expresión del gen uclacianina en diferentes variedades de vid · de la vid (vitigen) del instituto...
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Beatriz Larreina Manzanares
Jerome Bruno Grimplet y María Carmen Tenorio Rodríguez
Facultad de Ciencia y Tecnología
Grado en Enología
2015-2016
Título
Director/es
Facultad
Titulación
Departamento
TRABAJO FIN DE GRADO
Curso Académico
Expresión del gen Uclacianina en diferentes variedadesde vid
Autor/es
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2016
publicaciones.unirioja.esE-mail: publicaciones@unirioja.es
Expresión del gen Uclacianina en diferentes variedades de vid , trabajo fin degrado
de Beatriz Larreina Manzanares, dirigido por Jerome Bruno Grimplet y María CarmenTenorio Rodríguez (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported. Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los
titulares del copyright.
GRADO EN ENOLOGÍA Trabajo de Fin de Grado | Beatriz Larreina Manzanares
Tutores: Jerome Grimplet Carmen Tenorio
EXPRESIÓN DEL GEN UCLACIANINA EN DIFERENTES
VARIEDADES DE VID
1
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido posible gracias al Grupo de Investigacion de Genetica y Genomica
de la Vid (Vitigen) del INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA VID Y EL VINO, al Dr. Jerome
Grimplet por guiarme, corregirme y formarme en este trabajo.
A la Dra. Carmen Tenorio por su papel como tutora y compañera en la Universidad de
La Rioja.
Quiero mostrar mi especial agradecimiento a Carol y Cris por su ayuda y la constante
aportación a mi quehacer diario en estos meses. Y por supuesto, a Javier Tello, por el
apoyo, motivación y amistad recibida estando a 300 km de distancia, GRACIAS.
2
RESUMEN
La compacidad del racimo es un rasgo fundamental de la vid (Vitis vinifera L.) que
puede afectar tanto a la calidad como al rendimiento. Los racimos compactos maduran
menos uniformemente, reduciendo la calidad y complicando la vendimia. Además son
más susceptibles a plagas y enfermedades, principalmente infecciones por hongos.
Por todo esto, hay un gran interés en el sector por conocer las bases genéticas y
fisiológicas que afectan a este carácter. En un proyecto anterior el grupo de genética y
genómica de la vid del ICVV estableció que, en un marco multivarietal, los caracteres
más determinantes de ese carácter son la longitud de los ejes principales del racimo y el
número total de bayas. En algunos genes candidatos se detectaron asociaciones
prometedoras entre polimorfismos concretos y la longitud de los ejes o el tamaño de
baya. Entre ellos, se destacó la asociación entre un polimorfismo detectado en el
promotor de un gen que codifica para una proteína tipo uclacianina (VviUCC1) y la
longitud de la primera ramificación.
Así, se analizó la expresión génica de la uclacianina en variedades con diferentes
genotipos (20 variedades en total de 3 genotipos, T:T, C:C, C:T), para la validación de la
asociación entre el polimorfismo y la expresión de gen.
A pesar de observarse que algunas de las variedades con el genotipo T:T presentan
mayores valores de expresión de la uclacianina, no se observó un resultado significativo
para el ANOVA, lo que indica que no hemos detectado diferencia significativa en la
expresión del gen VviUCC1 entre los tres genotipos estudiados.
3
ABSTRACT
Cluster compactness is a fundamental feature of the vine (Vitis vinifera L.) that can
affect both quality and yield. The compact clusters ripen less evenly, reducing the quality
and complicating the harvest. They are also more susceptible to pests and diseases,
especially fungal infections.
For all this, there is great interest in the industry to understand the genetic and
physiological bases that affect this character. In a previous project the group "Genética
y Genómica de la Vid" from the ICVV established that, in a multivarietal framework, the
determinants of that character are the length of the main axes of the cluster and the
total number of berries. In some candidate genes promising associations between
specific polymorphisms and length of the axes or berry size were detected.
Among them, the association between a polymorphism detected in the promoter
of a gene encoding a uclacianina protein (VviUCC1) and the length of the first branch.
Thus, the uclacianina gene expression was analyzed in 20 varieties with different
genotypes (T: T, C: C, C T 20 varieties in total 3 genotypes) for the validation of the
association between the polymorphism and expression of VviUCC1.
Despite that some varieties with genotype T:T show a higher expression of
uclacianina, no significant result for ANOVA was observed, indicating that we detected
no significant difference in the expression of VviUCC1 gene from the three genotypes.
