gíasdentrodeunmarcoregulatorioadecuado.Esteconstituyeungrandesafíoparalainstitución,dadoquedichasinnovacionespodránpermitirunamejorarealenlasaludylacalidaddevidadelaspersonas,enlamedidaenqueaseguremoslasventajasybene-ficiosdetalestecnologías,minimizandoalmáximosusriesgos.EsteeselgrandesafíoquenosimponemosparalospróximosañosenANMAT.
1La Coalición Global para la Investigación en Ciencia Reguladora (GCRSR, por sus siglas en inglés)
fue fundada en el año 2013 por varias de las principales agencias reguladoras internacionales,
formando parte nuestra institución de su Comité Ejecutivo.
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FUMONISINAS ENALIMENTOS A BASE DE MAÍZ: DESARROLLO Y VALIDACIÓN ANALÍTICA DE LA METODOLOGÍA
RESUMENLasmicotoxinassonmetabolitossecundariosproducidosporespeciesdehongosquecontaminanlosproductosagrícolas.Dentro del género Fusa-rium,lasfumonisinasB1,B2 y B3sonlasmásrelevantes,crecenenformaendógenaenelmaízypresentanefectostóxicosparalasaludhumanayani-mal.Comoobjetivoseplanteódesarrollaryvalidarunametodologíaanalíticaparacuantificarfumonisinasenalimentosabasedemaíz.Ladetermi-nacióndefumonisinasconsistióentresetapas:extracciónconmetanol:agua,purificaciónconcolumnasdeextracciónenfasesóliday,separación,detecciónycuantificaciónencromatógrafolíquidadealtaresolucióncondetectordefluorescencia(HPLC/FL)previaderivatizacióndelosanalitos.Seestandarizaronlascondicionesoperativasdelametodologíaanalítica,particularmentelascondicionesdeextracciónypurificacióndelamuestra,laetapadederivatizaciónylascondicionescromatográficas.SevalidólatécnicacumpliendoconloscriteriosdeaceptabilidadespecificadosparalosparámetrosdeselectividadparaFB1,FB2 y FB3,linealidad(R2mayora0,97),sensibilidad(LODyLOQadecuados)yprecisión(repetibilidadyreproducibilidadentreanalistas).Larecuperaciónobtenidafuede104%paraFB1,88%paraFB2y79%paraFB3.Porlotanto,elmétodopropuestoproporcionaunaherramientaeficazyconfiableparaelestudiodelacontaminaciónporfumonisinasenalimentos.
Fuertes, Sonia; Villafañe, Virginia; Maseda, Juan Pablo; D’Espósito,Lourdes; Ruarte, Silvana; Garbini, Adriana y De Nicola, MatíasDepartamento Control y Desarrollo Dirección de Fiscalización, Vigilancia y Gestión de RiesgoInstituto Nacional de Alimentos (INAL – ANMAT)ldesposito@anmat.gov.ar
Palabras claves: fumonisinas, maíz, desarrollo, validación, cromatografía.
1.INTRODUCCIÓN
Lasmicotoxinassonmetabolitossecundariosproducidosnaturalmenteporvariasespeciesdehongosquecontaminanlosproductosagrícolas.Sonobjetodeinterésmundialdebidoa laspérdidaseconómicasrela-cionadasconlosefectossobrelasaludpública,laproductividaddelosanimalesyelcomercionacionaleinternacional.SegúnlaFAOseestimaqueaproximadamenteun25%de loscultivosdecerealesdelmundoestáncontaminadosporalgúntipodemicotoxina.Dentro del género Fusarium,lasfumonisinasB1,B2 y B3 sonlasmásimportantesycrecenenformaendógenaenelmaíz.Seencuentranenlanaturalezaenunarelación4:2:1,respectivamente.Presentanefectostóxicosenanimales(leucoencefalomaciaenequinos,edemapulmonarencerdosycáncerdehígadoenratas)ysehanrelacionadoconincidenciadecáncerdeesófa-goydefectosdeltuboneuralenhumanos,principalmenteenaquellaspoblacionescuyadietasebasaenelmaíz.LaAgenciaInternacionaldeInvestigaciónsobreelCáncer,catalogóalasfumonisinascomoposiblescarcinógenoshumanos(Grupo2B).
Recientemente,elComitéMixtoFAO/OMSdeExpertosenAditivosAl-imentarios(JECFA)pusodemanifiestoque,enlamayoríadelospaíses,hayunaincidenciaelevada(70%)defumonisinasenmaíz,conunnivelmundialmediodeltotaldefumonisinasdealrededorde1.700μg/kg.Concluyeronqueesmuydeseablequesereduzcalaexposiciónaéstas,sobre todo en las regiones delmundodonde elmaíz es un alimentobásicode ladieta.Teniendoencuentaestasconsideraciones,sehaceindispensabledisponerdemétodosdeanálisisrápidosyconfiablesquepermitana los laboratoriosnacionalesde referenciaaportardatosdecontaminaciónporfumonisinasconelfindecontrolarelriesgoparalasaludpública.
Elobjetivodelpresentetrabajofuedesarrollaryvalidarunametodologíaanalíticaparacuantificarfumonisinasenalimentosabasedemaíz.
2.MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Reactivos y materialesSe utilizaron estándares de FB1, FB2y FB3 de 50,0µg/ml (Biopure®).Para lasoluciónderivatizanteseutilizóo-ftalaldehído (OPA)y2-mer-captoetanol(2-ME)(Sigma®).Lascolumnasfuerondefasesólidaein-tercambioaniónico(SPE-SAX,UCT®).Seutilizómetanol,acetonitriloyaguagradoHPLC.Lamatrizconsistióenunmaterialdereferenciademaízsinpresenciadefumonisinas(Trilogy®).
2.2. Curva de calibraciónSe establecieron5 niveles para las curvas de calibración de cada fu-monisina,teniendoencuentaloslímitesestablecidosporlalegislacióninternacional(ReglamentoCEN°1881/2006delaUniónEuropea)ylaocurrencia natural. Las curvas presentaron los siguientes rangos: FB1 100-750μg/kg;FB250-375μg/kgyFB330-250μg/kg.Inicialmenteserealizólacurvadecalibraciónapartirdelospatronesparaestandarizardiferentesparámetrosde lametodología.Luego,serealizóelprocesode validación con la curva de calibración sobre matriz debido a que con-templainteraccionesanalito-matrizyfasemóvil-matrizypresentama-yorsimilitudconrespectoamuestrasalimentarias.
2.3. Procedimiento de extracciónSepesaron25gdemuestra(fortificadaconFB1,FB2y FB3 en los dife-rentesnivelesdelacurva)yserealizólaextraccióncon50mldemeta-nol:agua.Seprocedióalalimpiezadelextractopormediodecolumnas
SPE-SAX.Lastoxinasseeluyerondelacolumna,seconcentraronyseresuspendieronenacetonitrilo:agua.Serealizóunaderivatizaciónpre-columnaonlineconOPAy2-ME,separaciónydetecciónenelHPLC/FL.
2.4. Condiciones cromatográficasElanálisiscromatográficosellevóacaboenHPLCShimadzu®.ElequipoestácompuestopormódulodebombaLC-20AD,inyectorautomáticoSIL-20AC, horno de columnaCTO-20ACy detector de fluorescenciaRF-20A.Para laseparaciónseutilizóunacolumnaC18(VP-ODS150x4,6mm,4,6μm)yunguardacolumna(100x4,6mm)deShimadzu®. Eltiempodecorridafuede25minutos.Laslongitudesdeondaparaeldetectorfueron335nm(excitación)y440nm(emisión).
2.5. Validación analíticaSe siguieron los lineamientosdelReglamentoCEN°401/2006de laUnión Europeay la “Guía Eurachempara lavalidación demétodosytemasrelacionados(1ªed.2016)”pararealizarlavalidacióndelatécnicapropuesta.EnlaTabla 1sepresentanloscriteriosdeaceptabilidaddelosparámetrosconsideradosparalavalidación.
2.6. Aptitud para la técnica analítica desarrollada SeparticipódeunensayointerlaboratorioFAPAS®04312paradeter-minación de fumonisinas B1,B2yfumonisinastotales(B1 + B2 + B3)enharinademaíz.
Parámetro a evaluar Criterio deaceptabilidad
LinealidadCapacidaddeunmétododeanálisis,dentrodeundeterminadointervalo,dedarunarespuestaqueseaproporcionalalacantidaddelanalitoquesehabráde determinar en la muestra de laboratorio.
Coeficientededeterminaciónlineal
(R2)≥0,97
Precisión
Repetibilidad (en 3 niveles)
Precisiónparaobtenerresultadosdeensayosinde-pendientesconelmismométodo,idénticasmuestrasdeanálisis,enelmismolaboratorioyconelmismoequipo,elmismooperador.
CoeficientedeVariaciónporoperador
(CV)≤*CoeficientedeHorwitz
Reproducibilidadintermedia
(en 3 niveles)
Condicionesdondelosresultadosseobtienenconelmismométodoenmatricesidénticasdeanálisisencondicionesdiferentesyaseadiferentesoperadores,usandodistintosequipos,entreotros.
CoeficientedeVariación
(CV)≤*CoeficientedeHorwitz
Veracidad RecuperaciónEselporcentajedelaconcentraciónrealdeunasus-tanciarecuperadaduranteelprocedimientoanalíticoentresnivelesdelacurvadecalibración:máximo,medio y bajo.
PorcentajedeRecuperación:60%-120%
LímitesAnalíticos
LODConcentraciónmínimadeanalitoquepuedeserdetectadoperononecesariamentecuantificadamediante un valor exacto.
Concentraciónquepresenteunarela-ciónseñal/ruido>3
LOQConcentraciónmínimadelanalitoquepuededeter-minarseconseguridadestadística(entérminosdeexactitud–precisiónyveracidad–aceptable).
Concentraciónquepresenteunarela-ciónseñal/ruido>10
Selectividad Gradoenqueunmétodopuedecuantificarocualifi-caralanalitoenpresenciadeinterferentes.
Cromatogramas libres de señales in-terferentes
Tabla 1. Parámetros de validación y sus criterios de aceptabilidad.
TRABAJOSORIGINALES
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3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4. CONCLUSIÓN
5. BIBLIOGRAFÍA
Seestandarizaronlascondicionesdeextraccióndelamuestra,dederi-vatizaciónyanálisiscromatográfico(Tabla 2).ElpuntodepartidafuelametodologíaoficialAOAC995.15conligerasmodificacionesquepermi-
Tabla 2. Condiciones operativas utilizadas en el método analítico desarrollado.
Tabla 3. Resultados obtenidos en la validación analítica de la metodología.
Solvente de extracción Metanol:Agua1:1(v/v)
Fase móvil (FM) Metanol:Bufferacetatodesodio5mM71:29(v/v)
Flujo de FM 1,5ml/minuto
Temperatura de columna 40°C
Etapa de derivatización on-line 40μlsoluciónderivatizante+10μldemuestraTiempodereacción:2minutos
Serealizóelanálisisdelosparámetrosdevalidación,pudiendocumplircontodosloscriteriosdeaceptabilidadpreviamentemen-cionados (Tabla 3).
Linealidad R2=0,9867 R2=0,9805 R2=0,9758
Precisión
Niveles N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3
Repetibilidad(%)
OP 1 3,8 5,6 5,0 3,7 9,0 8,6 6,5 8,3 7,0
OP 2 2,7 8,7 3,3 4,3 8,7 2,9 4,9 0,4 1,8
Reproducibilidadintermedia (%) 3,1 7,8 4,4 9,5 11,6 7,3 7,7 9,5 6,8
Veracidad Recuperación (%) 104 88 79
LímitesAnalíticos
LOD (µg/kg) 1,5 6,7 2,3
LOQ (µg/kg) 5,1 16,3 5,6
Selectividad Noseobservaroninterferenciasparaningunadelasfumonisinasanalizadas.
