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Explicación de TPs Nº 1 y 2
Herencia y técnicas de biología
molecular utilizadas en el
diagnóstico de enfermedades
hereditarias
Química Biológica Patológica
Bioq. Mariana L. Ferramola
2013
Dogma central de la biología molecular:
El ADN es la molécula responsable de contener
toda la información genética de un ser vivo.
Nomenclatura de los cromosomas:
Genética Mendeliana:
Fraile Gregor Johann Mendel
1822-1884
Considerado el padre
de la genética, estudió
el comportamiento de
los genes en las
distintas generaciones
de guisantes a partir
de su fenotipo.
Conceptos básicos en genética:
Gen
Alelo
Haplotipo
Locus (loci)
Mutación
Genotipo
Fenotipo
Natural, común o salvaje.
Alelos variantes o mutantes.
Locus polimórfico
Desórdenes
genéticos
Cromosómicos.
Monogénicos o
mendelianos.
Multifactoriales.
Conceptos básicos en genética:
Desórdenes
monogénicos:
Homocigotas
Heterocigotas
Heterocigotas
compuestos
Correlación entre Genotipo y Fenotipo:
Heterogeneidad
genética
Heterogeneidad alélica.
Heterogeneidad de locus.
Heterogeneidad
genética.
Heterogeneidad
fenotípica.
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Autosómica. Ligada al cromosoma X.
El gen afectado se
localiza en un autosoma.
En general, estos
trastornos afectan por
igual a hombres y
mujeres.
El gen afectado se localiza en
el cromosoma X.
La incidencia en hombres y
mujeres es diferente,
dependiendo de si es de
herencia recesiva o
dominante.
Un trastorno monogénico es aquel que está determinado
principalmente por los alelos localizados en un único locus.
Trastornos monogénicos de herencia autosómica
recesiva.
Las enfermedades de herencia autosómica recesiva solamente
afectan a individuos que presentan dos alelos mutados
(homocigotas y heterocigotas compuestos).
Trastornos monogénicos de herencia autosómica
recesiva.
La frecuencia de los portadores es mucho mayor que la de los
individuos afectados.
Es más frecuente que los individuos afectados sean heterocigotos
compuestos que homocigotos, a excepción de casos de endogamia y
consanguinidad.
Consanguinidad: Emparejamiento
entre individuos emparentados
cercanamente.
Endogamia: Emparejamiento entre
individuos de una población
reproductivamente aislada.
Trastornos monogénicos de herencia autosómica
dominante.
Las enfermedades de herencia autosómica dominante afectan
tanto a individuos que presentan uno como dos alelos
mutados.
Herencia dominante
incompleta:
La existencia de individuos
afectados por trastornos
dominantes con genotipo AA es
teórica. Los individuos con dicho
genotipo, en general, no son
viables.
Trastornos monogénicos de herencia autosómica
dominante.
Trastornos monogénicos de herencia autosómica
dominante.
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Patrones de herencia
autosómica recesiva.
Patrones de herencia
autosómica dominante.
Los individuos de ambos sexos tienen
una probabilidad similar de presentar el
trastorno.
En la mayoría de los casos , los padres
de un individuo afectado son portadores
asintomáticos de alelos mutantes.
Un hijo de padres heterocigotas
presenta un 25% de probabilidades de
presentar el trastorno.
Los padres de personas afectadas suelen
presentar consanguinidad.
Se presenta típicamente alternando
generaciones en el árbol genealógico.
Los individuos de ambos sexos tienen
una probabilidad similar de presentar el
trastorno.
Al menos uno de los padres del
individuo afectado debe presentar el
rasgo.
Cada hijo con un progenitor afectado
presenta un riesgo del 50% de heredar
el trastorno.
Los individuos fenotípicamente
normales no transmiten el trastorno a
sus hijos.
Se presenta en todas las generaciones
del árbol genealógico.
Trastornos monogénicos de herencia recesiva ligada
al cromosoma X.
Este tipo de trastornos se expresan en todos los hombres que
reciben un alelo mutado y solamente en aquellas mujeres que
presentan dos alelos mutados.
Son mucho más frecuentes en hombres (hemicigotos)
que en mujeres.
Trastornos monogénicos de herencia recesiva ligada
al cromosoma X.
Trastornos monogénicos de herencia recesiva ligada
al cromosoma X.
Trastornos monogénicos de herencia dominante
ligada al cromosoma X.
Se diferencia de la herencia autosómica dominante debido a
la inexistencia de transmisión entre hombres.
