generaciÓn de nanobodies como herramientas para...

GENERACIÓN DE NANOBODIES

COMO HERRAMIENTAS PARA

BIOLOGÍA ESTRUCTURAL

Vanina Alzogaray

Inmunología y Microbiología Molecular

Fundación Instituto Leloir, IIBBA-CONICET

Sistema inmunitario: formado por células y moléculas responsables de

la inmunidad.

Inmunidad: protección contra agentes externos ya sea de naturaleza

biológica (bacterias, virus) o físico-química (contaminantes o

radiaciones).

Inmunidad celular: Mediada por Linfocitos T.

Inmunidad humoral: mediada por Anticuerpos.

INTRODUCCIÓN

Glicoproteínas del tipo gammaglobulina. Inmunoglobulinas (Ig).

Se distribuyen en los líquidos biológicos y mucosas. Ejemplo: sangre y

secreciones.

Producidos por linfocitos B y células plasmáticas en la médula ósea

y órganos linfáticos (bazo).

Se los puede encontrar de manera acoplada a la membrana

plasmática y en forma secretada.

Se unen específicamente y neutralizan agentes externos.

Existen distintos tipos. Todos comparten la misma estructura básica.

ANTICUERPOS

Cadena pesada

Cadena liviana

PM IgG:150KDa

Estructura tridimensional de IgG humana. En rojo y azul las cadenas pesadas, y en amarillo y verde las cadenas livianas

HALLAZGO DE IgG DE CADENA PESADA EN CAMÉLIDOSS

in R

ed

ucto

r C

on

Red

uc

tor

1 y 3: IgG de cadena pesada

2: IgG convencional

Hamers-Casterman, et al, (1993) Naturally occurring

antibodies devoid of light chains. Nature.

IgG PRESENTES EN CAMÉLIDOS

PM: 150KDa PM: 90KDa PM: 18KDa

ESTRUCTURA DE LOS Nbs

FR: Framework o armazón

CDR: Región determinantes de la complementariedad

: Cisteínas

Comparación de los dominios variables de las cadenas pesadas en Camélidos

Fáciles de obtener de manera recombinante

Solubles

Estables (pH y temperatura)

CARACTERÍSTICAS

Crystal strurcture of camel single-domain in

complex with lysozyme. Desmyter A. et al. 1996.

Nature.

Fáciles de expresar a partir del espacio

periplasmático de E. coli y de purificar

CDR3 de larga longitud convirtiendo a

éstos fragmentos en buenos candidatos

para la inhibición de enzimas

Characterization of folding-

sensitive nanobodies as tools to

study the expression and quality

of protein particle immunogens.

Alzogaray V, et al . J. Biotechnol.

2019.

Single-domain llama antibodies as

specific intracellular inhibitors of

SpvB, the actin ADP-ribosylating

toxin of Salmonella typhimurium.

Alzogaray V, et al. FASEB J. 2011.

Selection of Nanobodies that Block

the Enzymatic and Cytotoxic

Activities of the Binary Clostridium

Difficile Toxin CDT. Unger M, et al.

SCIENTIFIC REPORTS. 2015.

APLICACIONES

Brian Kobilka, Robert Lefkowitz

2012 Chemistry Nobel Prize

Structure of a nanobody-stabilized active state of the β2 adrenoceptor. Søren G.

F. Rasmussen, Hee-Jung Choi, Juan Jose Fung, Els Pardon, Paola Casarosa,

Pil Seok Chae, Brian T. DeVree, Daniel M. Rosenbaum, Foon Sun Thian, Tong

Sun Kobilka, Andreas Schnapp, Ingo Konetzki, Roger K. Sunahara, Samuel H.

Gellman, Alexander Pautsch, Jan Steyaert, William I. Weis, and Brian K.

Kobilka. Nature. 2011.

UTILIZAR LOS Nbs COMO CHAPERONAS DE

CRISTALIZACIÓN: reconocen epitopes conformacionales

de las proteínas blanco en su estado nativo, rigidizándolas

y ocluyendo en muchos casos zonas hidrofóbicas

expuestas.

β adrenergic receptor-Nb

INSTRUCT: Consorcio Europeo de Investigación en Biología Estructural.