Se evidenció la selectividad (Figura 1), confirmando la capacidad delmétodoanalíticodeseparar,detectarycuantificar las fumonisinasenpresenciadeotroscomponenteseimpurezasdelamatriz.Elordendeelución de las fumonisinas fue FB1,FB3 y FB2;lostiemposderetención
FB1
FB3 FB2
Blanco
Matriz cargada(Nivel 3)
a)
b)
Figura 1. Cromatogramascaracterísticosde:a) matriz cargada y b) blanco
Apartirdelainformaciónpresentadasepuedeobservarqueelmétodoanalíticopropuestoaportaunaherramientarobusta,eficazyconfiableparaelanálisisdefumonisinasenalimentosabasedemaíz;ampliandolacapacidadanalíticadelDepartamentoControlyDesarrollodelINAL–ANMAT.
- AOAC. (2000). AOAC Official Method 995.15. Fumonisins B1, B2 and B3 in Corn.
- COMISION EUROPEA. (2006). Reglamento CE N°1881/2006 de la Comisión.
- COMISION EUROPEA. (2006). Reglamento CE N°401/2006 de la Comisión.
- Coronel, M. B., Vicente, S., Resnik, S. L., Alzamora, S. M., & Pacin, A. (2016).
Fumonisins in maize and gluten meal analysed in Argentinean wet milling
industrial plants by ELISA compared with HPLC-FLD method. Food Control,
67, 285-291.
tieronobtenerporcentajesderecuperaciónadecuados(dentrodelrangorecomendadoporelReglamentoCEN°401/2006).
7,0±0,2min.,16,8±0,4min.y18,6±0,4min.,respectivamente,yto-daslasmicotoxinaspresentaronunabuenaresolucióncromatográfica.Encuantoalapruebadeaptitud,seaprobóexitosamenteelinterlabo-ratorio FAPAS®04312.
- Eurolab España. (2016). “Guía Eurachem: La adecuación al uso de los mé
todos analíticos – Una Guía de laboratorio para la validación de métodos y
temas relacionados”. Eurachem, 66 pág.
- JECFA and FAO. (2012). Safety Evaluation of Certain Food Additives and Conta
minants. World Health Organization, 101 pág.
- Ndube, N., Van Der Westhuizen, L., & Shephard, G. S. (2009). Determination
of fumonisins in maize by HPLC with ultraviolet detection of o-ph thaldialdehyde
derivatives. Mycotoxin Research, 25(4), 225-228.
- Waśkiewicz, A., Beszterda, M., & Goliński, P. (2012). Occurrence of fumonisins
in food - An interdisciplinary approach to the problem. Food Control, 26(2), 491-499.
Fumonisina
Parámetro a evaluarB1 B2 B3
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METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA EL ANÁLISIS DE MULTIRRESIDUOS DE PESTICIDAS ENHARINA DE TRIGO Y PRODUCTOS DERIVADOSPietronave, Jonatan; Villafañe, Virginia; Maseda, Juan Pablo;D’Espósito, Lourdes; Ruarte, Silvana; Garbini, Adriana; De Nicola, Matías.Departamento Control y Desarrollo. Dirección de Fiscalización, Vigilancia y Gestión de Riesgo. Instituto Nacional de Alimentos (INAL – ANMAT)ldesposito@anmat.gov.ar
RESUMENLautilizacióndepesticidasendistintasetapasdelacadenaproductivadeltrigoesunaprácticaampliamentedifundidaparamitigarelimpactonegativoquelasplagasproducensobreelrendimientodelascosechas.Lapresenciaderesiduosdepesticidasenalimentoslistosparaelconsumoimplicaunriesgosanitarioparalapoblación.ElpresentetrabajobuscacontribuiralfortalecimientodelSistemaNacionaldeControldeAlimentos,medianteelaportedeunmétodoanalíticovalidadoparaladeterminacióndemultirresiduosdepesticidasenharinadetrigoyproductosderivadosporcromatografíalíquidaacopladaaespec-trometríademasasentándem(LC-MS/MS).Elmétododesarrolladoyvalidadoincluyó10residuosdepesticidascuyousoeshabitualalolargodelacadenaproductivadeltrigo.SetrabajóconlametodologíaQuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) paralaextracciónypurificacióndelasmuestras.Segúnelanálisisdelosparámetrosdevalidación,lametodologíafueadecuadaparaladeterminaciónde9deloscompuestosincluidos.Paraelbu-profezín,analitoparaelcualseobtuvieronbajosnivelesderecuperación,sesugiereelanálisisporcromatografíagaseosaacopladaaespectrometríademasasentándem(GC-MS/MS).
Aunqueelusodepesticidas logrereducirel impactonegativoquelasplagas causan en los cultivos, no puedendesconocerse los perjuiciosque pueden causar en la salud humanay en el ambiente. La conse-cuencianegativadesuutilización,relacionadadirectamenteconelejedeestetrabajo,eslapresenciadesusresiduosenlosalimentoslistosparaelconsumo,loqueimpactadirectamenteenlainocuidadycalidadalimentaria, repercutiendoen lasaludde lapoblaciónengeneral.Sondiversoslosfactoresquecontribuyenaestasituación,principalmente,lautilizacióndediversascombinacionesdeformulacionesabasedeprinci-piosactivoscuyapersistenciaenlossuelosesprolongadapornoserde-gradadosporlascondicionesambientalesalasquequedanexpuestos.Eldesarrollodemetodologíasanalíticasadecuadasparasudetermina-ciónesfundamentalparaquelasautoridadessanitariaspuedancumplirsuroldefiscalización.El objetivodel presente trabajo consistióendesarrollaryvalidar unametodologíaanalíticaparaladeterminacióndemultiresiduosdepesti-cidasenharinadetrigoyproductosabasedetrigoporcromatografíalíquidaacopladaaespectrometríademasasentándem(LC-MS/MS).
1.INTRODUCCIÓN 2.MATERIALES Y MÉTODOS
Se eligieron10 principios activos para incluir en elmétodo de análi-sis,paralocualsetuvieronencuentadatosdelaCámaradeSanidadAgropecuariayFertilizantes(CASAFE)sobrelacomercializacióndepro-ductosfitosanitariosparatrigo,recomendacionesdeaplicacióndefa-bricantesoimportadoresdeagroquímicosdeArgentinayantecedentesde hallazgosde residuosdepesticidasenalimentosabasede trigo.Loscompuestosseleccionadosfuerondimetoato,metalaxyl,malatión,azoxystrobina,tebuconazole,diazinón,pirimifósmetil,buprofezín,imi-daclopridypirimicarb.
2.1 Selección de analitos.
2.2. Reactivos, solventes y soluciones utilizadas
Setrabajóconestándaresdepesticidas(Fluka)depurezamayora95%.Seutilizó acetatode etilopara cromatografía gaseosa (Merck®) comodiluyenteparapreparardiferentessolucionesdeestándares.SeempleómetanolgradoLC/MS(Merck®)yaguabidestilada(purificadorPURELAB serie Classic. ELGA®)comofasemóvil,conformiatodeamonio5mM(Sigma-Aldrich®)yácidofórmico0,0012%(Sigma-Aldrich®).
SetrabajóconelmétodoQuEChERS(Supelco®).Laetapadeextracción,serealizóconacetonitriloparaanálisis(Sintorgan®),acidificadoconáci-doacéticoglacial (Anedra®). Seutilizaronsalesdeextraccióndelmé-todomodificadopor laAOAC(6gdesulfatodemagnesioy1,5gdeacetatodesodio).Paralaetapadepurificación,seutilizaron50mgdeDiscovery®DSC-18(C18),50mgdeGCB(ENVI-Carb®),150mgdesul-fatodemagnesioy50mgdePSA.
2.3 Preparación de estándares
2.4 Condiciones cromatográficas
2.5 Parámetros del espectrómetro de masas
Apartirdelosestándarescomercialesdepesticidas,seprepararonsolu-cionesstockdecadaprincipioactivo,enacetatodeetilo,aconcentra-cionesde1000µg/ml.Apartirdeellas,sepreparóunasoluciónmixdetodosloscompuestos aunaconcentraciónde10µg/ml.Estasoluciónfueutilizadapara realizar lacurva testigoenmetanolgradoLC/MSyparacargarblancosdematrizparaevaluarlarecuperacióndelatécnica.Todaslassolucionesfueronalmacenadasa-20ºC.
SetrabajóconuncromatógrafolíquidocondetectordemasasdetriplecuadrupolomarcaAgilent Technologies®,modelo6460ycolumnacroma-tográficaZORBAXRRHDEclipsePlisC18(2,1x100mm,1,8µm)Agilent Technologies®.Lascondicionescromatográficassepresentanenla Tabla 1.
CondicionesFasemóvil:
SolventeA.Agua,formiatodeamonio5mM,ácidofórmico0,012%.SolventeB.Metanol,formiatodeamonio5mM,ácidofórmico
0,012%.
RampadetrabajoDe0a0,5minutos:94%desolventeAy6%desolventeB.De18a20minutos:5%desolventeAy95%desolventeB.
De21a25minutos:100%desolventeB.
Flujo:0,4ml/min.
Volumendeinyección:5µL.
Temperaturadecolumna:40ºC.
Tabla 1. Condicionescromatográficas.
Tabla 2.Parámetrosdelespectrómetrodemasas.
ParámetrosFuente de iones: electrospray (ESI) Polaridad:
positiva
Temperatura del gas: 300 ºC Flujodel gas:5 l/min.
Nebulizador: 45 psi. Temperatura del gas envolvente:
250 ºC. Flujo
del gasenvolvente:
11 l/min.Voltaje del capilar: 3000 V.
Método de escaneo: monitoreo de reaccionesmúltiples dinámico. (DMRM)
Voltaje de la celda de aceleración: 7V. Fragmentador: entre 80 y 380 V.
TRABAJOSORIGINALES
2.6 Optimización de los analitos
Enunaprimeraetapasetrabajócondilucionesdelassolucionesstock decadaunodelospesticidasseleccionados,paraoptimizarlasenergíasdefragmentación(EF)ydecolisión(EC)yasíobtenerlastransicionesdemasasmásabundantesdecadapesticida.Acontinuaciónseprocedióadeterminarsustiemposderetención.Luego,seprepararonsolucionesdetrabajo,compuestasporentre4y5pesticidascadauna,parapoderevaluareldesempeñodelosparámetrosseleccionadosparaladetecciónporespectrometríademasas.Finalmente,sepreparóla“soluciónmix”,conteniendotodoslospesti-cidasobjetodeestetrabajo,apartirdelacualserealizarontodas lasdilucionesnecesariasparalavalidación.
12 | REVISTA CIENCIAREGULADORADELAANMAT| Octubre 2017
13
2.7 Curva de calibración
Apartirdelasoluciónmix,seestablecieron9nivelesparalascurvasdecalibracióndecadapesticida:1;1,67;3,34;5,01;6,68;16,7;26,7;40y50ng/ml,que,segúnlatécnicadeprocesamientodelamuestraquesedetallaacontinuación,correspondenalospuntos:3(N1);5(N2);10(N3);15 (N4);20 (N5);50 (N6);80 (N7);120 (N8)y150 (N9)µg/kg,respectivamente.
2.8 Preparación de la muestra y procedimiento de extracción
Setomóunaporcióndemuestrablancode5gramosysehidratócon10mldeagua.Seagregaron15mldeacetonitrilocon1%deácidoacéticoyseadicionaronlassalesdeextraccióndelmétododelaAOAC(6gr.desulfatodemagnesioy1,5gr.deacetatodesodio).Setransfirieron2mldelsobrenadanteauntubode5mlconlassalesdedispersión(50mgdePSA,150mgdesulfatodemagnesio,50mgdeC18y50mgde
2.9 Validación analítica
Seevaluaronlosparámetrosdeespecificidad,linealidad,precisión(re-petibilidad y reproducibilidad intermedia), veracidad (recuperación) ylímitesdedetección (LOD)y cuantificación (LOQ), según los criteriosde aceptabilidadestablecidosen la guíaSANTEpara lavalidacióndemétodosanalíticosdepesticidasenalimentosypiensos.