4
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 6
1.1 Importancia de la vid y del vino en el mundo, España y La Rioja ................................. 6
1.2 Calidad de la uva ........................................................................................................... 6
1.3 Importancia de la compacidad en la calidad de la uva ................................................. 7
1.4 Aplicación de la PCR a tiempo real para los estudios de la expresión génica. ........... 10
1.5 Estudios previos .......................................................................................................... 12
2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 14
3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................ 15
3.1 Material vegetal .......................................................................................................... 15
3.2 Preparación de los RNA .............................................................................................. 16
3.2.1 Extracción de RNA de Inflorescencias de Vid. ..................................................... 16
3.2.2 Visualización de fragmentos de RNA en gel de agarosa. ..................................... 17
3.2.3 Precipitación de RNA con cloruro de litio (LiCl) ................................................... 18
3.3 PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR o RT-PCR)............................................ 19
3.3.1 Síntesis de DNA .................................................................................................... 19
3.3.2 Diseño de primers (o cebadores) para qPCR ....................................................... 20
3.3.3 Técnica qPCR o RT-PCR ........................................................................................ 20
3.3.4 Optimización de la concentración de primers ..................................................... 21
3.3.5 Determinación de la eficiencia ............................................................................ 22
3.4 Análisis de datos ......................................................................................................... 22
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 24
5
4.1 Concentración y pureza de los RNAs extraídos .......................................................... 24
4.1.1. Medida cuantitativa (NanoDrop). ....................................................................... 24
4.1.2 Medida cualitativa (gel de agarosa) ..................................................................... 26
4.2 Optimización de los primers utilizados ....................................................................... 27
4.3 Determinación de la eficiencia ................................................................................... 27
4.4 RT-PCR ......................................................................................................................... 29
5. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 33
6. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 34
6
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Importancia de la vid y del vino en el mundo, España y La Rioja
El cultivo de la vid (Vitis vinífera L.) y la producción de vino suponen una parte
importante del sector agroalimentario de numerosos países occidentales, además de
tener un papel destacable en su cultura y tradiciones. Desde el punto de vista
económico, la vid es el frutal más cultivado en el mundo. Según datos de la Organización
Internacional de la Viña y el Vino (O.I.V.) alrededor del 65% de la producción se destina
a la vinificación, cerca del 27% a su consumo en fresco y un 7% a la producción de uvas
pasas. Ante esto, España es el país con más superficie de viñedo cultivada (1.1 millones
de hectáreas), siendo el tercer país productor de vino y el noveno productor de uva de
mesa en el mundo.
La producción mundial del vino se estima aproximadamente entre 275 y 300
millones de hectolitros. España cuenta con unas 1.100.000 ha, suponiendo un 15% de la
superficie mundial del viñedo, con una tendencia reductiva en los últimos años. La
mayor parte de esta superficie se dedica a la producción de uva para elaboración de
vino, ocupando el viñedo destinado a la producción de uva de mesa poco más de 21.000
ha. Del total de la superficie dedicada a uva de vinificación, alrededor de 618.000 ha
están protegidas por Denominaciones de Origen (DO), cuya producción se destina a la
elaboración de vinos de calidad (Barco, 2008).
El modelo en que sustenta la D.O. Calificada (D.O.Ca) Rioja la determinación de su
calidad no es otro que una reglamentación con los siguientes principios básicos: no hay
libertad de plantación, limitación de rendimientos, existencia de mecanismos de control
y sanción del nivel de rendimiento fijado en cada campaña, limitación varietal,
diversidad agroclimática, nivel tecnológico y conocimiento suficiente para la producción
y elaboración con calidad, inversión en I + D, todo esto en un territorio limitado (por la
DOC) y pequeño que impide estrategias de expansión ilimitada (Barco, 2008).
1.2 Calidad de la uva
Una de las claves del éxito de la calidad de los vinos españoles durante los últimos
años es, sin duda, la especial atención que desde la bodega se le está prestando a las
condiciones de cultivo y producción de uva para su vinificación (Hidalgo Togores, 2006).
El concepto de uva de calidad va relacionado con varios aspectos:
7
1. El tipo de vino a elaborar: los parámetros de calidad no son los mismos para la
elaboración un vino blanco que para uno rosado o tinto.
2. Uva madura (maduración tecnológica o de la pulpa): la uva debe tener un nivel
adecuado de azúcares y acidez en el momento de la vendimia, para asegurar
fermentación, calidad aromática, calidad sensorial.
3. Maduración fenólica: La maduración fenólica es la más complicada de alcanzar
y difícil de evaluar mediante técnicas sencillas y rápidas. En este sentido se han
propuesto metodologías para su valoración a través de diversas características
vegetativas del viñedo, como la relación SFE (superficie foliar
expuesta)/producción, el vigor y el estado/exposición de los racimos, relaciones
que han mostrado tener una alta correlación con la maduración fenólica (Martínez
de Toda, 2007).
4. Peculiaridades de la variedad de uva: relacionado con la presencia de variedades
más demandadas y valoradas que otras, algo que depende directamente de las
tendencias de consumo.
5. Uva sana: la calidad de la uva vendrá determinada directamente con el estado
sanitario de los racimos, el cual vendrá dado por la presencia/ausencia de
enfermedades del viñedo como mildiu, oídio, botrytis. Así, si los racimos presentan
una alta presencia de estos organismos deberán ser rechazados para la
elaboración de productos de calidad (Martínez de Toda, 2008).
