fundamentos y aplicaciones biológicas de la espectroscopía ... 3-mm.pdf · 4 fluorescencia...

1

Fundamentos y aplicaciones biológicas de la espectroscopía

de fluorescencia

Curso de posgrado PEDECIBA

2

Fluorescencia resuelta en el tiempo

Matías Möller,Fisicoquímica Biológica,Facultad de Ciencias

3

Fluorescencia:

continua

resuelta en el tiempo

Luz incide pulsadamente

Se estudia el decaimientoradiativo del estado excitado

Luz incide continuamente

0 5 10 15 200

2

4

6

8

I F

t (s)

0 5 10 15 200

2000400060008000

10000

I F

t (ns)

4

Fluorescencia resuelta en el tiempo

Contiene más información que la fluorescencia continua, (puede distinguir 2 trp en una proteína, o poblaciones de proteínas en diferente conformación)

Permite obtener la vida media de fluorescencia de los fluoróforos

5

Vida media de fluorescencia

τUna de las características más importantes de un fluoróforo.

Es el tiempo promedio que un fluoróforo permanceen el estado excitado después de la excitación.

Determina el tiempo disponible para que el fluoróforo interactúe con el ambiente (difunda, rote, se quenchee) y por lo tanto la información que brinda su emisión.

6

0 5 10 15 200

2000400060008000

10000C

ount

s

t (ns)

ττ es un promedio es un promedio estadestadíístico, los stico, los fluorfluoróóforosforos emiten al emiten al azar, t azar, t < o > < o > ττ

ττ

7

τ = 1 / (Γ + knr)

Q = Γ / (Γ + knr)

ISS = I0τ

8

knr

9

Determinación de τ

Fluorimetría de Pulso(time-domain)

Modulación de Fase(frequency-domain)

10

• 3- Cómo se mide?

Determinación de τFluorimetría de Pulso (time-domain):Un pulso de luz de alta intensidad y corta duración (t < ns) se usa para excitar la muestra, y luego se registra el número de fotones emitidos en función del tiempo.

La caída de fluorescencia es exponencial:

0 5 10 15 200

2000400060008000

10000

I F

t (ns)

11

• 3- Cómo se mide?

Determinación de τLa caída de fluorescencia es exponencial: I (t) = I0 exp (-t / τ)Entonces, Ln (I (t)) = Ln (I0).(-t / τ)τ se obtiene de la pendiente

12

• 3- Cómo se mide?

Determinación de τ

0 5 10 15 200

2000400060008000

10000

I F

t (ns)0 5 10 15 20

5

6

7

8

9

10

τ = 5 ns

Ln(I F)

t (ns)

13

14

Caídas multiexponenciales

15

θ = tiempo de correlación rotacional

(proporcional al volumen)

16

Estadística: mínimos cuadrados no lineales,minimizar la bondad de ajuste χ2

R, en base a un modelo (mono, bi, multi-exp)

χ2

Nc(tk) = valor calculado

χ2R ≈ χ2 / n

Cuanto más cercano a 1 mejor(cuando n es muy grande)

Análisis

17

Problemas…αi y τi están correlacionados, varias soluciones ajustan una curva

18

Superficies de χ2R

19

Análisis Global: usar información de varias longitudes de onda, que logra discriminar entre los fluoróforos

DAS: Decay associated Spectra

20

Método de Máxima Entropía

Permite obtener distribuciones de τ sin suponer el tipo de distribución.

21

Annexin V + DOPC

22

• Modulación de fase

Determinación de τSe modula la intensidad de excitación a una frecuencia ω, y se determina el “ángulo de fase” φ y la “modulación”m de la intensidad de luz emitida.

23

Modulación de Fase (Frequency domain)

24

A medida que aumenta la frecuencia: φ tiende a 90°m tiende a 0

25

A medida que aumenta la frecuencia φ tiende a 90°, y m a 0

26

27

28

Quenching de SPQ y detección de Cl-

29

30

Proteínas con 1 trp tienen caídas multiexponenciales

31

32

33

Distribución de vidas medias

34

TRES: time resolved emission spectra

DAS

AA y CA TRES

35

TRES: time resolved emission spectra

El espectro va cambiando por la relajación del solvente

36

Resumencambios en τ