3. RESULTADOS3.1 Optimización de los analitos
Seobtuvieronlossiguientesresultadosdeoptimización:
Pesticida IonPrecursor EF(V)
Producto 1
EC(eV)
Producto 2
EC(eV)
Dimetoato 230,3 92 199,0 2 125,0 18
Metalaxyl 280,3 92 220,1 10 160,1 22
Malatión 331,4 92 127,0 6 99,0 18
Azoxystrobina 404,4 92 372,1 6 344,1 22
Tebuconazole 308,2 160 70,1 22 125,0 22
Diazinón 305,4 92 169,1 18 153,1 18
Pirimifósmetil 306,3 164 164,1 18 108,1 30
Buprofezin 306,4 92 201,1 6 116,0 10
Imidacloprid 256,0 100 175,2 12 209,2 12
Pirimicarb 239,2 92 182,1 10 85,2 26
Tabla 3. Transicionesoptimizadasdelosanalitos.
3.2 Parámetros de validación
Selectividad. Sedemostróausenciadeseñalenelblancodemuestra,encontrasteconlasseñalesobtenidasenmuestrasfortificadas(figura1),locualcompruebalaselectividaddelametodología.
Figura 1.Muestrafortificada.
Linealidad.Loscoeficientesdedeterminación(R2)obtenidosverificanlalinealidad entre la concentración de cada analito y la intensidad de la señal. Los valores se muestran en la Tabla 4. LOD y LOQ. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 4.Repetibilidad. Loscoeficientesdevariación(CV%)estimadosparacadanivelyoperadorevaluado,decadaanalito,fueronmenoresalCV%de
Pesticida R2 LOD
(μg/kg)
LOQ
(μg/kg)
Recuperación(%)N1 N3 N5 N7 N9
Dimetoato 0,989 0,16 0,94 87 90 71 100 110
Metalaxyl 0,994 0,15 0,66 91 88 91 86 81
Malatión 0,994 0,42 2,08 57 59 56 62 65
Azoxystrobina 0,998 0,12 0,49 109 89 57 101 97
Tebuconazole 0,982 0,32 1,46 137 97 87 98 98
Diazinón 0,983 0,26 1,02 82 72 68 86 81
PirimifósMetil 0,992 0,28 0,97 63 65 60 65 63
Buprofezín 0,989 0,08 0,21 26 21 19 20 17
Imidacloprid 0,982 0,09 0,70 129 111 85 102 190
Pirimicarb 0,990 0,23 0,75 80 76 778 75 71
Losparámetrosdevalidaciónanalizadossuperaronloscriteriosdeacep-tabilidadestablecidosparatodosloscompuestos,exceptoparaelbu-profezín,paraelqueseobtuvieronbajosporcentajesderecuperación.Respectoaestecompuesto,serecomiendaevaluarsurecuperaciónuti-lizandocromatografíagaseosaacopladaaespectrometríademasasentándem(GC-MS/MS).Actualmente,elCódigoAlimenarioArgentino (C.A.A)noestableceLí-mitesMáximosdeResiduos (LMR)depesticidasenharinade trigoyproductos derivados. Por ello, el desarrollo de metodología analíticacon altos niveles de sensibilidady especificidad, como la que hemosdesarrollado,esunaherramienta fundamentalparagenerarevidenciacientíficaquejustifiquelanecesidadde incorporarLMRdepesticidasenestetipodeproductos.
4. CONCLUSIONES 5. BIBLIOGRAFÍA
- Guidance document on analytical quality control and method
validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed.
SANTE/11945/2015. European Comission.
- Rejczak, T. & Tuzimski, T. (2015). A review of recent developments and
trends in the QuEChERS sample preparation approach. Open Chem.; 13:
980–1010.
- Control de las plagas en la agricultura argentina. Estudio Sectorial Agrícola
Rural. Banco Mundial. Centro de Inversiones. FAO. Año 2005.
- Los plaguicidas en la República Argentina. Departamento de Salud
Ambiental. Dirección Nacional de Determinantes de la Salud e
Investigación. Ministerio de Salud de la Nación. Edición 2014.
- Validación de métodos y determinación de la incertidumbre: “Aspectos
generales sobre la validación de métodos”. Instituto de Salud Pública Chile.
Año 2010.
Tabla 4. Resultadosdeparámetrosdevalidación.
GCB),secentrifugóysetomóunaalícuotaparaelanálisisenelinstru-mental. Paraevaluarlarecuperacióndelatécnicasecargólamatrizenlosni-velescorrespondientesa3,10,20,80y150µg/kgdelacurva,compa-randoestosresultadoscromatográficosconlascurvastestigorealizadasparalosmismosniveles.
Horwitzpararepetibilidadobtenido,conlocualsecumplióelcriteriodeaceptabilidad.Precisión intermedia. Los CV%parareproducibilidadintralaboratorioes-timadosparacadanivelevaluado,decadaanalito, fueronmenoresalCV%deHorwitzparareproducibilidadintralaboratorioobtenido,conlocualsecumplióelcriteriodeaceptabilidad. Recuperación. En la tabla 4semuestran losporcentajesderecuperaciónobtenidosparacadacompuestoenlosniveles1,3,5y9.
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DESARROLLO DE UNA METODOLOGÍA PORCROMATOGRAFÍA GASEOSA ACOPLADA AESPECTROMETRÍA DE MASAS (GC-MS)PARA EL ANÁLISIS DE BENZODIACEPINASEN PRODUCTOS FARMACÉUTICOSMariela Baldut, Eduardo Saint Martin, Matías Gómez, Marta SpinettoDepartamento de Química y Física, Dirección de Fiscalización y Gestión de Riesgos,Instituto Nacional de Medicamentos, Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica.mariela.baldut@anmat.gob.ar-esaintmartin@anmat.gov.ar
RESUMENLasbenzodiacepinassonpsicofármacossintéticosqueposeenlassiguientespropiedadesfarmacológicas:sonansiolíticos,sedativos,hipnóticos.Suelenserutilizadascomodrogasdeabuso,por loqueesnecesariounexhaustivocontrolde laventayusoporquegenerangrantoleranciaydependencia.Conlafinalidaddegenerarunabasededatospropia,seincorporaronespectrosdemasasdediversassustanciasdeinterésfarmacológicoytoxicológicoalabibliotecadelcromatógrafogaseosoquetieneacopladoundetectorespectrométricodemasas.Sedesarrollóunametodologíaparaladeteccióneidentificacióndebenzodiacepinas,yaquesepuedenaislarlosanalitosdeinterésmedianteunaextracciónlíquido-líquidoyluegoanalizarporcromatografíagaseosa.PuedeseraplicableenprimerainstanciaparalabúsquedadeanalitosconocidosonodeclaradosenmuestrasdediversoorigenqueingresanalLaboratorioNacionaldeControl,paraposteriormentecontinuarelanálisisutlizandotécnicasfarmacopeicasuotrosmétodosparalacuantificacióndebenzodiacepinas.Esporelloquepuedeserconsideradacomounatécnicaconfirmatoriay/ocomplementaria.MedianteestametodologíadescreeninggeneralporGC-MSsedeterminasimultáneamentegranpartedelasbenzodiacepinas,siendoaplicableparaelanálisisdedistintostiposmuestraslocualpermitedarunarápidarespuestaacercadelaidentidadquímicadelosanalitos.
Palabras claves: Benzodiacepinas, Cromatografía Gaseosa y Espectrometría de Masas, Desarrollo, Extracción Líquido-Líquido, Productos Farmacéuticos.
1.INTRODUCCIÓN
Las benzodiazepinas son entidades químicas de origen sintético, lascualestienenactividadsobreelsistemanerviosocentral,conefectossedantes, hipnóticos, ansiolíticos, anticonvulsivos, anestésicos ymiorrelajantes.Seutilizanparael tratamientode laspatologíascomola ansiedad, insomnio y otros estados afectivos, así como tambienpara el tratamiento de epilepsias, abstinencia alcohólica y espasmosmusculares.Suelenserutilizadascomodrogasdeabuso,porloqueesnecesariounexhaustivocontroldelaventayusoyaquegenerangrantoleranciaydependencia.Laprimerapartedelproyectoconsistióengenerareincorporarespectrosde masas de diversas sustancias de interés farmacológico y toxicológico alabibliotecadelcromatógrafogaseosoquetieneacopladoundetectorespectrométricodemasas.TeniendoencuentaqueelDepartamentodeQuímicayFísicadelInstitutoNacionaldeMedicamentos(INAME)eseláreaquerealizaelanálisisdelasmuestrascorrespondientesaoficiosjudiciales, pericias, especialidades medicinales y diversos productos
Figura 1-Estructurageneraldelasbenzodiacepinas:Compues-taporunanillodebencenofusionadoaunanillodediazepinade7miembrosyunsustituyente5-arilo.Lossustituyentesindi-cadoscomoRxcorrespondenagrupossustituyentesquevarían
segúnlabenzodiacepina,locualdeterminalapotencia.
2. OBJETIVOS
Desarrollar una metodología para la detección e identificaciónde benzodiacepinas en productos farmacéuticos y muestras deorigen desconocido, utilizando Cromatografía Gaseosa acoplada aEspectrometríadeMasas.Generarespectrosdemasasdeprincipiosactivosdeinterésfarmacéuticoytoxicológicoparaincorporaralabibliotecadelcromatógrafogaseosoacopladoaundetectordemasas.
3.1 Biblioteca de Estándares de Benzodiacepinas
Solucionesdeconcentraciónde0,1mg/mldecadaunadelasbenzodiacepinasutilizandocloroformocomosolvente.Corridasporcromatografíagaseosaparalaincorporacióndeespectrosdemasasala biblioteca del cromatógrafo gaseoso.
3.2 Desarrollo de la metodología analítica
Para establecer las condiciones de análisis de múltiples benzodiacepinas por cromatografía gaseosa acoplado a un detector de masas, se realizaron pruebas utilizando una solución estándar de concentración de 0,1 mg/ml de cada una de las benzodiacepinas.
TRABAJOSORIGINALES
farmacéuticos,esfundamentalcontarconunacompletabasededatos,siendo la finalidad dar una rápida respuesta acerca de la identidadquímicadelosanalitos.Posteriormente, se desarrolló una metodología para el análisis debenzodiacepinasporGC-MS.Esimportantecontarconunatécnicadescreening general,enlaquepuedandeterminarsesimultáneamentegranpartede lasbenzodiacepinasenunamuestradeorigendesconocido,aplicableparaelanálisisdedistintostiposmuestras.Unametodologíacomplementariay/oconfirmatoria,puedecontribuiralarápidadeteccióneidentificación,ademásdeestablecerunlineamientodetrabajoenlabúsquedayanálisisdesustanciasconocidasydesconocidas.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Equipo:cromatógrafodegasescondetectorespectrométricodemasasy de Ionización en llama (FID), marca Shimadzu, Modelo QP-2010Ultra, con el Sistema de Datos GC-MSSolution, equipado con unabasededatos.InyectorautomáticoAOC20i,MuestreadorautomáticoHeadspace Teledyne Tekmar HT3. Cuenta con una línea de gascarrier (Tipo Supelco 2-7600-U)y trampa para línea de gasmake-up(TipoSupelco2-7600-U).Seutilizóunacolumnacapilar95%dimetil-polisiloxano/5% fenil-polisiloxano (29,8m x 0,25 mm ID -0,25µm),Marca Restek ZB-5MS, lote: 7H6-G010-11/Serie N°294703/CódigoN32,límitemínimo-60ºCylímitemáximo325/350ºC).
*Estándar Interno. Solución clorofórmica de Amitriptilina deconcentración0,25mg/ml.Elíndicederetenciónes2284,menoraldelosprincipiosactivosdeinterés.*Solución estándar. Se pesó 2,0 mg del estándar de referencia, setransfirióaunmatrazde20mlyseagregó14mldecloroformo.Unavezdisueltoseañadió2mldeestándarinternoyllevóavolumenconelmismodiluyente(concentración0,1mg/ml).Para Zolpidem,seutilizócomodiluyentesolucióndecarbonatodesodio2,0%p/v., llevando avolumenfinal de10ml. Se extrajo con3ml decloroformo,repitiendoelprocedimiento2vecesmás.Sereunieronlosextractosobtenidosenunmatrazde10ml,seañadió2mldeestándarinternoysellevóavolumenconsolventeorgánico.*Preparación de la muestra.Se llevóapolvofino lamuestraaanalizar,tomandoelpesoequivalentea1mgdelprincipioactivo.Setransfirióaunmatrazde10mlyseañadió7mldesolucióndecarbonatodesodioal2%.Sesonicó10minutosysellevóavolumenconelmismodiluyente.Setrasvasólatotalidaddelasoluciónmuestraaunerlenmeyerde25mly se añadió5mlde cloroformo. Se agitómecánicamentedurante2minutosa300rpm.Setrasvasóaunaampolladedecantaciónyseagitóvigorosamenteparaextraerlosanalitos.Seseparólafaseacuosadel extracto clorofórmico. Se añadió 3 ml de cloroformo a la fase acuosa, realizóuna segundaextraccióny se agregó clorurode sodio.Sereunieronlosextractosenunmatrazde10mlyseagregó2mldeestándarinterno.Finalmentesellevóavolumenconcloroformo.