1.3 Importancia de la compacidad en la calidad de la uva
La compacidad del racimo de vid y los factores individuales que definen este
carácter repercuten en la calidad de la uva de vino y de mesa, siendo un atributo que
determina en gran manera el estado sanitario del fruto y la homogeneidad de la
maduración del racimo (Laguna-Ullan, N., 2011). Una elevada compacidad en el racimo
conlleva la aparición de un mayor número de bayas interiores, las cuales no recibirán la
radiación solar necesaria para la correcta y homogénea maduración del racimo (Bayo-
Canha et al., 2012). Una adecuada radiación sobre los frutos se ha relacionado con un
mayor contenido de sólidos solubles, antocianos, y compuestos fenólicos, así como con
una menor acidez titulable, menor contenido en acido málico, menor pH y peso de baya
(Bergqvist, J. et al., 2002), parámetros altamente valorados en uva para vinificación
(Méndez Sánchez, JV., 2005). Así, de manera general, los racimos muy compactos
presentarán peor calidad que los racimos sueltos.
Igualmente, el alto número de bayas en racimos compactos genera un microclima
de alta humedad y temperatura, así como una pobre aireación del racimo, lo que
8
favorece la aparición de diversas plagas y enfermedades del racimo (Martins Marques
Costa, T., 2013). Como se ha comentado anteriormente, si los racimos son severamente
atacados por estos organismos plaga serán rechazados en bodega, lo que puede
producir importantes pérdidas económicas para el viticultor (Labrador-Silva, A. 2002).
Por otro lado, la compacidad del racimo (figura 1) es uno de los parámetros que
evalúa el consumidor de uva de mesa a la hora de adquirir este producto, junto a
atributos como el sabor y el color de las bayas, el tamaño y la forma del racimo y la
firmeza y el color del raquis (Dragincic et al., 2015). En este sentido, el consumidor
rechazará aquellos racimos que sean excesivamente sueltos o excesivamente
compactos, por considerarlos de peor calidad.
Figura 1. Racimos de uva que muestran diferentes grados de compacidad de acuerdo al descriptor número 204 propuesto por la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV). 1: Racimo muy suelto ("Moscatel de Hamburgo"); 3: Racimo suelto ("Beba roja"); 5: Racimo Medio ("Pardillo") ; 7: racimo denso ("Cabernet Sauvignon"); 9: Racimo muy denso (" Sylvaner Gruen ")
Dada su importancia, se han probado numerosas técnicas vitícolas para modificar
la compacidad del racimo y producir racimos más sueltos (figura 2). Entre ellas cabe
destacar la utilización de giberelinas (Vartholomaiou et al. 2008), y el deshojado precoz
(Tardáguila et al. 2010).
No obstante, estas estrategias suelen afectar el número de bayas por racimo, lo
que genera una pérdida en el rendimiento en el cultivo, lo que se traduce en pérdidas
económicas para el viticultor. En este sentido, el uso de alternativas genéticas se plantea
como una posibilidad viable para abordar este problema a largo plazo. No obstante, y a
pesar de su importancia agronómica, se desconocen los procesos moleculares y
genéticos que determinan este carácter, probablemente a su elevada complejidad, lo
que dificulta su estudio (Tello et al., 2015).
9
Figura 2. Ejemplo de un racimo de vid (Vitis vinifera L.) suelto con ramificaciones largas (variedad Italia) y un racimo compacto con ramificaciones cortas (variedad Cinsaut). La cuadrícula del fondo tiene un tamaño de 1 cm2.
En un estudio previo realizado en el laboratorio de Genética y Genómica de la Vid
(Vitigen) del Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (ICVV) se llevó a cabo la disección
genética de este carácter a nivel inter-varietal, estudiando más de 100 variedades de
uva de vino y mesa durante tres años consecutivos (Tello et al., 2015) La aplicación
progresiva de distintos análisis multivariantes permitió señalar la longitud de las
primeras ramas del raquis, el número de bayas del racimo y, en menor medida, el
tamaño medio de la baya como los factores más determinantes en la distinta
compacidad del racimo, por lo que se indicaron como las vías más interesantes para el
estudio genético del carácter. Mientras que el número de bayas y su tamaño determinan
principalmente el volumen real del racimo, su volumen morfológico vendrá dado
además por su distribución tridimensional, determinado por las longitudes mayores del
raquis: la relación entre ambos volúmenes determinará entonces la compacidad del
racimo (figura 3).
.
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10
Figura 3. Principales secciones del escobajo
1.4 Aplicación de la PCR a tiempo real para los estudios de la expresión génica.
Para la validación de los polimorfismos asociados localizados en el promotor, que
pueden afectar la expresión del gen, se harán estudios de expresión génica alelo-
específicas mediante la técnica de PCR a tiempo real.
Los polimorfismos se distinguen terminológicamente de las mutaciones por su
frecuencia. Las diferentes formas de los polimorfismos (llamados “alelos”) son más
frecuentes que las mutaciones, esto es, en una frecuencia mayor al 1%. La gran mayoría
de los SNP’s (Polimorfismo de nucleótido simple) tienen dos alelos los cuales están
representados por una sustitución de una base por otra. En las poblaciones, este tipo de
alelos se clasifican en alelo principal o “silvestre” y alelo raro o mutante, clasificación
basada en la frecuencia observada en las poblaciones (Checa Caratachea, M.A.,2007).
La gran diferencia de la técnica de PCR a tiempo real con respecto a la PCR
convencional radica en que la detección de la amplificación no se realiza al final de la
reacción, sino que se realiza durante el transcurso de la misma, al comienzo de la fase
exponencial, y sin necesidad de un paso posterior de migración electroforética del
producto de PCR (Sánchez-Díaz, A., 2012).
Tal y como se muestra en la Figura 4, en una PCR a tiempo real (RT-PCR o qPCR) se
pueden diferenciar varias fases. La primera de ellas es una fase exponencial, en esta fase
la reacción es muy específica y precisa. A continuación tiene lugar la fase lineal, en la
que alguno de los reactivos puede ser limitante (p.ej.: la Taq polimerasa pierde actividad
1. Pedúnculo
2. Eje central del raquis
3. Raquis
4. Ramificaciones
5. Pedicelo
11
o bien alguno de los productos comienza a degradarse). La reacción es más lenta y por
lo tanto aumenta la variabilidad en la cantidad del producto final. Finalmente se produce
una fase de meseta, en la que existe inhibición por producto y la reacción de síntesis se
detiene (Kainz P., 2000).
Figura 4. Representación gráfica de las fases de la PCR.
En una RT-PCR se produce una monitorización continua de todo el proceso, por
lo que es posible la comparación de las muestras en fase exponencial, cuando la
eficiencia es máxima, en vez de a punto final (como hace la PCR convencional). Al inicio
de la fase exponencial las distintas muestras amplificarán de una manera muy precisa y
similar. Sin embargo, según va transcurriendo el proceso, variará la eficiencia entre
muestras. Por este motivo, el parámetro que se utiliza para comparar las distintas
reacciones ha de tomarse en la fase exponencial donde la sensibilidad al error
experimental es menor (Sánchez-Díaz, A., 2012).
El fundamento de la RT-PCR es la relación directa entre la señal de fluorescencia
emitida durante el proceso de la PCR y la cantidad de DNA molde que transforman esa
señal en datos de cuantificación absoluta o relativa del fragmento de DNA amplificado,
el cual puede variar dependiendo de la muestra. La mayor parte de los métodos
existentes dentro de la cuantificación relativa se han desarrollado para ser utilizados en
trabajos de expresión genética, mediante la cuantificación indirecta del RNAm que se
12
expresa en un determinado tejido. Esta cuantificación implica la utilización de un gen de
referencia que debe cumplir:
1- El número de copias genéticas no debe variar entre tejidos ni tampoco entre
muestras.
2- La expresión del gen debe ser constante en los diversos tejidos y muestras
(Ginzinger, 2002).
En el caso de los estudios de la vid, se suele trabajar con el gen de la Ubiquitina,
EF1 α, GPDH como gen de referencia (Gu C et al., 2011).
1.5 Estudios previos
En otro estudio realizado en el mismo laboratorio se llevó a cabo un análisis
transcriptómico comparativo entre clones sueltos y compactos de las variedades
Tempranillo tinto y Garnacha tinta, que permitió la selección de genes candidatos
potencialmente involucrados en la compacidad del racimo o en caracteres relacionados
(Grimplet et al., en preparación).
El análisis de las secuencias génicas de más de 100 variedades de vid permitió
identificar un conjunto de polimorfismos que sirvieron de base para llevar a cabo un
estudio de asociación con la compacidad del racimo y los dos factores que más
determinan su variación (número de bayas y longitud de la primera ramificación del
racimo) (Tello et al., 2016). Esta aproximación permitió identificar un conjunto de
polimorfismos asociados con la compacidad del racimo o con los atributos que lo
determinan, localizados en genes no relacionados previamente con estos caracteres.
Entre los genes secuenciados, los genes con las asociaciones más prometedores han sido
pre-seleccionados y clasificados, para determinar cuáles serán estudiados para evaluar
y validar la asociación. La clasificación se ha basado en la calidad de la secuencia, la
robustez y la importancia de las asociaciones encontradas, la varianza de la
característica explicada por el modelo, la distribución genotípica del polimorfismo
asociado en la colección de variedades utilizado, el tipo y localización del polimorfismo
y la anotación funcional del gen.
Entre ellos, los autores destacaron la asociación entre un polimorfismo (llamado
K-88) detectado en el promotor de un gen que codifica para una proteína tipo
uclacianina (VIT_12s0059g02640) y la longitud de la primera ramificación y la
13
compacidad del racimo (Tello et al., 2016). De hecho, resultados transcriptómicos
previos indicaron una expresión específica de este gen en etapas clave para el
establecimiento y desarrollo del raquis en diferentes cultivares (Díaz - Riquelme et al.
2014, Fasoli et al., 2012), lo que sugiere que este gen podría estar involucrado de una
manera u otra en la formación de la inflorescencia y la arquitectura final del raquis. Así,
los autores propusieron este gen (y este polimorfismo) como un interesante candidato
para realizar trabajos más profundos para confirmar dicha asociación, como sería
determinar la expresión de este gen en variedades de vid con distinto genotipo para K-
88 (Tello et al., 2016).
14
2. OBJETIVOS
Los objetivos planteados para este trabajo fueron los siguientes:
1. Analizar la expresión génica de la uclacianina en variedades con diferentes genotipos.
Para la validación de los polimorfismos asociados localizados en el promotor, que
pueden afectar a la expresión del gen, se harán estudios de expresión génica mediante
RT-qPCR.
2. Evaluar y validar las asociaciones encontradas en relación con la arquitectura del
racimo.
15
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1 Material vegetal
Para este trabajo se seleccionaron 20 variedades de vid (Vitis vinífera L.) de la
Colección de Variedades del Instituto de Ciencias de La Vid y del Vino (ICVV, Instituto
Código FAO: ESP-217) situada en la finca de "La Grajera" (Logroño, La Rioja, España)
(Tabla 1). Estas variedades se seleccionaron considerando su distinto genotipo para el
polimorfismo K-88, localizado en el promotor del gen VvUCC1 (VIT_12s0059g02640) y
asociado con la longitud de las ramificaciones del raquis y la compacidad del racimo
(Tello et al., 2016).
Para cada variedad se tomaron tres inflorescencias completas (cada una de una
cepa diferente) en el estadio fenológico E-L 14 (estado de inflorescencia, mayo 2015).
Se congelaron con nitrógeno líquido en el mismo momento que se muestreaban,
se trasladaron al laboratorio y se conservaron congeladas a -80 ⁰C para la posterior
extracción de RNA.
Tabla 1. Variedades de vid (V. vinífera) incluidas en este trabajo.
Número Variedad
Nombre variedad
Genotipo K-88 Uso principal de la variedad
1 Cinsaut C:C Vino
2 Italia C:T Mesa
3 Albillo Real C:T Vino
4 Alphonse Lavallee T:T Mesa
5 Pedro Ximenes T:T Vino
6 Trebbiano Toscano C:C Vino
7 Airén C:T Vino
8 Cabernet Franc C:C Vino
9 Barbera Nera C:C Vino
10 Tempranillo Tinto C:C Vino
11 Planta Nova C:T Mesa
12 Listán Prieto T:T Vino
16
13 Torrontés T:T Vino
14 Moristel C:T Vino
15 Paraíso C:T -
16 Delight C:C Mesa
17 Merlot C:C Vino
18 Tinto Velasco C:C Vino
19 Aramon Noir C:C Vino
20 Naparo T:T Mesa
3.2 Preparación de los RNA
3.2.1 Extracción de RNA de Inflorescencias de Vid.
La extracción de RNA se realizó a partir de las muestras de las inflorescencias
congeladas a -80 ⁰C (descritas en el apartado anterior), se machacaron en morteros de
cerámica estériles hasta conseguir un fino polvo uniforme, manteniendo siempre la
muestra congelada con nitrógeno líquido. El polvo extraído (aprox. 100 mg/muestra) se
conservó en un tubo eppendorff estéril debidamente etiquetado.
El RNA se extrajo con el Kit Plant Total RNA (Sigma-Aldrich), siguiendo el
protocolo suministrado por el fabricante con ciertas modificaciones, tal y como se indica
a continuación.
- En un eppendorff se pesaron 100mg de muestra, a la que se le añadieron
500µL de Lysis Solution y 5µL de 2-ME. Se vorteó durante 30 segundos y
seguidamente se introdujo en un baño a 56 ⁰C durante 5 minutos.
- Una vez transcurrido el tiempo, se realizó una centrifugación de a 13000 rpm
durante 3 minutos. El sobrenadante obtenido se pasó por un tubo de 2 mL
con la columna de filtración (azul) y se centrifugó a 13000 rpm durante 1
minuto.
- A continuación se retiró la columna de filtración y se añadieron 250 mL de la
solución Binding. Se mezcló bien con la misma punta de pipeta (aprox. unas
5 veces) y se pipeteo 500 µL de la mezcla que fueron transferidos a un nuevo
tubo de 2mL con la columna Binding (roja).
- Se centrifugó a 13000 rpm durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante
dejándose secar la columna.
17
A continuación, se realizó un tratamiento con DNasa para eliminar cualquier
resto de DNA que pudiera haber en las muestras. Para ello:
- Se añadieron 300 µL del Wash Solution 1, se centrifugó durante un 1 minuto
a 13000rpm, y se descartó el sobrenadante.
- Y para cada digestión se añadió 10 µL de DNase I más 70 µL de RDD. Se
pipetearon los 80µL de dicha digestión y se añadieron al centro del filtro de
la columna, se incubaron las muestras durante 15 minutos a temperatura
ambiente.
- Seguidamente, se realizó una limpieza de la columna añadiendo 500 µL del
Wash Solution 1 en el centro del filtro de la columna, se centrifugó a 13000
rpm durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante. Este paso se repitió
nuevamente ya que este tejido sale con bastantes impurezas.
- A continuación, añadimos 500 µL del Wash Solution 2 y se centrifugó a
1300rpm durante 30 segundos. Este paso se repite tantas veces como sea
necesario hasta que el sobrenadante salga sin color verde.
- Centrifugamos la columna vacía para secarla a 13000 rpm durante 1 minuto.
- Pasamos la columna a un nuevo tubo de 1,5 mL.
- Se añadió 60µL de Agua DEPC en el centro del filtro de la columna y pasado
1 minuto se centrifugó, 13000 rpm durante 1 minuto.
Una vez extraído en RNA, se procedió a evaluar la calidad y el rendimiento de
dicha extracción. Para ello, se realizó una electroforesis en un gel de agarosa teñido con
azul de bromofenol (1%) tal y como se indica en el apartado 3.2.2
Para ver el rendimiento obtenido de la extracción se efectuó la medida 260/280
y 260/230 por medio de un espectrofotómetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific ,
Wilmington , EEUU).
3.2.2 Visualización de fragmentos de RNA en gel de agarosa.
Para visualizar los fragmentos de RNA, se empleó la técnica de electroforesis
horizontal en gel de agarosa.Se preparó un gel con agarosa de alta pureza (Bio-Rad) a
una concentración del 1% en tampón de almacenamiento (TAE 1X)- 60 mM de Tris y 2
mM EDTA, pH 8.5 - con gel Red.
Cada muestra se preparó mezclando 200ng de RNA (aprox. 0,5 µl), 2 µL de azul y
hasta un volumen final de 12 µL con agua DEPC.
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Una vez cargadas las muestras en el gel (12 µL en cada pocillo), este se sumergió
completamente en TAE 1X (40 mL de TAE 50X - 1960 mL Agua MQ) en la cubeta de
electroforesis. El RNA migró a 75-80 voltios desde el polo negativo hasta el positivo,
durante el tiempo necesario para la separación adecuada de los fragmentos de interés.
La electroforesis se dio por finalizada cuando el frente de la carrera alcanzo el 75% de la
longitud del gel. Posteriormente, la imagen fue captada con el sistema de
fotodocumentación (GELdoc de Bio-RAD Molecular Imager ChemiDoc XRS).
Aquellas muestras cuyo rendimiento fue inferior a 2, se procedió a realizar una
purificación con cloruro de litio, dado que el RNA precipita en presencia de dicho
compuesto pero no así DNA, proteínas, azúcares y fenoles, que quedan disueltos en el
sobrenadante, de modo que se puede obtener el RNA purificado a partir del pellet. Se
recomienda hacer la precipitación con volúmenes bajos, para favorecer la precipitación
del RNA al evitar diluirlo demasiado.
3.2.3 Precipitación de RNA con cloruro de litio (LiCl)
1. Añadir al RNA resuspendido en agua DPEC 0.333 volúmenes de LiCl 10M para una
concentración de 2.5M de LiCl. En este caso se añadió 20 µL de LiCl por cada 60 µL de
RNA en agua DPEC.
2. Incubar la mezcla con LiCl overnight a 4 ⁰C (tubos en hielo).
3. Centrifugar 30 min a 4 ⁰C a 13000 rpm.
4. Eliminar sobrenadante (con pipeta cuidadosamente para no arrastrar el pellet).
5. Lavar el pellet con 500 µL de etanol al 70% previamente enfriado a -20 ⁰C. Centrifugar
10 minutos a 4 ⁰C a 13000 rpm.
6. Eliminar el etanol con pipeta cuidadosamente. Terminar de secar el etanol al aire o
en speed vac.
7. Resuspender el pellet en el volumen de 60 µL de agua DEPC durante 1-2 horas
(mantener los tubos en hielo).
19
3.3 PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR o RT-PCR)
3.3.1 Síntesis de DNA
A partir de los RNAs obtenidos, se procedió a la síntesis de cDNA, utilizando para
ello el kit de retrotranscripción Takara (TAKARA, Tokio, JAPON). Según indicaciones del
fabricante, se preparó la mix de reacción indicada en el protocolo, en hielo. Se
dispensaron 3.5 µL del mix en microtubos estériles y libres de RNAsas, añadiendo
entonces 1 µg de los RNAs anteriormente extraídos y completando con agua DEPC hasta
los 10µL de volumen final. Los tubos se etiquetaron debidamente.
Las muestras preparadas se incubaron en el termociclador para la síntesis de
cDNA, usando las siguientes condiciones:
I. 37⁰C, 15 minutos (etapa de transcripción reversa).
II. 85⁰C, 5 segundos (etapa de inactivación de la transcripción).
III. 4⁰C (para su conservación).
Se preparó la siguiente mezcla de reacción en hielo. Se recomienda preparar un
poco más de la mezcla maestra para compensar las pérdidas de pipeteo. Después de
dispensar las alícuotas de esta mezcla en los microtubos, se añadió la muestra de RNA.
Para 1 reacción:
5X PrimerScript Buffer 2 µL
RT Enzyme Mix I 0.5 µL
Oligo dT Primer 0.5 µL
Random 6 mers 0.5 µL
RNA (1µg) x µL
Agua DPEC x µL
vol.final 10 µL
Dependiendo de la cantidad de RNA que se tenga que echar para tener 1µg hasta
los 10µL de volumen final, lo ajustaremos con Agua DPEC.