La expresión del trastorno suele ser más leve en las mujeres (que
casi siempre son heterocigotas) que en los hombres.
Algunos de estos trastornos presentan letalidad para individuos de
sexo masculino.
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Patrones de herencia
recesiva ligada al X.
Patrones de herencia
dominante ligada al X.
La incidencia del rasgo es mucho mayor
en hombres que en mujeres.
Los hombres afectados no transmiten el
gen a sus hijos varones, pero si a todas
sus hijas mujeres.
Están afectados los varones hemicigotos
y las mujeres homocigotas.
En un emparejamiento entre un hombre
afectado y una mujer sana, todos los
hijos serán sanos y todas las mujeres
afectadas.
Una mujer heterocigota afectada
transmitirá el rasgo a la mitad de sus
hijos, estando igualmente afectados los
varones y mujeres.
La frecuencia de mujeres afectadas es
aproximadamente el doble de la
correspondiente a los hombres
afectados.
Variación genética:
mutación y
polimorfismo.
Mutaciones:
“Cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido
o en la organización del DNA”
Genómicas
Cromosómicas
Génicas
Mutaciones
“No todas las mutaciones tienen consecuencias
clínicas”
Tipos de mutaciones génicas:
Deleciones e
inserciones
Pequeñas (pueden producir
corrimiento del marco de
lectura).
Grandes (afectan la estructura
génica).
Deleciones e inserciones grandes:
Tipos de mutaciones génicas:
Deleciones e inserciones pequeñas:
Sustituciones
de nucleótidos
Mutaciones de cambio de sentido
Mutaciones sin sentido
Tipos de mutaciones génicas:
Mutaciones del procesamiento
de ARN
Mutaciones de cambio de sentido (missense) y sin sentido
(nonsense):
Mutaciones
dinámicas
Amplificación de secuencias
repetidas de trinucleótidos
Tipos de mutaciones génicas:
Polimorfismos:
Son aquellas variantes alélicas tan comunes que se
encuentran en una frecuencia mayor al 1% en la
población general.
Aplicaciones: Forenses
Filiación
Medicina
Tipos de polimorfismos: SNPs
SNPs Son los más sencillos y frecuentes.
En general existen solo dos alelos en
la población.
El hecho de
que los SNPs
sean
comunes no
implica que
sean
neutrales.
Tipos de polimorfismos: de inserción-deleción
Polimorfismos de
inserción-deleción
Aproximadamente el 50% son
simples (tienen 2 alelos en la
población)
El otro 50% son multialélicos.
Clasificación:
Microsatélites (STR)
Minisatélites (VNTR)
Polimorfismos de inserción-deleción: STRs
Segmentos de DNA que consisten en unidades de 2,
3 o 4 nucleótidos, cuya repetición varía entre una y
unas pocas docenas de veces. Son multialélicos.
Muy usados en la
actualidad para
identificación de
individuos.
Polimorfismos de inserción-deleción: STRs
Gel de
poliacrilamida
Amplificación
por PCR
Polimorfismos de inserción-deleción: VNTRs
Segmentos de DNA que consisten en unidades de 10
a 100 nucleótidos, cuya repetición varía entre unos
cientos y miles de veces. Son multialélicos.
Polimorfismos de inserción-deleción: VNTRs
Detección por
autorradiografía
Separación de
fragmentos en
geles de agarosa
Tipos de polimorfismos: de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP).
Se deben a cambios en la secuencia del DNA que
modifican los patrones de corte de las endonucleasas
de restricción.
Han sido muy
utilizados como
marcadores
genéticos, es decir
para determinar la
presencia/ausencia
de una
enfermedad/alelo
mutado en
individuos .
RFLP: detección mediante Southern Blotting
Utiliza una sonda que hibrida en una región conocida, pero no tiene
relación con la mutación que produce el trastorno.
De gran utilidad cuando no se conoce la mutación que produce el
trastorno.
Permite el seguimiento de alelos mutados dentro de una misma familia.
Para su utilización, el polimorfismo y el gen a estudiar deben estar
ligados (separados por una distancia no mayor a 106 pb)
RFLP: detección mediante Southern Blotting
RFLP: PCR-RFLP
• Más simple y
económico que el
RFLP tradicional.
• Se requiere mayor
información de la
zona donde ocurre la
mutación.
• Generalmente es
la mutación que
genera el trastorno
la que da lugar al
polimorfismo.
RFLP: PCR-RFLP
Métodos de análisis de
los ácidos nucleicos.