*Matrices de benzodiacepinas. Se prepararon matrices al 1% de cadauno de los principios activos, utilizando excipientes comunes ycantidadesdefórmulascomerciales.Fórmulaporunidad(comprimido):PrincipioActivo(Benzodiacepina)1,91mg;AlmidónGlicolato2,00mg;CelulosaMicrocristalina 50,00mg; LactosaMonohidrato 127,00mg;CroscarmelosaSódica10,00mg.*Selectividad.Determinada por el detector espectrométrico demasasacopladoalcromatógrafogaseoso.Estepermiteladeteccióninequívocadeunanalitoapartirdelacorrespondenciaconelespectrodemasasdereferenciaqueseencuentraincorporadoalabibliotecadelequipo.Apartirdelíndicedesimilaridadsepuedeconfirmarlaidentidad.*Linealidad. Se consideró cinco niveles, abarcando el rango de 50%-150%delosIFAsdeinterés,siendoelvalornominalunaconcentraciónde0,1mgdelprincipioactivo(100%).*Recuperación.Setrabajósobremuestrasal100%delaconcentraciónnominalutilizandolatécnicaycondicionesestablecidaspreviamente.*Límite de Detección (LD) y Cuantificación (LC).Seprepararonsolucionesdiluidasdecadaunode losanalitos,paraobtenerunarelaciónseñal/ruidomayor3paraLDymayora10paraLC.
3.3 Parámetros de Validación considerados
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4.RESULTADOS4.1- Biblioteca de Estándares de Benzodiacepinas
SeincorporarontreceespectrosdemasasdereferenciaalabibliotecaINAME: Alprazolam, Bromazepam, Clodiazepóxido, Clonazepam,Diazepam, Desoxiclodiazepóxido (sust. relac. de Clordiazepóxido),Flunitrazepam, Nordazepam, Lorazepam, Midazolam, Triazolam,Zolpidem,Zopiclona.
4.2 Desarrollo de la metodología analítica
Seestablecieronlascondicionesparaelanálisisdemúltiplesbenzodiacepinasporcromatografíagaseosaacopladoaundetectordemasas,alcanzandolaresolucióndelosanalitosdeinterés.
Velocidad(ºC/min)Temp.final(ºC)Tiempo (min)---240,02,00
4,00280,00,00
5,00290,00,00
20,00300,03,00
2,00StartTime(min)
15,50EndTime(min)
SCANAdq. Mode
0,03EventTime(sec)
2500ScanSpeed
40,0Startm/z
450,0Endm/z
• Cromatografía Gaseosa (GC)
• Espectroscopía de Masas (MS)
Temperaturadelhorno240ºC,temperaturadelInyector285ºC,tiempodecorridaprogramado15.5min,mododeinyecciónSplit,relacióndesplit5.0,gascarrierHelio,flujo4.0ml/min,presión250.0kPa,velocidadlinealde40,0cm/s.
Temperaturadelafuentedeiones300ºC,temperaturadelainterfase300ºC,cutoffdelsolvente2min,voltajedeldetectorrelativoalresul-tado absoluto del tunning(-0.9mV),límite/threshold 10.
4.3- Parámetros de Validación
Se trabajó con soluciones estándar de cada uno de los analitos ymatrices simuladas para evaluar los distintos parámetros de validación. Figura 3.RegistroTICdelamatriz1preparada,análisisempleandolametodologíadesarrollada.
*Selectividad.Losregistrosdecorrienteiónicatotal(TIC)nopresentan interferencias. El espectro de masas de cada uno de los analitos se corresponde con el de referencia (los cuales están incorporados a la bibliotecadelequipo).Entodos loscasos,el índicedesimilaridadfue mayora98,0.
*Linealidad. Inicialmente se trabajó con doce benzodiacepinas. Sin embargo siete presentan curvas de acuerdo a los parámetros establecidosparalinealidad,por locualsereportanlosresultadosde: Alprazolam, Bromazepam, Clonazepam, Clordiazepóxido, Diazepam,Midazolam,Zolpidem. Enel casode clordiazepóxidoy zolpidemsepudoverificar4niveles. De todas maneras, se decidió estudiar el rango 75%-150% de la concentración terapéutica tomando como consideración de que lasespecificacionesparaproductosterminadoscontemplanelrango90,0-110,0%.
Figura 2. Registro de Corriente IónicaTotal(TIC)delpoliestándar.Ordendeelucióneíndicesderetención:Lorazepam(2528),Diazepam(2556),Nordazepam(2625),Desoxiclodiazepóxido(sust.relac.deClordiazepóxido),Midazolam(2722),Flunitrazepam(2744),Bromazepam(2760),Olanzapina(2861),Zolpidem(2941),Clodiazepóxido(2981),Clonazepam
(3000),Alprazolam(3108),Triazolam(3219),Zopiclona(3263).
Gráfico 1. Linealidad:benzodiacepinas
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 50 100 150 200
FACT
OR
DE R
ESPU
ESTA
NIVEL (%)
LINEALIDAD
Alprazolam
Bromazepam
Clonazepam
Diazepam
Midazolam
Zolpidem
Clordiazepóxido
En losresultadosobtenidosenelanálisisdel testt-student, todas lasbenzodiacepinas cumplen con las hipótesis establecidas: pendientediferentedeceroyelcoeficientedecorrelaciónnosignificativamentedistinto de cero, lo cual comprueba que el sistema posee uncomportamiento lineal. Además se acepta la hipótesis nula para laordenada al origen (intercepto no es significativamente diferente decero).Enelanálisisdevarianza(ANOVA)paracadacurvadecalibracióndelasbenzodiacepinas,elvalordeFhalladoesmayorqueelvalorcriticodeFconcualpodemosestablecerquelapendienteessignificativamentediferentedeceroparacadacurvadecalibracióndecadabenzodiacepina,porlotantoestasposeenuncomportamientolineal.
*Recuperación. Fue adecuada en la mayoría de los casos. Dado quese aplica un método de screening general, las condiciones deberánoptimizarseparacadaprincipioactivoenparticularunavezidentificados(por ejemplo: pH del diluyente, solvente de extracción, etc.). Elprocedimiento de extracción de los analitos es un factor importanteparalarecuperación.*Límite de Detección y Límite de Cuantificación. Los resultados obtenidos seencuentranenelordendelosmicrogramos(concentracionesμg/ml),locualreflejaquesepuedenidentificarlasdistintasbenzodiacepinasabajas concentraciones en las muestras de interés.
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Tabla 1.Resultadosobtenidosenlavalidacióndelametodologíaanalítica.
Benzodiacepina ParámetrosSelectividad Linealidad(R2) Recuperación(%) LD(µg/ml) LC(µg/ml)
AlprazolamEspectrodemasassecorrespondeconeldereferencia.
ÍndicedeSimilaridad≥98
0,9922 94,7 3,00 10,00Bromazepam 0,9457 77,8 2,25 7,50Clonazepam 0,9988 73,4 2,18 7,27Clordiazepoxido 0,9903 58,6 3,75 12,50Diazepam 0,9769 95,3 1,34 4,49Midazolam 0,9904 79,0 2,73 9,09Zolpidem 0,9990 57,1 2,00 6,67
5. CONCLUSION
Se incorporaron trece espectros de masas a la biblioteca del cromatógrafogaseosoacopladoaespectrometríademasas,demanera quesecreóunabasededatospropiaparalabúsquedadeanalitos.Esto serealizóapartirdelanálisisdesolucionesestándardebenzodiacepinas deconcentración0,1mg/ml,siendoestevaloreladecuadoyaquelas señalesnopresentanasimetríay/oápicespocodefinidoscomosuele suceder en los casos de sobre carga de la columna. Se lograron mejoras en losvalores de índices de similaridad con los nuevos espectros de referencia (comparativamente con la biblioteca que trae incorporada elequipo),locualpermitedarunamayorcertezaalaidentificación.A 285ºCseobtuvieronregistrosaceptablesencuantoalcomportamiento cromatográfico.Lascondicionespropuestasparaelanálisissurgende unasituacióndecompromisoenlaquedebealcanzarseelcumplimientodetodosloscriteriosanalíticos.
Sedesarrollóunametodologíaparaladeterminacióndebenzodiacepinas, lacualimplicaunaextracciónlíquido-líquidoyanálisisporcromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas utilizando condiciones adecuadasparalaresolucióndetodosloscomponentesdeinterés.La mismapuedeserconsideradacomocomplementariaaotrosensayosy confirmatoriaencuantoalacomposiciónquímicadeunamuestra.Para la identificaciónseconsiderólacorrespondenciaconlosespectrosdemasasdereferenciadelcromatógrafoyelvalordelíndicedesimilaridad. LasmuestrassetrataronapHalcalinoyaqueavalorescercanosa12 se facilita la extracción de las benzodiacepinas.Tanto el pH como el solvente de extracción son críticos porque impactan directamente en la recuperación. Se obtuvieron resultados quevan desde el 50 al 90%.Seconsideranaceptablesalosfinescualitativos.Estosresultados son dependientes de las propiedades fisico-químicas del analito, las condicionesdeensayo,suestabilidadylamatrizenlaqueseencuentra, entre otros factores. Es por ello que se recomienda que una vez determinada la composición de las muestras se efectúen los ajustes
necesarios respecto a concentración y características del analito de interésconelobjetodeoptimizarlacalidaddelosparámetrosanalíticos. En los casos en los que la recuperación fue baja sería importante considerarlaprecisióndelmétodoparaestudiarlafactibilidaddeaplicar un factor de corrección. En la evaluación de linealidad del método analíticoseobtuvieroncoeficientesdecorrelación(R)ydedeterminación (R2)cercanosauno,demostrandoasíqueexisteunarelaciónentre la concentracióndelabenzodiacepinasyelfactorderespuesta.Ademásel métododemostróposeerunaltogradodesensibilidaddadoslosbajoslímitesdedetecciónlogrados.
6. BIBLIOGRAFÍA
- Polettini, A. Systemactic Toxicological Analysis of Drugs and Poisons in biosamples
by hyphenated chromatographic anf spectroscopic techniques.
Journal of Chromatography B, 733 (1999) 47–63 PII: S0378-4347(99)00264-9.
- Shimadzu Corporation Analysis of psychotropic drugs in whole blood utilizing
simultaneous
- SCAN/MRM measurements. Application data sheet number 45; 2013.
- Shimadzu Corporation Simultaneous Analysis of 66 pesticides by GC-MS using
hydrogen carrier gas. Application data sheet number 83. (2013)
- Shimadzu Corporation- Kadokami, K. Development of novel automated Identification and
Quantification System with a Database for GC-MS. Technical Report. (2013)
- Clarke´s (s.f.)–Analysis of drugs and poisons (4th Edition). Published by
Pharmaceutical Press (2011)
- United States Pharmacopeia -Edition 39 (2016). <1225> Validation of analytical
methods. E.E.U.U.
