identificación bioquímica de bacterias gram negativas

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS,

BACTERIAS PIOGENAS GRAM NEGATIVAS Y

Pseudomonas

Mblgo. Max Siadén Ortega.MICROBIOLOGÍA 2014 II

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

COCOS BACILOS

Son los más abundantes

Bacilos Gram NegativosAerobios o Facultativos

Familia Vibrionaceae

Familia Enterobacteriaceae

Familia Aeromonaceae

Familia Campylobacteriaceae

Familia Helicobacteriaceae

Familia Pseudomonaceae

Familia Pasteurellaceae

FAMILIA ENTEROBACTERIA

CEAE

Responsables del 30 a 35 % de todas las septicemias, Más del 70 % de todas las infecciones del tracto urinario y Muchas infecciones intestinales.

Varios pertenecen a la flora intestinal normalOtros están asociados a infecciones entéricas Otros a procesos infecciosos (especialmente cuando estas bacterias invaden otros órganos o sistemas

Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal, de un portador sano, o de la diseminación endógena de la bacteria en un sujeto susceptible, pudiéndose ver afectados casi cualquier órgano del cuerpo

Familia Enterobacteriaceae…

Género Escherichia Género Klebsiella Género Salmonella Género Shigella Género Citrobacter Género Enterobacter Género Morganella Género Proteus Género Serratia Género Yersinia

Es el grupo más grande y heterogéneo de bacilos Gram negativos con importancia

clínica…

Estos géneros se han clasificado según sus propiedades bioquímicas (baterías

bioquímicas), estructura antigénica (serotipificación) e hibridación y

secuenciación de su material genético…

A pesar de la complejidad de la familia menos de 20 especies son responsables de

más del 95% de las infecciones…

• AGUA, TIERRA, PLANTAS, TRACTO G.I.

HOMBRE Y ANIMALES

• PRESENCIA EN AGUA INDICA

CONTAMINACIÓN FECAL

• UBICUAS (Klebsiella) O DE DISTRIBUCIÓN

LIMITIDA (Salmonella typhi)

HÁBITAT

BACILOS RECTOS, 0,4-0,6 X 2-3

µm, GRAM NEGATIVOS

NO ESPORULADOS,

ANAEROBIOS FACULTATIVOS,

MÓVILES O INMÓVILES

(Klebsiella , Shigella y Yersinia)

FERMENTAN GLUCOSA,

CATALASA POSITIVOS, OXIDASA

NEGATIVOS (ausencia de citocromo

oxidasa)

CARACTERÍSTICAS

MEDIOS DE AISLAMIENTO PRIMARIO

Pueden ser de capacidad:• moderada (como en EMB y McConkey),• alta (como en SS, desoxicolato y citrato) • completamente específica (sulfato de bismuto y verde brillante).

Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde un principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa (como Salmonella y Shigella)

En medios selectivos

Agar MacConkey • Es un medio diferencial selectivo que permite distinguir entre

enterobacterias que hidrolizan lactosa y las que no lo hacen.

La hidrólisis de la lactosa produce ácidos orgánicos y las colonias que la hidrolizan adquieren un color rojo.

Las colonias lactosas negativas permanecen incoloras aunque el medio vira a amarillo por la subida de pH que origina la utilización de las proteínas (peptona) del medio.

• INDICADOR DE pH: ROJO NEUTRO.

• Las sales biliares y el cristal violeta lo hace selectivo

Sin crecimiento Escherichia coli: en Mc Conckey

MC CONKEY

Escherichia coli: en XLDXILOSA, LISINA, DESOXICOLATO

Utilización de azúcares: Xilosa, Lactosa y Sacarosa, TIOSULFATO: producción de H2SLISINA: la descarboxilación a cadaverina

MEDIO EMB: Eosina azul de metileno

El colorante de anilina(Eosina y azul de metileno) inhiben bacteria Gram (+) y a las Gram (-) exigentesBacterias fermentadoras de lactosa da colonias de color verdoso con brillo metálicoNo fermentadoras de lactosa Transparentes

Medios diferenciales

Son aquellos que se ponen de manifiesto las propiedades metabólicas de los microorganismos frente a diferentes substratos y que permiten observar una, dos o más características metabólicas de la bacteria inoculada.