Conceptos básicos en biología molecular:
Endonucleasas de
restricción
Electroforesis
Sonda
Hibridación
Ligación
Polimerasas
Cebadores
Transferasas
Endonucleasas de restricción:
Son enzimas que cortan la molécula de DNA doble cadena
(dsDNA) en lugares definidos por la secuencia de nucleótidos,
produciendo fragmentos de DNA definidos.
Endonucleasas de restricción:
Cuando se somete un fragmento de DNA a restricción con una
endonucleasa, esta genera fragmentos definidos, que
dependen del patrón de corte de la enzima.
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Geles de
poliacrilamida
� Alta resolución.
� Separan fragmentos de DNA
<500pb.
Geles de
agarosa
� Baja resolución.
� Separan fragmentos de DNA
de entre 300 a 10000pb.
Sondas de ácidos nucleicos:
Molécula de DNA o RNA marcada, usada para
identificar secuencias complementarias mediante
hibridación.
Marcación de sondas
Interna
Externa
Radiactiva
No radiactiva
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
DNA polimerasas
Marcación
interna:
� Desplazamiento de
mella (*dNTP).
� Random primer
extension (*dNTP o
*cebador).
Automatizada
� Sondas de
oligonucleótidos
(*dNTP).
Marcación por desplazamiento de mella:
Nick translation.
Marcación por elongación de cebadores
aleatorios: random priming.
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Polinucleótido quinasa
Marcación
Externa:
� Marcación con 32P
en extremo 5’,utiliza
γ[32P]-ATP.
� Marcación no
radiactiva.
Transferasa terminal
� Marcación con 32P en
extremo 3’, utiliza
α[32P]-ATP.
� Marcación no
radiactiva.
Marcación externa: Polinucleótido quinasa
Marcación externa: Transferasa terminal.
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Formas de marcación
de sondas de ácidos
nucleicos: Radiactiva
y no radiactiva
Hibridación de ácidos nucleicos:
Las hebras
complementarias de
ácidos nucleicos
pueden separarse
(desnaturalización) y
dadas las condiciones
adecuadas pueden re
asociarse
(hibridación).
Hibridación de ácidos nucleicos:
Factores que afectan la velocidad y especificidad
de hibridación:
� Longitud del acido nucleico.
� Composición de base.
� Fuerza iónica.
� Viscosidad.
� Temperatura
� Presencia de agentes desnaturalizantes.
� pH
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Las reacciones de hibridación con sondas de DNA son tan
sensibles y selectivas que pueden usarse para detectar
secuencias complementarias cuya concentración sea incluso
de 1 sola molécula por célula.
Hibridación:
Rigurosa (bajo condiciones
astringentes).
Poco rigurosa (bajo condiciones
no astringentes).
Longitud de una
sonda:
Desde 5 hasta miles de
nucleótidos
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Métodos de análisis de ácidos nucleicos
que utilizan sondas.
Transferencia Southern
Transferencia Northern
Dot Blot
Análisis de DNA.
Análisis de RNA.
Revelado mediante
sondas ASO.
Transferencia Southern:
Se utiliza para analizar
fragmentos de DNA
generados por digestión
con enzimas de
restricción.
Transferencia Southern:
Transferencia Southern:
Principales usos:
� Detección de secuencias
relacionadas ( ej. familias de genes).
� Detección de deleciones e
inserciones grandes causantes de
enfermedades (ej. Distrofia
muscular de Duchenne).
� Identificación de individuos
mediante VNTR.
� Detección de RFLP.
Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de
actividad variable, dependiendo del uso.
Transferencia Northern:
Se utiliza para analizar fragmentos de RNA
obtenidos a partir de extracción.
Transferencia Northern:
Transferencia Northern:
Se utilizan sondas de tamaño intermedio. Esta técnica
permite estudiar la expresión génica celular.
Actualmente esta técnica ha caído en
desuso, debido a la utilización de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Comparación entre transferencias
Northern y Southern:
Dot Blot:
Se utiliza para detección de mutaciones puntuales,
principalmente aquellas que no modifican el patrón de
restricción de una secuencia de nucleótidos.
Revelado: Sondas ASO
Condiciones de hibridación
de elevada astringencia.
Dot Blot:
Dot Blot:
Dot Blot:
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación enzimática.
Se lleva a cabo una reacción de amplificación del DNA en
presencia de los cuatro dNTPs y concentraciones mucho
menores de los cuatro análogos ddNTPs, que dan lugar a la
terminación de la síntesis cuando son incorporados.
Resolución de bandas en geles de
poliacrilamida
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación enzimática.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación enzimática.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación automática.
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