Generación de nanobodies para ser

utilizados como chaperonas de

cristalización para la investigación

estructural de proteínas complejas.

OBJETIVO

Control de calidad del antígeno. Inmunización de llamas con proteínas en su estado conformacional nativo.

NIS (sodium/iodide symporter): esuna glicoproteína de membranaplasmática y tiene un papel crucial en lafisiología de la glándula tiroidea.

Nav 1.4 (Canal de sodio gatillado por voltaje):una glicoproteína de membrana plasmática y tiene unpapel crucial en enfermedades relacionadas conparálisis congénitas, miotonia, entre otras.

I. ELISA: respuesta humoral

500

1500

4500

1350

0

4050

0

1215

00

3645

00

1093

500

0

1

2

3

4

NIS t=0

NIS t=35

Nav1.4 t=0

Nav1.4 t=35

1/dilución

Ab

so

rban

cia

(492 n

m)

II. Construcción de bibliotecas de Nbs

Tamaño de la biblioteca: 2,14x108 clones

III. Desarrollo de la tecnología de “display” en fagos: rondas de panning

Crecemos cada clon de Nb

Antigen quality control

Nanobody purification

Biochemical and biophysical characterization of binders

Co-crystalization

Mediante ELISA evaluamos la

especificidad de cada Nb

Clo

n 1

Clo

n 2

Clo

n 3

Clo

n 4

Clo

n 5

Clo

n 6

Clo

n 7

Clo

n 8

Clo

n 9

Clo

n 1

0

Clo

n 1

1

Clo

n 1

2

Clo

n 1

3

Clo

n 1

4

Clo

n 1

5

Clo

n 1

6

Clo

n 1

7

Clo

n 1

8

Clo

n 1

9

Clo

n 2

0

Clo

n 2

1

Clo

n 2

2

Clo

n 2

3

Clo

n 2

4

Clo

n 2

5

Clo

n 2

6

Clo

n 2

7

Clo

n 2

8

Clo

n 2

9

Clo

n 3

0

Clo

n 3

1

Clo

n 3

2

Clo

n 3

3

Clo

n 3

4

Clo

n 3

5

Clo

n 3

6

Clo

n 3

7

Clo

n 3

8

Clo

n 3

9

Clo

n 4

0

Clo

n 4

1

Clo

n 4

2

Clo

n 4

3

Ab

so

rba

nc

e 4

92

nm

Nav1.4 Control Negativo

Especificidad de cada Nb evaluada mediante ELISA

FR1 FR2 FR4CDR2 FR3 CDR3CDR1

Secuencias de Nbs. Clasificación en familias

SDS-PAGE Níquel. 1: pico 1 de la corrida. 2: Nb

SDS-PAGE SD75. 1: Nb. M: marcador de peso

molecular. PM Nb: 18KDa

IV. Ensayos de screening de cristalización

+

Actualmente contamos con 21 Nbs específicos contra los

antígenos en estudio. Todos son utilizados en ensayos de

screening de cristalización. Además, se está evaluando el uso

de los mismos en ensayos en células eucariotas.

Resumen

Control de calidad exhaustivo de los blancos a estudiar

Respuesta inmunitaria alta contra los antígenos en estudio

Construcción de bibliotecas de elevado tamaño

Número elevado de screening de cristalización del complejo Nb-Ag

Dres. Mario Amzel, Sandra Gabelli y Nancy Carrasco: Investigadores argentinos radicados

en el exterior, de sólida trayectoria y expertise en targets complejos

Dr. Sebastián Klinke. Plataforma Argentina de Biología Estructural y Metabolómica. PLABEM.

Dra. Soledad Labanda

Dr. Lisandro Otero

Dres. Daniela Albanesi y Diego de Mendoza. IBR, Rosario. Santa Fé

Inmunova S. A

PICT Raíces internacional

Dr. Fernando Goldbaum. Laboratorio

de Inmunología y Microbiología

Molecular Fundación Instituto Leloir.

Centro de Resideño e Ingeniería de

Proteínas. UNSAM

Laboratorio 304. Fundación Instituto Leloir.

Muchas gracias!!!