Recuperado el 22 de mayo del 2017, de www.uspnf.com/
CANNABINOIDESY EPILEPSIAMaria Laura Ferreiros Gago, Virgilio Petrungaro, Pablo Copertari, Norberto Barabini,Jimena Bugna, Vicentin, Roberto Lede.Programa de Evaluación de Tecnologías Sanitarias. Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica.Contacto:virgilio.petrungaro@anmat.gob.ar
1. INTRODUCCIÓN 2. OBJETIVO
Laepilepsiaafectaaalrededorde65millonesdepersonasenelmun-do,conuna incidenciade20-70casosnuevospor10.000 individuosporaño.Enlaactualidad,existenmúltiplestratamientosantiepilépticos,peroningunodeellosescurativo.El30%delospacientessonresistentesalostratamientosantiepilépti-cosconvencionalesypresentacuadrosgravesconmalpronóstico.Enlaactualidad,seobservaunacrecientepresiónporpartedelospacientes,familiaresydelasociedadengeneralparabuscaralternativasterapéuti-casnotradicionalesparaestetipodecuadros,sumadosalainformaciónfácilmenteaccesibleyalrolpreponderantedelasredessocialesydelosmedios de comunicación.Enestecontexto,loscannabinoidesseposicionancomounaopciónte-rapéuticaaconsiderarenestospacientes;elloobligaaanalizar,desdeunaperspectivacientífica, laevidenciadisponible sobreefectividadyseguridaddelautilizaciónterapéuticadelcannabisodesusderivadoseneltratamientodelaepilepsia.Losdosprincipalescannabinoidesbiológicamenteactivossoneltetra-hidrocannabinol(THC)yelcannabidiol(CBD).ElTHCeselcompuestopsicoactivomásabundanteen laplanta, siendoel responsablede loscambioscognitivosyenlasensopercepcióncomúnmenteasociadosconelconsumodemarihuana.Latoleranciay losefectospsicoactivosdelTHCsonlosfactorescríticoslimitantesenelavancedelpotencialusoclínicodelTHC.ElCBDposeebajaafinidadporlosreceptoresCB1yCB2,actúacontra-rrestandoalgunosefectospsicoactivosdelTHCymejorasutolerabili-dad.Presentaefectoanticonvulsivante,antiinflamatorioyantitumorigé-nico.Debidoalaausenciadepropiedadespsicoactivas,labajatasaenlaquesedesarrollatolerancia,subuenperfildeseguridadenhumanos,asícomosueficaciaenlosestudiospreclínicosyalgunosresultadosalenta-doresenlasfasesclínicas,sugierenquepodríaserunfármacoseguroyeficazparaeltratamientodelaepilepsia.
Evaluarlaeficaciayseguridaddeloscannabinoideseneltratamientodelaepilepsiaenpacientesdecualquieredad.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Sellevóacabounabúsquedabibliográficautilizandolassiguientespala-brasclave:cannabi*ANDepilepsy y cannabinoids AND epilepsy.Límites:Sereshumanos,sinrestriccióndelenguaje.Seexploraronbasesdeda-tos Cochrane Collaboration,PubMed,BibliotecaVirtualenSalud(BVS),Biblioteca Central de Medicina (RIMA), Epistemonikos, Tripdatabase,UNIVADIS,JAMANetwork,Agenciasdeevaluacióndetecnologíassa-nitarias,PROSPERO,Clinicaltrials.govybúsquedamanual.Seincluyeron10estudiosde634encontrados,publicadosentre1974y2016 (3 revisiones sistemáticas, 6 estudios descriptivosy un ensa-yo clínico controlado) con los siguientespuntosfinales: reducciónenlafrecuenciadeconvulsiones(lacualfuedefinidaenalgunosestudioscomoproporcióndepacienteslibresdeconvulsionesdurante12meses,otresveceselintervalomáslargosinconvulsionesy/oproporcióndepacientes que presentan reducción del ≥50% en la frecuencia de lasconvulsionesduranteelperíododemantenimiento)yeventosadversos.
REVISIÓNSISTEMÁTICA
4. RESULTADOS
ElECCAdeDevinsky (2017) incluyó120pacientes conSíndromedeDravet(SD).EnelgrupoquerecibióCBDlafrecuenciabasaldelascrisisconvulsivasdisminuyóun40%en lamedianacon respectoa labasal(R25-75 -69,5 a -4,8)y el 43%de los pacientes del grupoCBDpre-sentaronunareducción>50%enlafrecuenciadelasconvulsiones.LospacientestratadosconCBDrequirieronmenorcantidaddefármacosderescate.Enunaescalavalidadaparaevaluaciónporpartedeloscuida-dores,ladiferenciaenelestadogeneraldelospacientesmejoró.EnelestudiodeDevinsky(2016),prospectivo,abierto,deaccesoam-
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pliadoqueincluyó214pacientes,seobservóuncambiodelamedianaenlasconvulsionesmotorasmensualesdesdelalíneadebasede-36,5%(R25-75-64,7a0)y5pacientes(4%)estuvieronlibresdeconvulsionesmotoras. Para todos lostiposde convulsiones, 37%de los pacientestuvieronunareducción≥50%,22%reducción≥70%y8%tuvieronunarespuesta≥90%.ParalospacientesconSDlareduccióndelamedianamensualenlasconvulsionesmotorasfue49,8%(R25-75-64,3a-12,4).Para lospacientesconsíndromedeLennox-Gastaut (SLG) se registróunareducciónen lamedianadel36,8%(R25-75-60,3a-18,8)en lasconvulsionesmotorasyel37%deellostuvieronunareducción≥50%en las convulsiones. El cambio de la mediana en las convulsiones men-sualestotalesdetodoslostiposfuede-35,5%(R25-75-55,1a-16,4).
ElestudioretrospectivodeTzadok(2016)basadoenregistrosdevisitasclínicasytelefónicas,incluyó74pacientesconepilepsiarefractaria.El90%delospacientesquerecibieronCBDpresentaronalgúngradodereduccióndelafrecuenciadelasconvulsiones.El46%delospacientesinformaroneventosadversos (EA)yel14%debiósuspenderel trata-miento.Elrestodelosestudiosconlossesgospropiosderivadosdelabajaca-lidadmetodológica informaronmejoría francade lasconvulsiones.Lamayoríadelospacienteserangraves,conmuchotiempodeevoluciónyvariostratamientosconmedicamentosantiepilépticossimultáneos,ylaexposiciónalCBDocurrióluegodelfracasodemúltiplestratamientosrealizadosporaños.
Lamayoríadelosestudiosreportaronbeneficiosadicionalesenelcom-portamiento;estadodealerta,lenguaje,lashabilidadesmotoras,sueño,estadodeánimoydelosmovimientosestereotipados.LosEAinformadosenlosestudiosfueronlevesamoderadosylosmásfrecuentes (>10%) fueron: somnolencia, disminución del apetito, dia-rrea, fatiga, convulsiones, cambiosenel apetito, statusepiléptico, le-targia,cambiosenlasconcentracionesdefármacosantiepilépticoscon-comitantes, alteraciónde lamarchay sedación. Los efectos adversosserios fueron infrecuentes.
5. DISCUSIÓN
Enlosdosestudiosmásrecientes(Devinsky2017y2016)seincluyeronuntotalde334pacientesconepilepsiarefractaria,SDySLG.Ellocons-tituyeunapoblaciónextensa,cuandose lacomparacon lapoblaciónincluidaenelrestodelosestudiosrealizadosentre1978y2016,queincluyenuntotalde237pacientes.Con respecto a la eficacia, enel estudiodeDevinskyet al (2017) sedemostróqueel50%delospacientesconSíndromeDravet,entrata-miento conCBD, presentaron una reducción de aproximadamente el40%enlafrecuenciadelascrisisconvulsivas.Y,además,queel50%delospacientespresentaronunareduccióndecasilamitadenlafrecuen-ciadelasconvulsionesdetodoslostipos.TambiénseconcluyóquelospacientestratadosconCBDrequirieronmenorcantidaddefármacosderescate,yquetrespacientespermanecieronlibresdecrisisenelgrupotratadoyningunoenelgrupocontrol.EnelestudiodeDevinskyetal (2016)seobservóqueel50%de lospacientesredujeronaproximadamenteun37%lafrecuenciadelascon-vulsionesmotorasmensuales.El39%delospacientespresentaronunareducción>50%enlafrecuenciadelascrisismotorasyel37%delospacientespresentaronunareducción>50%paratodoslostiposdecon-vulsiones.El56%delospacientesconcuadrosatónicosredujeronenmásdel50%lafrecuenciadelascrisis,ycasiel10%delospacientespermanecieronlibresdeconvulsiones.EnlospacientesconSLGseob-servóqueel50%logróunareduccióncercanaal40%enlafrecuenciadelascrisismotoras;sinembargo,ningúnpacientepermaneciólibredecrisis.Seredujeronlosataquesatónicos,perosinobservarsereducciónenlascrisistónico-clónicas.Sólounaminoríadelospadresfueronca-pacesdeproporcionardosisespecíficasdeCBD(esdecir,mgdeCBDpordía).Loscambiospercibidosenlafrecuenciadelascrisisfueronobservadosrápidamente,puesel86%delospacientesinformaronmejoríaoempeo-ramientodentrodelos14días.TambiénsehaninformadootrosefectosbeneficiososdeltratamientoconCBD,comosonlamejoríaobservadaenlaconducta,alerta,lenguaje,comunicaciónyhabilidadesmotoras.Lasencuestasrealizadasapadresycuidadoressonconcordantescon
loshallazgosdescriptospreviamente.LadosisdeCBDdemostrósersegura,enunrangobastanteamplioen-tre0,5y30mg/kg/día,aunquealgunospacientesdebieronrecibirdosisde50mg/kg/día.ConrespectoalasformulacionesbasadasenmezclasdeCBDyTHC,laconcentracióndeesteúltimonosuperóel1%.Los EA descriptos conmayor frecuencia (>10%) fueron somnolencia,disminucióndelapetito,fatiga,diarrea,convulsiones,cambiodelape-tito,letargia,alteracionesenlamarcha,sedacióneirritabilidad.LosEAfueronmásfrecuentementeinformadosdurantelosprimeros14díasdetitulacióndeladosis.Lamayoríadeloseventosreportadosfueronleveso moderados y transitorios.Lospacientesincluidosenlamayorpartedelosestudiosevaluadosfue-ronpacientesgraves,conepilepsiarefractaria,entratamientoconporlomenostresfármacosantiepilépticosyotrasopcionesterapéuticascomolacirugíaparaepilepsia,ladietacetogénicaolaestimulaciónvagal,sinlograruncontroladecuadodelascrisis.EnDevinskyetal (2017)casitodoslospacientesteníanunretrasomadurativomoderadoysevero.Entodoslosestudiosseplanteaelusodeloscannabinoidescomountratamientocoadyuvanteysinérgicoconeltratamientodebase,loquepermiteenlamayoríadeloscasossuprimiralgúnfármacooreducirsudosis,conelconsecuentebeneficio.Nuncasehaconsideradoelusodecannabiscomoúnicomedicamentonicomoprimeraopciónterapéutica.Conrespectoalacalidadmetodológica,elúnicoensayoclínicocontro-ladofueDevinskyetal (2017)que incluyóúnicamentepacientesconSindromeDravet,mientrasqueelrestodelosestudiosincluidosenlatablasonestudiosdescriptivosquecarecendegrupocontrolysondebajacalidadmetodológica.Losestudiosdescriptivosincluyeronpacien-tes con crisis tónicas, atónicas, clónicas o tónico-clónicas, SindromeDravet,Lenox-GastautyDooseentreotros.Sibienexisteescasaevidenciaydebajacalidad,desdeelcomienzodelusodecannabinoidesenepilepsia,en losúltimostresañossehade-mostradoelefectoanticonvulsivodelCBDenpacientesconSDyunefectofrancamentebeneficiosoenelrestodelasepilepsiasrefractariasaltratamientoenniñosyjóvenes,conunrangodeseguridadmuyra-zonable.Lasprincipaleslimitacionesdeestosestudiossonelfinanciamientoporpartedelaindustria(GW)locualhasidodeclaradoenlosestudiosdeDevisnkyetal2016y2017.Larelativafacilidadenlaobtencióndelaceiteartesanal,enningúncasodebehacersuponerquesuelaboraciónsincontrolpuedaasegurar laprovisiónadecuadadelprincipioactivoCBDalapoblación.Losriesgosincluyen: la imposibilidad técnicadeasegurarmanufacturaapropiada,composiciónprecisaydosisentregada,tipodecultivoadecuadoypre-visibledelaplanta,ausenciadecontaminantesyotrastantasvariablesaleatorias,queatentancontracualquierintentoterapéuticoquepuedaconsiderarseeficazyseguro.