TSIAgar hierro

triple azúcar

LIA (Agar hierro lisina)

MIO Movilidad indol ornitina

CITRATO DE SIMMONS

TSI(Triple Sugar Iron)

• capacidad de la bacteria para fermentar los carbohidratos.

• También se detecta la producción de H2S.

• Producción de gas.

Tipo de siembra por picadura y en estría.

Contiene: glucosa, sacarosa, lactosa, hierro y un indicador de pH (ROJO FENOL).

Permite conocer

• K: si el medio se mantuvo ROJO (color inicial, alcalino).• A: si el medio se volvió ácido (color amarillo). • G: si forma burbujas.• H2S: si forma acido sulfurico.

– (K/A) Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.

– (A/A) Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el Microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.

– (K/K)Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.

– G)La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.

– (H2S) El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

• EJM: E. coli: A/A Producción de gas: +, Produccion de H2S: -

LECTURA

Contiene lisina, sales de fierro, glucosa y un indicador de pH Púrpura de Bromocresol

LIA Agar Hierro Lisina

• la descarboxilación y desanimación oxidativa de la lisina.

• la producción de H2S

• Fermentación de la glucosa.

Tipo de siembra por picadura y estría

Permite conocer

• Descarboxilación o desanimación de la lisina

LISINA CADAVERINA (amina - alcalino)

• Producción de Ac. Sulfhídrico.

• Fermentación de la glucosa

• El medio es de color amarillo (ácido), pero si utiliza lisina, entonces alcaliniza el medio y lo vuelve violeta.

Ejm: Salmonella typhi: Lisina descarboxilasa +, Proteus sp: desamina

La descarboxilación da color violeta (alcaliniza)

La desanimación color rojo (acidifica)

LECTURA

DESCARBOXILASA

1. LDC -, NO H2S, PRODUCTORA GAS.

2. LDC + ó -, PRODUCTORA H2S Y GAS.

3. LDC - , NO H2S, PRODUCTORA DE GAS

Descarboxilación de aminoácidos(arginina, lisina, ornitina)

Contiene citrato de sodio como fuente de carbono, fosfato de amonio como única fuente de fosfato y un indicador de pH Azul de bromotimol

CITRTATO DE SIMONS

• Utilización del citrato de sodio (fermentación) con la producción de subproductos alcainos

Tipo de siembra por picadura y estría

Permite conocer

LECTURA

• El color azul intenso indica Citrato (+) e indica que el microorganismo ha sido capaz de utilizar el citrato con formación de subproductos alcalinos

• si el medio continua verde es citrato (-)

Ejm: E. coli (+)Enterobacter sp (-)

Medio semisólido, contiene ornitina, triptófano y glucosa.

• movilidad de la bacteria.

• Descarboxilación de la ornitina.

• Producción de indol a partir del triptófano.

• Fermentación de la glucosa.

Tipo de siembra por picadura con asa recta

Permite conocer

MEDIO MIOMovilidad indol ornitina

Se observa la motilidad sin sulfuros en el medio semi-sólido . En el centro del tubo se observa el eje de siembra y en la periferia de este eje se observa el movimiento de las bacterias hacia el resto del medio. A manera de comparación, justo al final del tubo donde no llega el eje de crecimiento (la punción) no se observa crecimiento, en comparación con el resto del medio que se observa opaco. MOTILIDAD +. SULFUROS -.

LECTURA - MOTILIDAD

Producción de sulfuros, a partir del tiosulfato de sodio presente en el medio.

La prueba positiva se observa un precipitado negro en el medio de cultivo donde creció la bacteria.

Adicionalmente se observa la motilidad de la bacteria que ha sido sembrada por punción en este medio semi-sólido.

Se observa el movimiento de las bacterias que crecen a manera de sombrilla al rededor del eje de siembra.

LECTURA – PRODUCCION DE SULFUROS

Se observa la capacidad de la bacteria para desdoblar el triptófano por medio de la enzima triptofanasa que hidroliza y desamina al triptófano en: INDOL + Acido pirúvico + Amoniaco.

