genética molecular aplicada : usa los principios del conocimiento de la estructura y función del...
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Genética molecular aplicada: usa los principios del conocimiento de la estructura y función del DNA para investigar la base del fenotipo controlado por un genotipo determinado en condiciones normales y patológicas.
Análisis Genético
GENOTIPO FENOTIPO
Genética inversa (a veces denominado clonado posicional)
•Aislamiento de variantes fenotípicasAislamiento de variantes fenotípicas
•Análisis de descendientes de cruzamientos controlados entre varientas fenotípicasAnálisis de descendientes de cruzamientos controlados entre varientas fenotípicas
•Análisis bioquímico de los procesos celulares controlados por genes concretosAnálisis bioquímico de los procesos celulares controlados por genes concretos
•Análisis microscópicoAnálisis microscópico
•Análisis del DNAAnálisis del DNA
FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA
SÍNTESIS DE DNA: REPLICACIÓN
SÍNTESIS DE RNA Y PROTEÍNAS: TRANSCRIPCIÓNY TRADUCCIÓN
COMPLEMENTARIEDAD Y ESTRUCTURA TRI-D DELDNA
Factores de transcripción: regulan la iniciación de síntesis de RNApor unión a secuencias de DNA específicas en los promotores
1. Composición de bases
2. Longitud DNA doble
3. Fuerza iónica
Tm ºC = 2(nº A + T) + 4(nº G + C)
DESNATURALIZACIÓN DEL DNA
•Temperatura•Fuerza iónica•Concentración de DNA•Tiempo de reacción
RENATURALIZACIÓN DEL DNA
Agentes desnaturalizantes:
•Formamida•Urea
•Enzimas de restricción•Ligasas•DNA y RNA polimerasas•Nucleasas
ENZIMAS METABÓLICOS DEL DNA EN APLICACIONES
Los enzimas de restricción son proteínas homodímericas y reconocen secuencias de DNA palindrómicas
G ' GATCCBamHI
SITIO INESPECÍFICO SITIO ESPECÍFICO
TIPOS DE CORTE PRODUCIDOS POR E. RESTRICCIÓN
LIGASAS: formacióndel enlace fosfo-di-éster
EXTRACCIÓN DE DNA
•Homogenización tejido (Dodecil sulfato sódico SDS; Ác. Etilendiaminotetraacético EDTA; Proteinasa K)
•Eliminación proteínas (Phenol; Cloroformo)
•Eliminación RNA (RNAasa)
•Precipitación (Etanol; Isopropanol en presencia de Na+)
Bromuro de metil-trimetil-amonio CTAB
EXTRACCIÓN DE RNA
DEPC: Dietil pirocarbonatoN-Lauril Sarcosina Mercaptoetanol
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE CsCl
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
% Concentración Rango pb0.5 1000-30.0000.7 800-12.0001.0 500-10.0001.2 400-70001.5 200-30002.0 50-2000
Xileno de cianol 5 KbAzul de bromofenol 0.5 Kb
ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
% Gel PAA Rango pb
3.5 100-1000
5.0 75-500
8.0 50-400
12.0 35-250
15.0 20-150
20.0 5-100
Acrilamida [CH2=CHCONH2]n
Metilen-bis-acrilamida (CH2=CHCONH2)2CH2
En presencia de Persulfatoamónico y TEMED (N.N,N’,N’ tetrametiletilendiamina)
HIBRIDACIÓN DESOUTHERN
1. NaOH 1N2. Tris buffer3. 20xSSC (NaCl 3M, Citrato Na 0.3M)
HIBRIDACIÓN NORTHERN
SECUENCIACIÓN DEDNA
KARY MULLIS Y LA REACCIÓN EN CADENADE LA POLIMERASA (PCR)
Dos cebadores (oligonucleótidos cortos de DNA de cadena simple)utilizados para amplificar un segmento definido de DNA genómico.
Premio Nobel 1993
Ventajas de la PCR: especificidad y sensibilidad
•DNA a amplificar (diana)
•primers (18-25 nts)
•DNA polimerasa termoestable
•dNTPs
MECANISMO Y COMPONENTES DE LA PCR
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Desnaturalización Hibridación primers Extensión (síntesis DNA)
Producción PCR = (cantidad DNA inicial) x (1 + % eficiencia) nº ciclos
Eficiencia: % de conversión de DNA molde a producto por cicloP. ej. con una eficiencia del 70% se obtiene 1 µg a partir de 1 pg en unos26 ciclos
CICLOS COPIAS
1 2
2 4 4 16 10 1,024 15 32,768 20 1,048,576 25 33,554,432 30 1,073,741,824
POLIMERASAS TERMOESTABLES
Pol termoestables: •activas despues de repetidamente a 95ºC•óptimo a 75ºC
Taq: Thermus aquaticus
Tli: Thermococcus litoralis
Pfu: Pyrococcus furiosus
Tth: Thermus thermophilus
DISEÑO DE PRIMERS PARA PCR
•Longitud de los primers (usualmente 18-24 nts)
•Temperaturas de fusión Tm (usualmente 44-55% G-C)
•No complementariedad entre los dos primers en los extremos 3’ (problema de dímeros de primer)
•No lazos intracatenarios (carecer de secuencias palindrómicas)
•Distancia entre primers (ideal entre 150-500 pb pero hasta 20 Kb)
EFECTO DE LA TEMPERATURA DE HIBRIDACIÓNEN LA PRODUCTIVIDAD, SENSIBILIDAD YESPECIFICIDAD
PARÁMETRO ALTERACIÓN EFECTO
Temperaturahibridación
Incremento
Decremento
Aumenta especificidad
Aumenta sensibilidad y productividad
DNApolimerasa
Concentración
Tipo de Taq
Alta decrece especificidadBaja insuficiente productividad
Dilema eficiencia y tasa de error
Concentraciónde Mg++
Variación Baja incrementa especificidad
Alta incrementa sensibilidad
Ciclos Temp.desnaturaliación
Alta incrementa especificidad peroactividad Taq decrece
Número ciclos Solo subir a más de 35 si menos de 103
moleculas de partida
Duraciónextensión
Incrementa sensibilidad en PCR larga
CONDICIONES DE LA PCR OPTIMIZABLES
RT-PCR: OBTENCIÓN DE RNAm
Síntesis de DNAc primera cadena requiere: •RNAm
•dNTPs
•primer (oligodT, pDn6 ala azar o específico de un gen)
•Transcriptasa reversa
•rTth (DNA pol Thermus thermophilus recombinante)•RT AMV (Virus de mieloblastosis de aves)•RT MMLV (Virus de la leucemia murina de Moloney)
SÍNTESIS DE DNAc
PRIMERS PARA LA SÍNTESIS DE LA PRIMERA CADENA
SÍNTESIS DE LA SEGUNDA CADENAUSANDO “AUTOPRIMING”
SÍNTESIS DE LASEGUNDA CADENAUSANDO RNAasaH
LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERA CONTRANSCRIPTASA REVERSA (RT-PCR)
•Combina la reacción de formación de DNAc y la amplificación por PCR.
•Puede ser de un solo enzima (rTth) o en dos reacciones (primero usando p. ej. AMV-RT y después Taq polimerasa para amplificar el DNAc.
APLICACIONES BÁSICAS DE LA RT-PCR
•RACE: Amplificación rápida de extremos de DNAc
•RT-PCR cuantitativa
•Aislamiento de transcritos que están presentes a diferentes niveles en dos poblaciones de RNAm
•“differential display”• “suppresion substraction hybridization”
PROTOCOLO PARALA RT-PCR RACE
PCR CUANTITATIVA 1:RT-PCR COMPETITIVA USANDO UN RNA “MIMÉTICO”
RT-PCR CUANTITATIVA 2: EN “TIEMPO REAL”
TaqMan probe used in Real Time PCR sample amplification
CT = cycle at which the observed fluorescence is 10-fold above background (10x amplification).
DETECCIÓN DE GENES CON EXPRESIÓN DIFERENTERT-PCR “Differential display” (DDRT-PCR)
RT-PCR “Differential display” (DDRT-PCR)
“Suppression subtraction hybridization” (SSH)
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