Los cDNA obtenidos se diluyeron 1/50 en Agua MQ y se comprobó por medio de
un espectrofotómetro que tuvieran una concentración similar.
20
3.3.2 Diseño de primers (o cebadores) para qPCR
Se diseñaron una pareja de primers para el gen VviUCC1 (VIT_12s0059g02640)
usando la secuencia de la versión V1 de la notación del genoma de la vid
(http://genomes.cribi.unipd.it/grape/) mediante el programa informático Oligo
Explorer 1.2. Para su diseño se tuvieron en cuenta parámetros generales como:
(I) Tm (temperatura media).
(II) El contenido de G/C.
(III) La longitud de los primers.
(IV) El tamaño del amplicón.
(V) Y la formación de estructuras secundarias.
Dichos parámetros se optimizaron para obtener la máxima eficiencia bajo las
condiciones estándar de amplificación en un termociclador de tiempo real ABI PRISM
7500 (Applied Biosystems, EEUU). En el diseño también se tuvo en cuenta la
recomendación de no incluir en las 5 últimas bases del extremo 3´más de 2 Cs/Gs .
Las secuencias de la pareja de primers diseñada para el gen VviUCC1 fueron las
siguientes:
Forward: AAGTTTCAAAAGCAGACTATG Reverse: CTGGAGATGAGAGAGGTATGAC
Estas secuencias se enviaron a SIGMA-ALDRICH para su síntesis, y así poder usarlos
en el proceso de qPCR.
3.3.3 Técnica qPCR o RT-PCR
La expresión del gen VviUCC1 en las inflorescencias de las variedades de vid
estudiadas se realizó mediante qPCR, comparando nuestros resultados con los
obtenidos por un gen de referencia (gen ubiquitina). Cada muestra se colocó por
triplicado en la placa, ya que es una técnica bastante sensible. Para ello se siguió el
protocolo de Takara Bio Inc.
Para cada muestra se realizó un mix según el protocolo que se indica a
continuación. Las condiciones que se establecieron en el equipo de PCR a tiempo real
fueron las estándar para el kit comercial utilizado, usando el termociclador ABI PRISM
7500. Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos MicroAmpTM
fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems, EEUU) cubiertas con el film
21
MicroAmpTM optical adhesive film (Applied Biosystems, EEUU). Así, se programó una
desnaturalización inicial de 95 ⁰C durante 10 segundos, seguido de 40 ciclos de dos
pasos: (I) 95 ⁰C/5 segundos y (II) 60⁰C/34 segundos (etapa de la reacción de PCR). Por
último se llevó a cabo una etapa de disociación de tres pasos: (I) 95⁰C/15 segundos, (II)
60⁰C/1 minuto y (III) 95⁰C/15 segundos.
Mix para el protocolo de Takara Bio Inc. para la PCR Real Time con el termociclador ABI
PRISM 7500 (Applied Biosystems, EEUU).
Para 1 reacción:
SYB R (2X) 25µL
Forward Primer (10µM) 1µL
Reverse Primer (10µM) 1µL
ROX Dye I (50X) 1µL
cDNA 4µL
dH2O 18µL
3.3.4 Optimización de la concentración de primers
Para la optimización de la concentración de los cebadores se realizaron nueve
ensayos resultantes de la combinación de 3 concentraciones de cebador directo (300,
600, 900 mMol) con otras 3 concentraciones de cebador reverso (300, 600, 900 mMol).
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 50 µL, según indica
el protocolo de TAKARA, los 4µL de cDNA, fueron un mix preparado de todas las
muestras de cDNA que tenemos de todas las variedades del estudio.
Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo se llevaron a cabo tal y como se describe
en el apartado 3.3.3.
22
3.3.5 Determinación de la eficiencia
Para el ensayo de la eficiencia se realizaron diluciones seriadas 1:10 (8 puntos), se
realizó con el mix de los nueve ensayos descritos anteriormente, previamente a realizar
las diluciones seriadas se realizó una purificación de los productos de PCR mediante el
kit "QIAquick PCR Purificatión Kit".
Para el cálculo de la eficiencia (%) se empleó la ecuación:
E =100[ 10(-1/pendiente)-1]
3.4 Análisis de datos
Obtenidas las curvas de amplificación por la RT-PCR, a partir de estas curvas
específicas de cada muestra se obtuvieron nuestros valores Ct (threshold cycle) para el
gen control y el gen candidato. El valor Ct se determina en la intersección de la línea
umbral con la curva de amplificación incluida en el software del equipo RT-PCR como se
muestra en la figura 5.
Figura 5.Curvas de amplificación RT-PCR con su Ct.
La expresión del gen candidato será normalizada con la expresión del gen control.
Para la normalización de RT-PCR se utilizó el método ∆∆CT (Livak) (Kenneth J. y Thomas
D. Schmittgen, 2001). El método ∆∆CT hace una suposición importante acerca de la PCR,
y se basa en que las eficiencias de amplificación del gen control de referencia y del gen
candidato de interés, deben ser aproximadamente iguales. Específicamente ∆∆CT
asume que en cada ciclo de PCR se duplicará exactamente la cantidad de material en la
muestra (la eficiencia de amplificación = 100 %).