Al adicionar el reactivo de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldehido) sobre el medio cuando hay producción de Indol se forma un anillo rojo (tubo de la derecha) Indol (+).

De lo contrario se forma un anillo amarillo (tubo del centro y la izquierda) Indol (-).

Ejm: E. coli (+)klebsiela pneumoniae (-)

LECTURA – PRODUCCION DE INDOL

Producción de sulfhídrico

• Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno (sulfhídrico) a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato.

• La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un precipitado negro de FeS

• Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato de metionina y sulfato ferroso

Lectura de Producción de sulfhídrico

Voges- Proskauer(Producción de Acetoína)

• Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las especies que llevan a cabo la fermentación a butanodiol de la glucosa acumulan acetoína en el medio.

Las bacterias se inoculan en caldo glucosa-peptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación butanodiólica de la glucosa forman acetoína en el medio.

Se añade alfanaftol y creatina en medio alcalino . La acetoína se convierte en diacetilo con la aparición de un color rojo

Voges-Proskauer

(Producción de Acetoína)

Ureasa

• Este enzima hidroliza la urea (H2N-CO-NH2) y origina amonio lo que producirá un incremento del pH que puede detectarse con un indicador.

Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona y urea al 2%. Como indicador de pH se utiliza rojo fenol

Ureasa

Reducción de Nitrato

• Algunas bacterias pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiración. el nitrato puede ser reducido a nitrito .

• Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfa-naftilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rosa-rojo.

• Las enterobacterias y Pseudomonas son usualmente positivos.

Reducción de Nitrato

BACTERIAS PIÓGENAS GRAM NEGATIVAS

• Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clínica son las bacterias piógenas gram negativas, estos pueden ser cocos o cocobacilos.

• Afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio.

• Dichas enfermedades comprenden uretritis purulenta (gonococos), meningitis, neumonía, bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, epiglotitis, etc.

Neisseria HaemphilusBordetella Moraxella

• Son diplococos Gram negativos, inmóviles,

• Solo dos especies de este género son patógenas exclusivamente de humanos:

Neisseria gonorroheae o gonococo, agente causal de una enfermedad de transmisión sexual, la gonorrea y

Neisseria meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que habitan principalmente el tracto respiratorio superior.

Esporádicamente se pueden comportar como patógenos oportunistas N. sicca, N.mucosa, etc

Género Neisseria

Neisseria gonorroheae

El diagnóstico definitivo de una infección gonocócica se hace por el aislamiento en cultivo de Neisseria gonorroheae Para el diagnóstico de la gonococia, el lugar de toma de la muestra dependerá de la edad, sexo y de las características de la infección.

Son: Gram (+) oxidasa (+)

Debe estar además en una atmósfera que contenga de 3 a 5% de CO2.

Se utilizan medios selectivos: Ejm Thayer- Martín modificado, suplementado con agar chocolate y que contiene Vancomicina, nistatina, colistina y trimetropín - sulfametoxasol

La observación de colonias circulares, mucosas, grises, brillantes y de bordes lisos pueden sugerir la presencia de Neisserias Patógenas.

El diagnostico de la infección meningocócica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a partir de LCR, sangre, liquido sinovial, pleural o pericardio.

El LCR se centrifuga y se utiliza un sedimento para efectuar un frotis y se tiñe con Gram, se pueden poner de manifiesto las neiserias típicas dentro de leucocitos polimorfosnucleares o de ubicación extracelular

Pseudomona

Son bacilos Gram negativos móviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios estrictos, la mayoría de las cepas son móviles por medio de uno o más flagelos polares; utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo oxidasa positivos

El género Pseudomonasse divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri, Grupo Alcalígenes , Grupo con pigmento amarillo.

Grupo fluorescente: Pseudomona aeruginosa, Pseudomona fluorescens y Pseudomona putida , las cuales se caracterizan por la producción de un pigmento pioverdina

Pseudomona aeruginosa , produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina. Y tiene un aspecto característico cuando crece en una placa de agar sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemólisis. Las colonias tienen un aspecto de piel de caimán y con brillo metálico

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION