fisiología y genética de la fijación de nitrógeno

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FISIOLOGÍA Y GENÉTICA DE LA

FIJACIÓN DE NITRÓGENO

Prof.Mag.Débora E. Alvarado

Curso: Genética Microbiana

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La Fijación de nitrógeno es una cualidad exclusiva de los

procariontes.

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N2 atmosférico total 1015 ton

Ciclo transforma 3 x 109 ton N2 / año

diazotrofos

Importancia de la Fijación del Nitrógeno en la naturaleza

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El gas Nitrógeno (N2) conforma el 79% de la atmósfera pero no es directamente utilizable por la mayoría de organismos.

El Nitrógeno es requerido por todos los organismos vivos, pero solamente unos pocos pueden fijarlo de la atmósfera.

El Nitrógeno es con frecuencia un nutriente limitante en los ecosistemas de suelo.

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Colonización de pelo radical por Azospirillum brasilense

Marcación con sonda alfa1b marcado con rodamina y microfotografía de epifluorescencia con imagen de rastreo confocal

Microfotografía de transmisión

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Árbol NifH mostrando los diferentes grupos microbianos diazotrofos.

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Los microorganismos procariónticos fijan el 85% del N2 atmosférico, del cual se fijan… – 60% en el suelo– 40% en el océano

15% restante es fijado por:– Combustión– Relámpagos– Producción industrial de fertilizantes

(síntesis de Haber-Bosch).

Bioquímica de la Fijación de Nitrógeno

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N2 + 4H+ + 4NADPH + 16-24ATP 2 NH3 + 4NADP+ + 16-24ADP + 6Pi

Dinitrogenasa

N N______

945 KJ/molNo reactivo

No disponible metabolicamente

Altamente estable

Fijadores de N2 Diazotrofos

Sistema Nitrogenasa

Complejo enzimático reductasa

Pasos para la fijación del N2:reducción de

N2 a 2NH3

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Versatilidad del Complejo Nitrogenasa

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Bacteria Fijadora de Nitrógeno

Bacteria nitrificante

Nitrate reductase (Fe, Mo)

Nitrite reductase (Fe)

Nitrogenase(Fe, Mo or V)

Bacteria denitrificante

N2 NH4+

NO3-NO2

-

Nitrogen

Las más importantes enzimas para la asimilación del N requieren Fe.

Complejo enzimático Nitrogenasa Éste rompe el triple enlace de la molécula N2 para

producir nitrógeno atómico y subsecuentemente NH3.

Dos proteinas están involucradas en el complejo, cada una con subunidades múltiples. – Dinitrogenasa, es una proteína que contiene Molibdeno y

Fierro (2 Mo/molécula, 22-24 Fe/molécula) – Dinitrógeno reductasa, es una proteína que contiene

Fierro y Azufre (4 Fe/molécula, 4 S/molécula). En células que fijan nitrógeno, 10 al 40% de las

proteinas celulares pueden ser nitrogenasas. El proceso es relativamente lento y requiere 1,25 seg

para formar dos moléculas NH3.Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM

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La energía requerida para romper la molécula de N2 (16 ATP aprox), es una inversiónsignificativa de energía por las células.– Cerca de 15 mg N2 es fijado por cada gramo de carbono

consumido para energía. – Los organismos aeróbicos son algo más eficientes que los

organismos anaeróbicos. La producción de amonio industrial requiere altas

temperaturas (500oC), alta presión (~200 atm), y un catalizador (usualmente Niquel). – La producción de una tonelada métrica de NH3

requiere energía e hidrógeno de combustibles tales como gas natural (31,000 ft3 ), o petróleo (5.5 bls) o carbón mineral (2 Tm).

La enzima nitrogenasa funciona a temperatura y presión ambiental.

Cianobacterias y la diazotrofía

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Berman-Frank 2003 Res Microbiol 154:157–

164

Adaptaciones morfológicas y de comportamiento de cianobacterias en relación a la fijación del N2

Berman-Frank 2003 Res Microbiol 154:157–

164

Evolución de las vías metabólicas de la fotosíntesis oxigénica y la fijación de N2.

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Dos árboles propuestosGen nif vs spp

Nódulo Legumbre/Rhizobium

Células lignificadas

Sacos vasculares

Células fijadoras de N2

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Los nódulos proveen un ambiente para los microorganismos. La planta provee los substratos orgánicos necesarios y protege a los organismos del oxígeno por la presencia de leghemoglobina (compuesto rojo parecido a la hemoglobina).

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Straight, 2009 Annu. Rev. Microbiol.. 63:99

Intercambio de señales químicas en

la comunicación entre la leguminosa y

la bacteria de la familia Rhizobiaceae

Azotobacter vinelandii.

Sabra, 2000 Appl Environ Microbiol

66:4037

Mecanismos de protección de la nitrogenasa contra el O2

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Vista superficial, en microfotografía electrónica, de células de Azotobacter

vinelandii crecidas a 2.5 y 20% de saturación de aire en un quimiostato con limitacion de

fosfato. PHB, poli-b-hidroxibutirato.

Genética de la Fijación de Nitrógeno.

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Fijación de Nitrógeno en presencia de Oxígeno

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Streptomyces thermoautotrophicus

Str2 Str1

N2

2NH3

CO

CO 2

CO deshidrogenasa

Nitrogenasas

O2

O2 -

e-e-

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Uridililtransferasa

NifL, regulador negativo de expresión genes nif (inhibe NifA) en proteobacterias.

Nif A, activador transcripcional cataliza actividad de RNA polimerasa con factor sigma 54 (regulación dual)

O2

FlavoproteinaOxida

NifL

Inhibición por O2

Vía de regulación de nitrógeno global

Efector alostérico

Vía de regulación de oxígeno global

N

Regulación de la Fijación del N2

Filogenia de bacterias fijadoras de nitrógeno en Reticulitermes speratus, utilizando secuencias de aminoácidos NifH.

Observación microscópica del contenido intestinal de termites

Perspectivas de investigación Plantas transgénicas con genes de nitrogenasa,

particularmente de aquellas no sensibles al oxígeno. Identificación, selección y mejoramiento genético de

bacterias diazotróficas asociadas a plantas.– Con más motilidad y con mayor capacidad de adherencia.– Con mayor tolerancia a estreses edáficos: acidez, salinidad

y alta temperatura.– Reto, asociación con otra flora simbionte como las

micorrizas. Uso de diazotrofos en la remediación de derrames de

petróleo. Búsqueda de nuevos productores de nitrogenasas.

– Reto, búsqueda de enzimas con menor requerimiento energético y menor sensibilidad al oxígeno.