fundamentos del prp y su aplicación en reumatología
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Fundamentos del PRP y su Aplicación en Reumatología
Lucía Gato Calvo
Jornada Cátedra BioIbérica de Ingeniería Tisular y Terapia Celular 18 de noviembre de 2015
¿Qué es el PRP?
Plasma Rico en Plaquetas
Volumen de plasma con un recuento plaquetario superior al de la sangre periférica (150.000 – 350.000/µL)
Plaquetas o Trombocitos
Megacariocito y plaquetas Fuente: ASH Image Bank
Diámetro: 2 – 3 µm Vida media: 7 – 12 días
Funciones:
Coagulación y hemostasia Vasoconstricción Inflamación
Inmunidad Angiogénesis Regeneración tisular
Plaquetas en a, c) reposo y b, d) activadas Fuente: Bettache et al.2003; J Cell Sci 116(Pt 11):2277-84 y Hughes et al.Blood.2000; 96(1):188-194
Plaqueta
Eritrocito Pared dañada del vaso
Plaqueta activada
Coágulo Fibrina
Formación de un trombo para taponar un vaso sanguíneo dañado Fuente: www.merckmanuals.com
Granúlos alfa (α), densos (δ, flechas), lisosomas (ly) y gránulos T con TLR9 y PDI (derecha) Fuente: Heijnen et al. J Thromb Haemost. 2015; 13:1-11 y Thon et al. J Cell Biol. 2012; 198(4):561-74
Gránulo Contenido Funciones
α
Proteínas adhesivas Fibrinógeno, vWF, trombospondina, fibronectina, vitronectina, TSP-1, laminina 8, SCUBE1
Hemostasia primaria y secundaria, coagulación, reparación de la herida, inflamación, angiogénesis, defensa inmunitaria
Proteínas plasmáticas Albúmina, IgG
Factores de crecimiento VEGF, PDGF, bFGF, TGF-β1, TGF-β2, EGF, HGF, IGF, angiopoyetina, CXCL12, MMP-1, MMP-2, MMP-9, heparanasa, SDF-1, fosfato de esfingosina, PF-4, TSP-1, angiostatina, endostatina, TIMP-1, TIMP-4, BMP-2, BMP-4, BMP-6, CTGF
Quimioquinas proinflamatorias
GRO-α, CXCL4, CXCL5, CXCL7, IL-8, SDF-1α, CCL2, MIP-1α, RANTES
Factores y cofactores de coagulación
Factor V/Va, factor XI, factor XIII, protrombina, quininógeno de alto peso molecular, multimerina
Factores fibrinolíticos Plasmina, plasminógeno
Factores antifibrinolíticos α₂-macroglobulina, α₂-antiplasmina, PAI-1, u-PA
Inhibidores de coagulación
Antitrombina, inhibidor C1, TFPI, proteína S, proteasa nexina-2
Proteínas inmunitarias Precursores de los complementos C3 y C4, inhibidor de C1, factor H, trombocidinas
Proteínas de membrana Glicoproteína IIb/IIIa, GPVI, receptores Fc, PECAM, GPIb-IX-V, CD9, P-selectina, fibrocistina L, CD109
δ ADP, ATP, serotonina, histamina, Ca²⁺, tromboxano A₂, pirofosfato, polifosfato, 5-hidroxitriptamina, proteínas de membrana CD63, LAMP1/2, P-selectina, GPIb, integrina αII-β3, rab27a, rab27b
Hemostasia primaria
Lisosoma
Catepsinas, hexosaminidasa, β-galactosidasa, arilsulfatasa, β-glucuronidasa, fosfatasa ácida, CD63, LAMP1/2
Digestión celular, fibrinólisis, degradación de matriz, remodelación de vasculatura
T TLR9, PDI, VAMP-8 Defensa inmunitaria.
Un poco de Historia 1
99
7
Primera descripción de un concentrado de plaquetas como agente terapéutico
19
98
Definición de “plasma rico en plaquetas”
PRP: preparación
SISTEMA
Manual Automático
Abierto Cerrado
CIRCUITO
trombina
Mecánica Química Endógena
ACTIVACIÓN
rápida masiva
lenta progresiva
congelación
descongelación
1 2
SIMPLE
DOBLE
FILTRADO SELECTIVO
Recoger plasma
Pellet de plaquetas
METODOLOGÍA
PRP: composición le
uco
cito
s p
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uet
as
fact
ore
s d
e
crec
imie
nto
Factor Actividades
PDGF Activación de macrófagos y angiogénesis Quimiotaxis y proliferación de fibroblastos ↑Síntesis de colágeno de tipo I Proliferación de células mesenquimales
TGF-β Proliferación de fibroblastos Quimiotaxis, proliferación y diferenciación de MSCs ↑Síntesis de colágeno tipo I y fibronectina Deposición de matriz ósea ↓Osteoclastogénesis y resorción ósea
bFGF Proliferación celular Angiogénesis
IGF-1 Quimiotaxis de fibroblastos ↑Síntesis proteica Proliferación y diferenciación de osteoblastos y MSCs
IGF-2 Proliferación celular en la etapa fetal Foliculogénesis Neurogénesis
VEGF Angiogénesis Migración y proliferación de células endoteliales Vasculogénesis Quimiotaxis de macrófagos y granulocitos Vasodilatación mediada por NO
TSP-1 ↓Angiogénesis
Factor Actividades
EGF Proliferación celular Quimiotaxis y diferenciación de células epiteliales
KGF Proliferación de keratinocitos
CTGF Proliferación y diferenciación de condrocitos Adhesión celular Angiogénesis
PF-4 ↓Angiogénesis ↓Proliferación endotelial Quimiotaxis de neutrófilos y fibroblastos Actividad anti-heparina
HGF Angiogénesis Proliferación, motilidad y morfogénesis celular
Ocn Regulación metabólica Formación de hueso
On Formación de hueso Angiogénesis Proliferación y migración celular
BMP-2, -4 y -6
Osteogénesis y osificación endocondral
PDAF Vasculogénesis
PDEGF Proliferación de keratinocitos y fibroblastos dérmicos
ESTANDARIZACIÓN
Legislación aplicable al PRP
Directiva 2002/98/CE Reglamento 2007/1394/CE
Directiva 2001/83/CE
Garantías mínimas para el uso del plasma autólogo y sus fracciones
