fundamentos de electroforesis capilar y aplicaciones

FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR Y

APLICACIONES

Dr. Victor H. Abrego Reyes

Contenido del CursoIntroducción a la Electroforesis Capilar

(EC).

Fundamentos de EC

Modalidades de separación por EC.

Principales variables y respuestas en EC.

Desarrollo de Métodos por EC.

Problemas y soluciones

Aplicaciones

Dr. Victor H. Abrego Reyes

INTRODUCCIÓN

Dr. Victor H. Abrego Reyes

IntroducciónEs una de las técnicas de separación más

utilizadas en el primer mundo.

De gran importancia en el análisis y purificación de biomoléculas

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Introducción

Descripción de migración debida a la aplicación de un campo eléctrico 1a vez Reuss 1809

Corriente eléctrica

Bateria

Ánodo Cátodo

Arena

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Introducción

Michaelis sugiere el nombre de electroforésis (1909)

Anie Tiselius perfecciona un instrumento para llevar a cabo la electroforesis de zona (1937)

Empleo de tubos capilares para mejorar la disipación del calor, DI 1-3mm, giraban en su propio eje para ser enfriados. Hjertén electroforesis capilar.(1967)

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FUNDAMENTOS

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Electroforesis

Es la migración de especies cargadas que se encuentran disueltas o suspendidas en un electrolito, por influencia del campo eléctrico, de esta manera los cationes migran hacia el electrodo negativo (cátodo) y los aniones migran hacia el electrodo positivo (ánodo).

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Electroforesis Capilar…

Técnica analítica instrumental de separación, que permite la identificación y cuantificación de analitos en muestras que tienen una matriz compleja. Usando el principio de la Electroforesis convencional.

Electroforesis

Tradicional

Electroforesis Capilar

Es la migración de especies cargadas por influencia del campo eléctrico que se encuentran disueltas o suspendidas en un electrolito.

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Electroforesis convencional

cátodoánodo

Fuente de alimentación de voltaje

Detector

Compartimento termostatizado

Capilar de sílice fundida

Esquema básico de un equipo de Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar

Reservorio Reservorio

Electrodo ElectrodoAdquisición

De Datos

Entrada del capilar

Salida del capilar

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Principios básicos de ECEl entorno dentro del capilar

Entorno

Analito(muestra)

Buffer(medio)

Campo eléctrico

Pared del capilar

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Principios básicos de ECInfluencia de las propiedades del analito

Entorno

Analito(muestra)

Tamaño y forma

Carga neta

Masa

Buffer(medio)

Campo eléctrico

Pared del capilar

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Principios básicos de ECInfluencia de las propiedades del medio

Entorno

Analito(muestra)

Buffer(medio)

Fuerza iónica

Temperatura

pH

Viscosidad

Constante dieléctrica

Campo eléctrico

Pared del capilar

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Efecto de la temperaturaCalor de Joule. Ya que una corriente eléctrica

pasa a través del capilar esta se convierte en

calor.

Este depende también del diámetro interno

del capilar y el ambiente externo.

Un gradiente de temperatura es generado de

manera radial

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Efecto de la temperatura

Calor de Joule excesivo

Incrementa la mobilidad aproximadamente

2%/ºC

Incrementa el ancho del pico

Puede producir micro-burbujas las cuales serán

detectadas como picos falsos.

El buffer puede hervir, causando una caída de

corriente debido a la interrupción de la

conductividad

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Métodos de control

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Principios básicos de ECInfluencia de las propiedades del campo eléctrico

Entorno

Analito(muestra)

Buffer(medio)

Campo eléctrico

Voltaje aplicado

Longitud

Fuerzas conductoras

Pared del capilar

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CE Fundamental Equations Terminology

CapillaryInlet

Reservoir

CapillaryOutlet

Reservoir

Detector

Lt

Total Capillary Length

Ld

Length to Detector

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Flujo electrosmótico

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Principios básicos de ECInfluencia de las propiedades del capilar

Entorno

Analito(muestra)

Buffer(medio)

Campo eléctrico

Pared del capilar

Carga superficial

Recubrimiento

Flujo electrosmótico

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El capilar

Vidrio

Cubierto permanentemente con polimida

La superficie interna puede encontrarse

cargada

La carga en la superficie puede ser

manipulada

Responsable del flujo electroosmótico

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Ionización de los silanoles

Los grupos silanol son fácilmente

ionizables cerca del pH 4.

La pared del capilar estará cargada

negativamente

La cantidad de cargas es controlada

por el pH del buffer.

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Parámetros importantes en EC

Fuerza del campo eléctrico

Velocidad electroforética

Movilidad electroforética

Efecto del pH del buffer

Efecto del campo eléctrico

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Flujo electrosmótico

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MOVILIDAD ELECTROOSMÓTICA

mEOmEO

Si

pH alto

pH bajo

Si

OH O -

-

- - - - - - - - - - - - - - -- - -

- - - - - - - - - - - - - - -- - -

-

FEO

MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA Y ELECTROOSMÓTICA

mE

O

mE

O

mE

OmEF=0

mE

F

mE

F

Vt

Vt

Vt

+ -

ANALITOS

NEUTROS

CATIONES

ANIONES

tm < tm < tm

EL PERFIL DE FLUJO

Perfil de velocidad electroosmótica

Perfil de velocidad electrodinámica (flujo laminar)

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FLUJO ELECTROOSMÓTICO

El FEO puede ser eliminado permanentemente, si se modifica la pared del capilar o temporalmente, recubriendo la pared del capilar con algún polímero adicionado al electrolito soporte.