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6. CONCLUSIONES
ElusodeCBDenformulacionesestandarizadasycontroladas(obvia-mente,estoexcluyealaspreparacionescaseras),enunaconcentracióndel99%ynuncamenoral96%conrespectoalTHC,comotratamientoadyuvanteen laepilepsia refractariao fármacorresistenteenniñosyjóvenes,hademostradotenerefectoanticonvulsivanteprincipalmenteencrisismotorasydebeconsiderarsecomounaopciónefectivaysegu-raeneltratamientodeestetipodepacientes.Másalládesuprobadaeficaciaanticonvulsivante,permiteenlamayo-ríadeloscasosreducirladosisdeotrosfármacosanticonvulsivantesysusefectosadversos,loqueresultaenmejoríadelacalidaddevidadelospacientesydesuscuidadores.Elusomedicinalde loscannabinoidesysuscompuestosnoadictivosdebenserconsideradosdentrodelarsenalterapéuticodeusocontrola-do,eneltratamientodelaepilepsiarefractaria.RECOMENDACIÓNFUERTE:afavordelusodeCBDenelsíndromedeDravet,resistentealtratamientoanticonvulsivo(Formulación:manufacturacongarantíadecalidad,99%CBD/1%THC).
CONFLICTODEINTERESESLosautoresnohandeclaradoningúnconflictodeinteresesrealopo-tencialpara laelaboracióndelpresentedocumentoyhanrespondidonegativamenteatodosycadaunodelossiguientespuntos:
a. En los últimos 5 años, he recibido financiamiento desde o he prestado de servicios a alguna institución que pueda beneficiarse o perjudicarse con los resultados de este informe técnico (reembolso por conferencias, presenta-ciones, clases, consultoría, financiamiento de investigaciones);b. Estoy en posesión de acciones de alguna institución que pueda benefi-ciarse o perjudicarse con los resultados de este informe técnico;c. Actué o actúo como perito judicial en alguna causa relacionada con los resultados de este informe técnico;d. Tengo alguna convicción personal relacionada al tema de este informe técnico que podría influenciar los resultados;e. Participo en algún grupo de interés que pueda influenciar los resultados de este informe técnico;f. Tengo sentimientos de antipatía, rivalidad o amigables en relación a al-guna persona cuyos intereses podrían verse afectados por los resultados de este informe técnico;
7. BIBLIOGRAFÍA
-Benbadis S, Sanchez-Ramos J, Bozorg A, et al. Medical marijuana in
neurology. Expert Rev. Neurother. 2014. 14 (12); 1453–65.
- Detyniecki K y Hirsch L. Marijuana Use in Epilepsy: The Myth and the
Reality. CurrNeurolNeurosci Rep. 2015; 15:65.
- Guía básica sobre los Cannabinoides. Sociedad española de investigación
sobrecannabinoides. Facultad de Medicina Universidad Complutense de
Madrid.
- Martínez Orgado JA, Fernández López D, Bonet Serra B, et al. El sistema
cannabinoide y su importancia en el período perinatal. AnPediatr. 2005; 63
(5):433-40.
- Youssef FF, Irving AJ. From Cannabis to the Endocannabinoid System:
Refocussing Attention on Potential Clinical Benefits. West IndianMed J.
2011; 60 (3):264.
- Reddy D y Golub V. The Pharmacological Basis of Cannabis Therapy
for Epilepsy. JPharmacolExpTher. 2016; 357:45–55.
- Yacubian EM, Contreras-Caicedo G y Rios-Pohl L. Tratamiento
farmacológico de lasepilepsias. Academia Latinoamericana de
Epilepsia. 2014.
- Cilio M, Thiele E, Devinsky O. The case for assessing cannabidiol in
epilepsy. Epilepsia. 2014; 55 (6):787–790.
- Rosenberg E, Tsien R, Whalley B, et al. Cannabinoids and Epilepsy.
Neurotherapeutics. 2015; 12:747–68.
- Nota descriptiva. Organización Mundial de la Salud. 2017.
- Informe sobre la epilepsia en latinoamerica. Organización
Panamericana de la Salud.2008.
- Sottano ME, Aberastury M, Silva W, et al. Pronóstico
posthemisferotomía en epilepsiarefractaria de niños y adultos.
Neurologia Argentina. 2016
- Portal de información de enfermedades raras y medicamentos huérfanos.
- Kogan N y Mechoulam R. Cannabinoids in health and disease. Dialogues in
ClinicalNeuroscience. 2007; 9 (4).
- Bagshaw S. Medical efficacy of cannabinoids and marijuana: a comprehensive
review of the literatura. Journal of PalliativeCare. 2002. 18, 2.
- Devinsky O, Cross H, Laux L, etal. Trial of Cannabidiol for Drug-resistant
seizures in the Dravet Syndrome. N Engl J Med. 2017; 376 (21): 2011-20.
- Devinsky O, Marsh E, Friedman D, et al. Cannabidiol in patients with
treatment-resistant epilepsy: an open-label interventional trial. LancetNeurol.
2016; 15 (3):270-8.
- Tzadok M, Uliel-Siboni S, Linder I, et al. CBD-enriched medical cannabis
for intractablepediatric epilepsy. The current Israeli experience. Seizure. 2016
(35):41–44.
- Yap M, Easterbrook L, Connors J, et al.Use of cannabis in severe childhood
epilepsyand child protection considerations. Journal of Paediatrics and
ChildHealth. 2015; 51:491–6.
- Gloss D, Vickrey B. Cannabinoids for Epilepsy. Cochrane database of
systematic review. 2014. 3; 1-23.
- Koppel B, Brust J, Fife T, et al. Systematic review: Efficacy and safety
of medicalmarijuana in selected neurologic disorders. Report of the Guideline
DevelopmentSubcommittee of the American Academy of Neurology. American
AcademyofNeurology. 2014. 82: 1556-63.
- Ames F, Cridland S. Anticonvul-sant effect of cannabidiol. South African Medical
Journal. 1986. 69:14.
Carlini E, Cunha J. Hypnotic and Antiepileptic Effects of Cannabidiol. TheJournalo
fClinicalPharmacology. 1981. 21(1): 417-27.
- Cunha J, Carlini E., Pereira A., et al. Chronic administration of cannabidiol to
healthyvolunteers and epileptic patients. Pharmacology 1980. 21: 175-85.
- Mechoulam R, Carlini E. Toward drugs derived from Cannabis.
Naturwissenschaften. 1978. 65: 174-9.
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. The health effects
ofcannabis and cannabinoids: The current state of evidence and
recommendations forresearch. TheNationalAcademiesPress. 2017.
- Soto N, Pichon-Riviere A, Augustovski F, et al. Cannabinoides para el
tratamiento de la epilepsia refractaria. Instituto de Efectividad clínica
y Sanitaria. Noviembre 2016.Disponible en: https://clinicaltrials.gov
- Press C, Knupp K y Chapman K. Parental reporting of response to oral cannabis
extracts for treatment of refractory epilepsy”. EpilepsyBehav. 2015; 45:49-52.
- Hussain S, Zhou R, Jacobson C, et al. Perceived efficacy of cannabidiol-enriched
cannabis extracts for treatment of pediatric epilepsy: A potential role for
infantile spasms and Lennox–Gastaut syndrome. EpilepsyBehav. 2015; 47:138-41.
- Mathern G, Beninsig L and Nehlig A. Fewer specialists support usin medical
marijuana and CBD in treating epilepsy patients compared with other medical
professionals and patients: Result of Epilepsia’s survey. Epilepsia. 2015; 56(1):1–6.
- Porter B and Jacobson C. Report of a parent survey of cannabidiol-enriched
cannabis use in pediatric treatment-resistant epilepsy. EpilepsyBehav. 2013; 29(3):574–77.
- Consroe PF, Wood GC, Buchsbaum H. Anticonvulsantnature of marihuana
smoking. JAMA. 1975 Oct 20; 234(3):306-7.
- Lorenz R. On the application of cannabis in paediatrics and epileptology.
NeuroendocrinolLett 2004; 25 (1/2):4–44.
- Mortati K, Dworetzky B, Devinsky O. Marijuana: an effective antiepileptic
treatment in partial epilepsy? A case report and review of the literature.
RevNeurolDis. 2007; 4(2):103-6.
- Ladino LD, Hernández-Ronquillo L, Téllez-Zenteno JF. Medicinal Marijuana
for Epilepsy: A Case Series Study. Can J NeurolSci. 2014; 41: 1-6.
- Saade D, Joshi C. Pure Cannabidiol in the Treatment of Malignant Migrating
Partial Seizures in Infancy: A Case Report. PediatrNeurol 2015; 52: 544-7.
- Rosemergy I, Adler J, Psirides A. Cannabidiol oil in the treatment of super
refractory status epilepticus. A case report. Seizure. 2016; 35: 56–8.
- Geffrey AL, Pollack SF, Bruno PL, and Thiele EA. Drug–drug interaction
between clobazam and cannabidiol in children with refractory epilepsy. Epilepsia.
2015; 56(8):1246–51.
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REGISTRO DE ESTABLECIMIENTOSY DE ESPECIALIDADES MEDICINALESDURANTE EL PRIMER SEMESTRE 2017Margarita Melgarejo, Roberto Sierras.Dirección de Gestión de Información Técnica (DGIT).Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología médica.
INTRODUCCIÓN
ElDecretoN°1271/13apruebalanuevaestructuraorganizativadelaAdministraciónNacionaldeMedicamentos,AlimentosyTecnologíaMédica(ANMAT)ycrealaDireccióndeGestióndeInformaciónTécnica.EntrelasfuncionesdeestanuevaDirecciónsedestacalatareademanteneractua-lizadoslossistemasregistralesdelaAdministraciónNacionalenloreferentea:RegistrodeEspecialidadesMedicinales(REM),elRegistroNacionaldeProductoresyProductosdeTecnologíaMédica(RPPTM)yelRegistrodeEstablecimientos,entreotros.Serealizanperiódicamenteinformesdegestión,analizandoprocesosintegralesquepermitenlatomadedecisionesamparadosenelparadigmadela ciencia regulatoria.Paralarealizacióndeestetrabajosetomaronlosdatosregistralesdelprimersemestredelañoencurso,enloreferentealainscripcióndeestable-cimientosydeespecialidadesmedicinales.
REGISTRO DE ESTABLECIMIENTOS
Encuantoalainscripcióndeestablecimientossegestionaronuntotalde418habilitaciones,delascualesungrupocorrespondeanuevashabi-litaciones,elotrogrupoaautorizacionesdemodificacionesensuestructuraediliciay,porúltimo,abajasdehabilitacionesdeestablecimientostantolasdeoficiocomoapedidodeltitular(Figura1).
Figura 1. Habilitación,modificaciónybajadeestablecimientos.
Nuevas habilitaciones de establecimientosEstegrupofuecategorizadoenlossiguientesrubros:especialidadesmedicinales,productosdehigienepersonal,cosméticosyperfumes,productomédicoytránsitointerjurisdiccionaldemedicamentosyproductosmédicos(Figura2).
Figura 2.Nuevashabilitacionesdeestablecimientoscategorizadasporrubros.
Modificaciones en la estructura ediliciaEstegrupofuecategorizadoenlossiguientesrubros:especialidadesmedicinales,productosdehigienepersonal,cosméticosyperfumes,productomédicoytránsitointerjurisdiccionaldemedicamentosyproductosmédicos.(Figura3).
Figura 3. Modificacióndelaestructuradeestablecimientoscategorizadaporrubros.
ESTADODESITUACIÓN
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REGISTRO DE ESPECIALIDADES MEDICINALES (REM)
Categorización por Ingredientes Farmacéuticos Activos (IFAs)DuranteelprimersemestredelañoencursoseinscribieronenelREMuntotalde151certificados.SecategorizaronterapéuticamentelosIFAs,segúnlaclasificaciónATC2017(Figura4).
Figura 4.IFAsenelREMsegúnclasificaciónATC2017.Expresadosencantidaddeespecialidadesmedicinalesinscriptas.