Calidad de producción Sistema abierto: certificación de instalaciones, producción y control de calidad adecuados Sistema cerrado: seguir las instrucciones del kit comercial, que deberá disponer de marcado CE para cada uso
Eficacia Necesidad de ensayos clínicos para establecer niveles de evidencia adecuados en cada patología y tipo de PRP Listado en colaboración con expertos de: - Aplicaciones con evidencias suficientes para recomendar el tratamiento con uno o varios tipos de PRP - Aplicaciones con beneficio/riesgo negativo en las que se recomienda no uso - Aplicaciones en las que se necesitan mayores evidencias para aceptar el uso
Trazabilidad Objetivo: aun siendo autólogo, impedir la transmisión de enfermedades infecciosas (analíticas y requisitos del RD 1088/2005)
Farmacovigilancia Comunicación a los Centros de Farmacovigilancia de cada Comunidad Autónoma de las sospechas de reacciones adversas
Información Información mínima al paciente sobre calidad, eficacia, ventajas sobre otras terapias, riesgos conocidos y posibles reacciones adversas
INFORME/V1/23052013
Ley 29/2006
Medicamento de uso humano. Producción industrial no aplicable. No terapia avanzada. Elaboración para pacientes concretos.
Aplicaciones del PRP
ARTROSIS: dosis óptima de plaquetas sin definir → Estandarización del medicamento
Estudios in vitro Ensayos preclínicos Ensayos clínicos
Implantología Pie
diabético Ojo seco Esclerosis múltiple
Artritis reumatoide
Quemaduras
Otros: Cirugía oral y maxilofacial
Tendón Músculo Cartílago
Hueso Alopecia androgénica
Cosmética Cirugía vascular
Nuestra visión
OBJETIVO:
Definir la dosis óptima de plaquetas a aplicar en artrosis y en defectos focales de cartílago.
Nuestro PRP:
Sin leucocitos
Activación con CaCl₂
Sin trombina bovina
Hipótesis: 1. Geles de PRP con MSCs para reparar lesiones focales.
2. PRP líquido como agente anti-inflamatorio y condrogénico para frenar y/o revertir la degeneración en artrosis.
rpm t (min)
800 8
1000 8
1300 8
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7
8
6
7
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Enri
qu
ecim
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to
1500 rpm_8' 1600 rpm_7'
1700 rpm_5' 1800 rpm_5'
Nuestros estudios: Protocolo de centrifugación
• 1700 rpm, 5 min • 1800 rpm, 5 min
• 1500 rpm, 8 min • 1600 rpm, 7 min
Selección inicial:
* Se aumentó n para alcanzar resultados con valor estadístico.
1600 rpm_7’ aporta enriquecimientos significativamente inferiores a las demás condiciones de centrifugación, que son equivalentes entre sí.
Selección final: 1700 rpm, 5 minutos
t=5
t=6
t=7t=8
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0,5
1
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3
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13001400
15001600
17001800
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Enri
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rpm
t=5 t=6 t=7 t=8
Nuestros estudios: Geles de PRP con MSCs
Células viables
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24h 7d 14d 21d 30d
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re
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24h 7d 14d 21d 30d
% a
lam
arB
lue
re
du
cid
o
Ctrl+ 0.5 1.5 4
0
100
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300
400
500
600
Ctrl+ 0.5 1.5 4
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14 días 21 días 30 días
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Ctrl+ 0.5 1.5 4
Exp
resi
ón
re
lati
va
ACAN
14 días 21 días 30 días
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5
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pre
sió
n r
ela
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SOX9
14 días 21 días 30 días
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100
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300
400
500
600
Ctrl+ 0.5 1.5 4Ex
pre
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n r
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COLII
14 días 21 días 30 días
Exp
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gén
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H-E MM
SO-FG
COLII
AA
AT
SO
COLI 20x
Geles estables
Nuestros estudios: Estado actual y planes futuros
Condrocitos
Cartílago reparado
MSCs
Efecto anti-inflamatorio Efecto condrogénico
Defecto focal
Explante Modelo de reparación
in vitro
Gel de PRP con MSCs PRP líquido
UNIDAD CIBER-BBN:
Dr. Francisco J. Blanco Dra. Elena F. Burguera
Grupo de Reumatología
INIBIC – Hospital Universitario de A Coruña
Universidade de A Coruña
Cristina Ruiz Romero
Ángela Vela
Tamara Hermida
Joana Magalhães
Noemi Gómez
Cristina Álvarez
Cristina Rodríguez
Colaboradores:
GRUPO DE HEMATOLOGÍA:
Esther Lourés Fraga
José Luis Núñez Amboage
PLATAFORMA DE HISTOMORFOLOGÍA:
Purificación Filgueira
Noa Goyanes
Jornada Cátedra BioIbérica de Ingeniería Tisular y Terapia Celular 18 de noviembre de 2015
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