El FEO puede ser invertido.

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PARÁMETROS QUE AFECTAN AL FEO

Campo eléctrico pH del buffer Fuerza iónica o concentración del buffer Temperatura Modificadores orgánicos Surfactantes Cubrimientos covalentes Polímeros hidrofílicos neutros

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TIPOS DE SEPARACIÓN

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Tipos de separación

Electroforesis capilar de Zona (ECZ)Electrocromatografía Capilar (ECC)Cromatografía Electrocinética capilar (CECM)EC en gel o redes poliméricas (ECG)Isoelectroenfoque Capilar (IEC)Isotacoforesis (ITF).

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CZE

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ISOELECTROENFOQUE CAPILAR

Se usa un capilar neutro empacado con algún gel. Se administran anfolitos generado un gradiente de pH dentro del capilar. La muestra se prepara en un medio que permita tenerla con carga eléctrica y se inyecta en el capilar. Los compuestos se separan de acuerdo a su PI, al aplicar un potencial. Detección en línea

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ISOELECTROENFOQUE CAPILAR

+ + + +

+ + - -

+ -

- + - +- +

+-

Tiempo de migración

Señ

al

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EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS

Técnica muy usada en biología para la separación de proteínas y ácidos nucleicos.Las moléculas se separan al moverse a través de una red de polímero que actúa como tamiz molecular.Las moléculas grandes poseen una trayectoria más obstaculizada que las pequeñas, por lo que su tiempo de migración es mayor.

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EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS

El proceso es similar a la electroforesis en gel de poliacrilamida, pero con las

ventajas de usar un capilar.En un inicio se usaban geles anclados que se reportó, proporcionan hasta 23 millones de platos teóricos.Actualmente se usan redes poliméricas (polímeros líquidos).

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EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS

Señ

al

Tiempo de migración

EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS

Polímero Aplicación

Crosslinked polymersPoliacrilamida

Oligonucleotidos, Secuenciación de ADN, Proteínas SDS

Polímeros LinealesPoliacrilamida, Polivinil alcohol, dextran

Fragmentos de restricción Oligonucleotidos, Secuenciación de ADN, Proteínas

Agarosa Fragmentos de restricción Proteínas

Matrices de Polímeros para ECG

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CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

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CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

• Permite la separación de compuestos neutros (q=0) o con movilidades electroforéticas muy similares.

• La separación se debe a diferencias en la movilidad electroforética y a diferencias en interacciones con la fase pseudoestacionaria que presenta cada compuesto.

Porción

hidrofílica

Porción

hidrofóbica

+ s

s

s

s

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CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

Es una técnica híbrida entre la cromatografía líquida de alta resolución y la electroforesis Capilar.El solvente es transportado por medio del flujo electrosmótico y no por presión como en HPLC.El empaque usado puede usarse con tamaño de partícula menor (0.5-2 micras).

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CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

Permite la separación de analitos neutros y con carga.

Es posible manipular la selectividad del proceso al variar la composición de la fase móvil y de la estacionaria.

Aplicaciones

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APLICACIONES MOLÉCULAS DE INTERES BIOQUÍMICO. Fármacos, Análisis Clínicos. Productos Naturales, Industria Alimentaria. Quelatos Metálicos Contaminantes Explosivos Isómeros

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APLICACIONESMOLÉCULAS DE INTERÉS BIOQUÍMICO: Prótidos, Aminoácidos, Amino-azúcares. Péptidos Ácidos Nucleicos

Purinas y Pirimidinas, Nucleósidos Nucleótidos y Oligonucleótidos Fragmentos de DNA.

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Perfiles proteínicos en leche

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Pesos Moleculares de proteínas

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Eritropoyetina Análisis de Isoformas según Farmacopea Europea.

Applying the European Pharmacopoeia Capillary Zone Electrophoresis Method for the Separation of Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO). Aplicación técnica Beckamn Coulter. En www.beckman.com

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EC PARA LA EVALUACIÓN DE BIOCOMPATIBILIDAD DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS Y VACUNAS

Pureza

Heterogeneidad

Identidad

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MEJOR RESOLUCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

CE-SDS reduced / UV (220nm)

kD

43

2

1

200

97.4

66.3

55.4

36.5

31

21.5

116.3

Minutes

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

AU

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

min6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

5

4325

6

6

1

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RESOLUCIÓN DE IMPUREZAS EN IgG

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RESOLUCIÓN DE IMPUREZAS EN VACUNAS

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Polisacáridos en vacunas

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Más de IgG

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Hirudina

A. Separación de r-hirudin de una muestra proveniente de un fermentador.B. Muestra de r-hirudin purificada.

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HORMONA DE CRECIMIENTO

Separación de hormona del crecimiento humana A. recombinante.B. natural

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Glicanos

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|Análisis de virus completos

Detector de Fluorescencia

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Otra aplicaciones. Separaciones Quirales

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Drogas de abuso

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Orina

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Cabello

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Dr. Victor H. Abrego Reyes

Residuos de Disparo

Dr. Victor H. Abrego Reyes

Polvora

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Análisis Genético

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Gracias