Altas de comercialización en el vademécum nacional de medicamentosLaespecialidadmedicinal,luegodesuinscripciónenelREM,parasercomercializadadebeteneraprobadalaverificacióntécnicadelprimerlote.Posteriormente,eltitulardelregistrosolicita,mediantedeclaraciónjurada,elaltaenVNM,previaverificacióndeladocumentacióncorrespon-diente.Secategorizaronterapéuticamente,segúnclasificaciónATC2017,aquellosIFAsquepasanalestadodecomercializados(Figura5).
Figura 5.AltasdecomercializaciónenVNM.IFAscategorizadosporclasificaciónATC2017.Expresadaencantidaddeespecialidadesmedicinales
Figura 6.IFAsenelREMsegúnclasificaciónATC2017.Altasdecomercialización,IFAscategorizadosporclasificaciónATC2017.
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Secruzanambosgráficoscomparandolosdiferentesgruposterapéuticosmásregistradosymáscomercializados.Duranteelañoencurso,ensuprimersemestre,sepuedeapreciarlastendenciasenlosdiferentesgruposfarmacológicos,enloquerespectaalainscripciónenelREMcomparandoconlasaltasdecomercialización.SeobservaqueelgrupodeAGENTESANTINEOPLÁSICOSEINMUNOMO-DULADORESlideranambosrankings.Esdecir,seinscribenysecomercializanconmayorproporciónenrelaciónalosotrosgruposterapéuticos.Sinembargo,elgrupodelosproductosANTIINFECCIOSOSDEUSOSISTÉMICOseinscribenenelsegundolugar,perosecomercializaeneltercerlugar.EncuantoalgrupoTRACTOALIMENTARIOYMETABOLISMOsecomercializaensegundolugar,peroseinscribenensextolugar.Sepodríainferirqueseencuentraninscriptosdesdehacetiempo,peroseleotorgaelaltadecomercializaciónenelmercadoenmayorcantidadcuandoselocomparaconsuinscripción(Figura6).
Categorización por origen y fuente de obtención del IFAElconjuntodeIFAsinscriptosenelREM,secategorizaronporeldatoidentificatoriocaracterísticoquefiguraenelcertificadodeinscripcióncomoorigenyfuentedeobtención.ElgrupoconmayorinscripciónenelREM,correspondealosIFAsdeorigensintético/semisintético(Figura7).
Figura 7.CategorizaciónpororigenyfuentedeobtencióndelIFA.Expresadoencantidaddecertificados
Categorización de especialidades medicinales según encuadre legalElencuadrelegalestablecidoporelDecretoN°150/92(t.o.1993)ensusartículos3°,4y5°querespectivamentecorrespondenaespecialidadesmedicinalesdeelaboraciónnacional,importadasynovedadesterapéuticas.Existenafeccionesconmuybajaprevalenciaperoconseriasconsecuenciasparaelpacienteysuentornofamiliarconocidascomoenfermedadespocofrecuentes.Enelplanointernacionalalosmedicamentosdestinadosaestetipodeenfermedadesselosdenomina“medicamentoshuérfa-nos”o“drogashuérfanas”.Estetipodeespecialidadesmedicinalesseregistran“bajocondicionesespeciales”.Elcertificadodeinscripciónotorga-dotieneunavigenciadeentreseismesesydosaños.SonmásconocidascomoRegistrosEspecialesdeloscualesseconsignaronsoloespecialida-desmedicinalesimportadas.(Figura8)
Figura 8.CategorizacióndeespecialidadesmedicinalessegúnencuadrelegalExpresadoencantidaddecertificadosinscriptos
Especialidades medicinales importadasSeobservaquelasmayoresfrecuenciasdeespecialidadesmedicinalesimportadasprocedendeAlemaniaenprimerlugar,EEUUensegundolugaryEspañaentercerlugar,siguiendoCanadáeIrlandaencuartoyquintolugar(Figura9).
Figura 9.Especialidadesmedicinalesimportadasporpaísdeorigendeimportación.Expresadoencantidaddecertificadosinscriptos
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Categorización según condición de expendioElmayorporcentajecorrespondealacondicióndeventabajorecetayensegundolugarventabajorecetaarchivada.ElREMcontienelosreactivosdediagnósticodeusoinvivocomo,porejemplo,lospreparadosradiofarmacéuticosparausoterapéuticoodiagnós-tico.Nosondeventaalpúblico,sinoqueselosautorizaparasudispensaciónenunidadesdemedicinanuclear.Esporestarazónqueselosincluye,aunquenoesténcontenidosenlascondicionesdeexpendioqueespecificalaLeyNº16.463(Figura10).
Figura 10. Categorizacióndeespecialidadesmedicinalessegúncondicióndeexpendio.Expresadoencantidaddecertificadosinscriptos.
Cancelaciones de Certificados inscriptos en el REMDeuntotalde483cancelacionesdecertificadosinscriptosenelREMsediferencianlascancelacionesdeoficiodeaquellasquefueronasolicituddeltitulardelregistro(Figura11).
Figura 11. CancelacionesdeCertificados
Autorización de certificados en el REMEstegráficocorrespondealacantidaddeautorizacionesdecertificadosinscriptosenelRegistropormesdeesteprimersemestredelcorrienteaño.Seinscribieronuntotalde151certificados(Figura12).
Figura 12. EvoluciónmensualdeautorizacionesdecertificadosenelREM
Comparación del primer semestre del año 2016 versus el primer semestre del año 2017 SecomparalacantidaddeautorizacionesdecertificadosinscriptosenelRegistroencadamesdeesteprimersemestredelcorrienteañocontralasregistradasenelprimersemestredelaño2016.(Figura13)
Figura 13. Comparativadelaevoluciónmensualdeautorizacionesdecertificadosdeespecialidadesmedicinalesentreprimersemestrede2016vsprimersemestre2017.
CONCLUSIONESAtravésdeestetrabajopodemosvisualizarlagestióndeprocesostransversalesenloreferentealainscripcióndenuevosestablecimien-tosymodificacionesdesusestructuras;comoasítambiénlosmovi-mientosenelRegistrodeEspecialidadesMedicinales.Conrespectoalasbajasdeestablecimientosycancelacionesdecerti-ficados,tantodeoficiocomoapedidodesutitular,permitemantenerelcontrolsistemáticoenlossistemasregistralesdelOrganismo.Esimportantedestacarelanálisisefectuadoalasespecialidadesmedi-
cinalesinscriptasenelREMcomoasítambiénaquellasquepasaronalacondicióndecomercializadas,cuyosIFAssecategorizaronporgrupoterapéuticosegúnlaClasificaciónATC2017.Comoconsecuenciadeprocesarestainformaciónsabemoscuáleselgrupoterapéuticoconmayorinscripciónyelquemayorincidenciatuvoenelcambiodees-tadodecomercialización.Comoasítambiénunacomparaciónmesamesdelmismosemestredelaño2016versuselaño2017.
Fuentes:RegistrosdeEstablecimientos,REM,VNMeInformesdeGestióndelaDGIT.
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CONTROL DEL MERCADO ARGENTINODE ESPECIALIDADES MEDICINALESQUE CONTIENEN ORLISTATMaría P. Álvarez, Alejandra Genoud, Eduardo E. Saint Martin, Matías E. Gomez, Marta E. Spinetto.Servicio de Desarrollo y Validación, Departamento de Química y Física, Instituto Nacional de Medicamentos, Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica.Contacto:mpalvarez@anmat.gov.ar
INTRODUCCIÓN
Orlistat es un principio activo diseñado para el tratamiento de laobesidad. Previene la absorción de grasas ingeridas en la dieta y de ese modo se reduce la ingesta calórica. El mecanismo de acción consiste en lainhibicióndelalipasapancreática,enzimaquehidrolizatriglicéridosen ácidos grasos absorbibles en el intestino y, en consecuencia, seexcretan sin digerir.ElobjetivodeestetrabajofuellevaracaboelcontroldemercadodelasespecialidadesmedicinalesautorizadasenelterritorionacionalquecontienenOrlistatcomoprincipioactivo,encápsulasocomprimidos.LamonografíaseencuentracodificadaenFarmacopeadeEstadosUnidos,edición38(USP38)paramateriaprimayproductoterminado.
Productos farmacéuticos, reactivos químicos materias primas y estándares de referencia: Acetonitrilo grado HPLC TEDIA, aguacalidadMiliQ,ácidofosfórico85%PASintorgan, Orlistatmateriaprima,OrlistatUSP(LoteGOL008)estándardereferencia,OrlistatCompuestoRelacionado D (Lote GOL 570), excipientes: celulosa microcristalina,dióxido de silicio coloidal, estearil fumarato de sódio, carboximetilalmidón,laurilsulfatodesodio,lactosa,almidóndemaízpregelatinizado,maltosa,estearatodemagnesio,croscaramelosasódica,polisacáridodesoja,caolíncoloidal.Instrumental: Se utilizó un cromatógrafo con detector de arreglo dediodos Shimadzu Serie 10, balanzas analíticas Ohaus Analytical Plus,sonicador TestlabTB04TA,unagitadormecánicoIKAKS260.Control de mercado:Seanalizaronsieteproductosquecorrespondenaseislaboratorios(nombradosconletrasdelaAalaF):laboratoriosAyBOrlistat60y120mg/cápsula,laboratoriosCyDOrlistat120mg/cápsula,laboratorioEOrlistat60mg/cápsulayellaboratorioFOrlistat120mg/comprimido.Método analítico: Se utilizó la monografía codificada en USP38.La identificación del principio activo se realizó según el ensayo de
MATERIALES Y MÉTODOS
valoración.Dichoensayoserealizómedianteunaeluciónisocráticaconunamezcla de acetonitrilo: ácido fosfórico: agua (860:0.05:140), unacolumnadeoctadecilsilano(PhenomenexC18(2)150mmdelargox3.9mmdediámetrointernoy5μmdetamañodepartícula;flujo1,0ml/min;longituddeondadedetección195nm;volumendeinyección20µlytemperatura30°C.Lasconcentracionesdetrabajoparaestándarymuestrafueron0.6mg/mLenfasemóvil.ParalacuantificacióndelasimpurezasOrlistatopen-ringepimer,Orlistatopen ring, Orlistat compuesto relacionado D, Hexil undecil piranona,Henicosenilleucinatoyotrasimpurezasidentificadasonoidentificadas,seutilizaronlasmismascondicionescromatográficasqueenelensayodevaloraciónyunasolucióndeadecuaciónquecontenía5x10-4mg/mLdelcompuestorelacionadoDy0.6mg/mLdeOrlistatestándardereferenciaenfasemóvil.Laresoluciónentreamboscompuestosdebesernomenora1,4.SellevóacaboelmétododeuniformidaddeunidadesdedosificaciónsegúnlineamientosdelaUSP39.Verificación del método analítico: Para evaluar la especificidad frente a placebo se realizaron muestras sintéticas con los excipientes de cada una de las fórmulas sin el principio activo. Se evaluó la ausencia de picos en el tiempo de retención que corresponde al tiempo de retención del Orlistat.Para determinar la exactitud se prepararon muestras sintéticas en los siguientes niveles:70,100 y 120%. Se analizaron por triplicado a partir de tres pesadas independientes. Se determinó la cantidad recuperada del principio activo en las dos formas farmacéuticas.
RESULTADOS
Verificación del método analítico: Elmétodo permite una adecuadaresolucióndelospicosdeCompuestorelacionadoDyOrlistatestándarde referencia.Noseobservaronpicosenelcromatogramadelplaceboquepudieraninterferirconlaidentificacióny/ovaloracióndelpicodeOrlistatniconlacuantificacióndeimpurezas.
Losresultadosdelensayodeexactitudparacápsulasfueron:Nivel70%:99,7%conunRSD%:0,4;Nivel100%:100,2conunRSD%:0,1;Nivel120%:98,6%conunRSD%:0,5.Los resultadosdel ensayodeexactitudpara los comprimidos fueron:Nivel70%:100,7%conunRSD%:0,1;Nivel100%:100,7conunRSD%:0,4;Nivel120%:100,3%conunRSD%:0,4.
Laboratorio A B C D E F
Dosis (mg) 60 120 60 120 120 120 60 120Valoración 94.6 101.2 97.1 97.1 94.9 97.0 100.7 102.2
Uniformidad de unidades dedosificación
L1: 9.0 L1: 4.9 L1: 4.7 L1: 8.4 L1: 10.3 L1: 6.6 L1: 6.6 L1: 9.9
A B C D E F
Orlistatopen ringepimer≤
1.5%ND ND ND ND ND 0.3 ND 0.6
Orlistat CompD≤1.0%
ND ND <0.1 0.1 ND ND <0.1 0.3
Otras impurezas identificadas≤0.3%
0.2 0.3 0.2 0.3 0.3 0.1 0.3 0.3
Tabla 1:Valoracióncomoporcentajerespectoalvalordeclarado(Especificación:90.0–110.0)yuniformidaddeunidadesdedosificación(EspecificaciónL1:15.0).
Tabla 2:Cuantificacióndeimpurezas(ND:Nodetectable)
CONCLUSIONES
Todos los productos analizados demostraron su calidad al cumplircon las especificaciones de los ensayos de Identificación, Valoracióny Sustancias Relacionadas establecidas en USP38. Los métodos decontrolresultaronsersimples,específicos,exactos,precisosydemuyfácilimplementación,permitiendounarápidaidentificaciónyvaloracióndelprincipioactivoOrlistatparacápsulasycomprimidos,asícomounacorrectacuantificacióndeimpurezas.EstetrabajoseenmarcadentrodelamisiónfundamentaldelaANMAT
VIGILANCIADEMERCADO
Control de mercado: El ensayo de identificación para todas lasespecialidadesmedicinalesanalizadasresultópositivoparaOrlistat.En las Tablas 1 y 2 se observan los resultados de los ensayos devaloración,uniformidaddeunidadesdedosificacióneimpurezas.
deevaluarlaseguridad,calidadyeficaciadelosproductosparalasalud.Es dentro de este marco donde interviene el Laboratorio Nacional de Control aldeterminar la calidadde lasespecialidadesmedicinalesdelmercadonacionalconelobjetivodegarantizarmedicamentosseguros,eficacesydecalidad.
BIBLIOGRAFÍA
- United States Pharmacopeia, Edition 38, Monograph: Orlistat. Orlistat
capsules; 2015.
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OPTIMIZACIÓN DEL ANÁLISIS DE MUESTRAS MEDIANTE INCORPORACIÓN DE LA TÉCNICA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTAPERFORMANCE ULTRARRÁPIDAMarcela I. García*, Nadia S. Villar*, María C. De Angelis*, Matías E. Gómez, Eduardo Saint Martin, Marta Spinetto.Servicio de Analítica de Medicamentos. Departamento de Química y Física, Instituto Nacional de Medicamentos.Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica. Contacto:analitica@anmat.gov.ar*Estos autores contribuyeron equitativamente al desarrollo de este trabajo.
INTRODUCCIÓN
ElMinisteriodeSaludde laNacióncuenta condiferentesprogramasdestinados a la provisión gratuita demedicamentos, entre los cualesse encuentra el Programa Nacional de Salud Sexual y Procreación Responsable (PNSSyPR). Elmismo fue creado por la Ley NacionalNº25.673conelfindecontribuiramejorarlaestructuradeoportunidadesparaelaccesoaunaatenciónintegraldelasaludsexualyreproductiva.DurantelosúltimostreceañoselDepartamentodeQuímicayFísicadelLaboratorioNacionaldeControldelInstitutoNacionaldeMedicamentos(INAME) recibió aproximadamente 500 lotes de especialidadesmedicinales provenientes del PNSSyPR para ser evaluados medianteprocedimientos de control de calidad antes de ser distribuidos en elterritorio Nacional.
Figura 1. Estructuraquímicadelasespecialidadesmedicinalesempleadasenlosensayos.
OBJETIVO
DisminuireltiempoanalíticoutilizandounametodologíadecromatografíalíquidadealtaperformanceultrarrápidaafindedarrespuestaeficienteyseguraalosrequerimientosimpartidosporelMinisterio de Salud de la Nación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Seutilizó un cromatógrafo líquido ultra rápido SHIMADZUNEXERA,UHPLC (Sistema bombas binario LC-30AD, Horno de columnasCTO-30A, Desgasificador DGU-20A3R, Inyector automático SIL-30AC, Detector PDA SPD-M20A), columnas cromatográficas 50mm x 2,1 dp 2,2y 1,9 µm (Shimi-pack; Hypersil gold y Reprosil Gold).Cromatógrafo líquido Hewlett Packard 1100 HPLC (Sistema bombacuaternarioG1311A,DesgasificadorDGU-20A3R,InyectorautomáticoG1313A,DetectorVWDG1314A),columnasde150mmx4,6,dp5µm (Supelcosil, Hypersil). SolventesAcetonitrilo HPLC yAgua calidadHPLC,microbalanzaSartorius,estándaresprimariosdeUSPyEP.Comobaseparaeldesarrollo seemplearon lasmetodologíascodificadasenFarmacopea Británica de los mencionados principios activos, en lascualesfiguralarealizacióndelosensayosporHPLC.LasmetodologíasdesarrolladasyvalidadasporUHPLC,correspondenamétodosisocráticosenfasereversaparalocualseempleancolumnascromatográficasdeC-18encapadade50mmde longitudx2,1mm,diámetrodepartícula 2,2y 1,9µm.Como fasemóvil se empleaunamezcla de aguay acetonitrilo, la temperatura del horno semantieneen 38ºC y la longitud de onda de lectura es de 215 nm y 240 nm,dependiendo la técnica. Estosmétodospermiten la cuantificacióndelosprincipiosactivosEtinilestradiolyLevonorgestrelen lassiguientespresentaciones:-Etinilestradiol0,03mg/Levonorgestrel0,15mgporgragea;-Levonorgestrel0,75mgporgragea/comprimido,-Levonorgestrel0,03mgporgragea.
Porotrolado,sellevóacaboeldesarrolloylavalidacióndeunmétodoisocrático por UHPLC para la cuantificación del principio activoDesogestrel,queingresaenlaformaDesogestrel0,075mgporgragea.ParaestoseemplearoncolumnascromatográficasdeC-18encapadade100mmdelongitudx4,0mm,diámetrodepartícula2,2micrometros.La fasemóvil empleada fue unamezcla demetanol y agua (98:2), latemperaturadelhornofue38ºCylalongituddeondadelecturafuede210nm.
RESULTADOS
Durante la puesta a punto de lasmetodologías y las validaciones seevaluaron losatributosdeespecificidad frenteaposiblesdegradadossometiendoalactivo,alproductoyalosplacebosposiblesacondicionesde stress(ácida,básica,oxidativa,reductora,térmicayfotolítica),seevaluóla linealidad de losmétodos entre el 50%-150%de la concentraciónde trabajo, la precisión del sistema, la repetibilidad, la exactitud y laretención en filtros (Nylon, teflón, viales autofiltrantes). Se evaluó larobustez de losmétodos realizandomodificaciones deliberadas en laconcentración del solvente orgánico en la fasemóvil,modificando lacolumnacromatograficaenlotedeunaydiferentesmarcas,yvariandolatemperaturadelhornoyelflujodefasemóvil.En todos los casos se pudo corroborar que, con los métodosdesarrollados,seobtienelaseparaciónlosprincipiosactivosdetodoslos posibles degradados, así como también de los excipientes quepudiesenestarpresentes.Todoslosmétodosmostraronserprecisosyexactos.Además,lasmodificacionesenlascondicionescromatograficasllevadas a cabo no afectaron los resultados.Con latecnologíadeCromatografia líquidaUltraRápida,se logróunadisminución en los tiempos de corrida cromatográfica en un 70%,pasandodecorridasde10minutosporHPLCa3minutosporUHPLC.Estos números se traducen en una mayor capacidad de análisis demuestrasporjornadalaboral,pudiendoseranalizados7lotes(UHPLC)enlugarde2(HPLC).Por HPLC, realizar el ensayo de Uniformidad de Unidades deDosificacionporContenidopara7lotes,deestosproductos,requiere3días consecutivosde trabajo,mientrasqueporUHPLC se requieresólo uno.EnlasFiguras2y3semuestranlosperfilescromatográficosobtenidosmedianteambastecnologías.
Levonorgestrel
Etinilestradiol
C22H30O M 310,47
Desogestrel
C21H26O2 M310,437
Gestodeno
C22H30OM310,47
Desogestrel
Etinilestradiol
Levonorgestrel
C20H24O2
C21H28O2
ARTICULOSDEGESTIÓN
Larelevanciaquetieneestaclasedemedicamentoseneláreadelasaludconllevalareponsabilidadinherentederesponderaestosrequerimientosentiempoyforma.Porestemotivo,yconelfindeoptimizarlostiemposdeanálisisylaproductividad,setrabajóeneldesarrolloylavalidaciónde metodologías de análisis empleando la técnica de CromatografiaLíquida Ultra Rápida (UHPLC) para las siguientes especialidadesmedicinales anticonceptivos: Etinilestradiol 0,03 mg/Levonorgestrel0,15mgporgragea;Levonorgestrel0,75mgporgragea/comprimido;Levonorgestrel0,03mgporgragea;Etinilestradiol0,02mg/Gestodeno0,075mgporcomprimidosyDesogestrel0,075mgporcomprimidos (Fig.1)
Figura 2. CromatogramaestándardereferenciaUHPLC
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Figura 3.CromatogramaestándardereferenciaHPLC
En el año 2014, con la implementación de las metodologías antesmencionadassepudoreducireltiempoylossolventesrequeridosparasuanálisistalcomosemuestraenlaTabla 1.
Análisis de 1 lote deproducto
Método porHPLC Método por UHPLC
Tiempo requerido 200 min 60 min
Consumo de solventeorgánico 100 ml 6 ml
Tabla 1. EnsayodeUniformidaddeUnidadesdeDosificación
Se observó que los resultados son óptimos con una disminución delconsumodesolventesnocivosparaelmedioambienteenun94%;dadoqueconestanuevatecnologíaseempleanflujosdealrededorde0,2ml/min,mientrasqueporHPLCseempleancomúnmenteflujosentre1y2ml/min.EnlaFigura4semuestracomoresultóafectadoelconsumodesolventeylostiemposdeanálisisalemplearestanuevatecnología(UHPLC)paraelanálisisdeltotaldelotesingresadosdurantelosaños2014y2015respectodelosrequeridosparallevaracabolosensayosporHPLC.
0
5000
10000
15000
Tiempo requerido de ensayo
HPLCUHPLC
010002000300040005000600070008000
Consulmo de Solvente (ml)
HPLCUHPLC
Lotes analizados en 1 año: 68 Lotes analizados en 1 año: 68
Figura 4. ComparativadetiemposrequeridosyconsumodesolventeentrelastécnicasdeHPLCyUHPLCparaelanálisisdelotesmedicinalesingresados2014y2015.
CONCLUSIONES
La adquisición de los equipos de Cromatografia líquida Ultra Rápida(UHPLC) y el desarrollo de las metodologías para el análisis de losproductosdelPNSSyPRpermitióaumentarlaproductividadyacelerarlos tiempos de respuesta requeridos por el Ministerio de Salud dela Nación a fin de proceder a la distribución de los anticonceptivosalcanzadosporelprograma,demaneraeficienteysegura,ygarantizandoa la comunidad el acceso a una medicación de calidad. Lavirtudde la técnicano sólo radicaen la reducciónde lostiemposde análisis, sino que además permite optimizar recursos humanos yequipamientodadoque, talcomosemostró, lacapacidaddeanalizarsietelotesdeproductopordía,empleandounúnicocromatógrafodeUHPLCpermite contar con ladisponibilidadde losotrosequiposdelDepartamentodeQuímicayFísicaparalaresolucióndeotrasmuestras.
BIBLIOGRAFÍA
- Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología
Médica. Farmacopea Argentina, edición 7; 2013.
- Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. Validación
de Métodos Analíticos; 2001.
- European Pharmacopoeia Commission. Farmacopea Europea, edición
8; 2013.
- Quattrocchi OA; de Andrizzi ZA; Laba RF. Introducción a la HPLC
Aplicación y Práctica; 1992.
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