23
PASO 1
Primer diferencial (∆Ct)
∆Ct = Ct muestra, gen candidato - Ct muestra, gen control
PASO 2
Segundo diferencial (∆∆Ct)
∆∆Ct = ∆Ct muestra – ∆Ct referencia (muestra con menor expresión)
PASO 3
2^-(∆∆Ct)
(Kenneth J. Livak y Thomas D. Schmittgen, 2001)
Con este ratio 2^-(∆∆Ct) se realizó un ANOVA en Excell para ver si hay diferencias
significativas entre los diferentes genotipos estudiados.
24
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Concentración y pureza de los RNAs extraídos
4.1.1. Medida cuantitativa (NanoDrop).
Tras realizar la extracción de RNA de todas las inflorescencias se procedió a evaluar
su calidad y su pureza. La concentración (cuantificada con el NanoDrop) y los ratios
calculados entre las absorbancias determinadas a las longitudes de onda UV-VIS 260 nm
y 280 nm (ratio 260/280) y 260 nm y 230 nm (ratio 260/230) se muestran en la tabla 2.
Tal y como suele suceder en este tipo de estudios, se observó una gran variación
en los rendimientos obtenidos, con concentraciones de RNA que variaron entre 82.1
ng/µl (variedad Tempranillo tinto, cepa 3) y 6413.3 ng/µl (variedad Italia, cepa 1).
La relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar la pureza de
DNA y RNA. Una proporción de ~ 1.8 está generalmente aceptada como "puro" para el
DNA; una proporción de ~ 2.0 está generalmente aceptada como "puro" para el RNA.
Si la relación es apreciablemente menor en cualquiera de los caso, esto puede
indicar la presencia de proteína, fenol u otros contaminantes que absorben fuertemente
cerca de 280 nm.
Tabla 2. Calidad y rendimiento de las extracciones de RNA realizadas a partir de inflorescencias de distintas variedades de vid.
Variedad Cepa Concentración (ng/µl)
Ratio 260/280
Ratio 260/230
Método Extracción
Airén 1 1663,5 2,02 2,08 kit sigma
Airén 2 1980,1 2,01 1,77 kit sigma
Airén 3 2981,8 1,99 2,18 kit sigma
Albillo Real 1 1437 2,05 1,96 kit sigma
Albillo Real 2 1098 2,06 1,91 kit sigma
Albillo Real 3 2245,4 2,14 2,21 kit sigma-LICL
Alphonse Lavallee 1 1461,2 2,1 2,09 kit sigma
Alphonse Lavallee 2 1635,1 2,03 1,76 kit sigma
Alphonse Lavallee 3 372 1,91 1,45 kit sigma-LICL
Aramon Noir 1 2263,4 2,04 1,8 kit sigma
Aramon Noir 2 2958,1 1,97 1,9 kit sigma
Aramon Noir 3 208,4 2 1,78 kit sigma-LICL
Barbera Nera 1 521,8 2,11 2,39 kit sigma-LICL
Barbera Nera 2 554,8 2,08 2,2 kit sigma-LICL
Barbera Nera 3 1099,8 1,99 1,71 kit sigma
25
Cabernet Franc 1 864,2 2,06 2 kit sigma
Cabernet Franc 2 248,1 2 1,71 kit sigma-LICL
Cabernet Franc 3 310,9 2,06 1,92 kit sigma-LICL
Cinsaut 1 996,5 1,93 1,75 kit sigma-LICL
Cinsaut 2 437,7 2,03 1,81 kit sigma-LICL
Cinsaut 3 308,4 1,89 1,5 kit sigma-LICL
Delight 1 203,4 1,89 2,33 kit sigma-LICL
Delight 2 1538,2 1,95 1,73 kit sigma
Delight 3 1285,4 2,12 2,15 kit sigma
Italia 1 6413,3 2,06 2,28 kit sigma-LICL
Italia 2 1607,2 2,03 1,85 kit sigma
Italia 3 1179,7 2,02 1,72 kit sigma
Listán Prieto 1 155 1,96 1,59 kit sigma-LICL
Listán Prieto 2 198,8 1,94 1,67 kit sigma-LICL
Listán Prieto 3 195,7 1,96 1,67 kit sigma-LICL
Merlot 1 133,2 1,95 1,6 kit sigma
Merlot 2 1354,6 2,09 1,99 kit sigma
Merlot 3 912,8 2,04 1,97 kit sigma
Moristel 1 2122 1,96 2,01 kit sigma
Moristel 2 741,6 2,03 1,89 kit sigma
Moristel 3 256,4 2,07 2,03 kit sigma
Naparo 1 286,7 2,01 1,7 kit sigma-LICL
Naparo 2 239,8 1,97 2 kit sigma-LICL
Naparo 3 139,1 1,97 1,88 kit sigma-LICL
Paraíso 1 1660,4 2,05 1,81 kit sigma-LICL
Paraíso 2 2242,3 1,99 1,78 kit sigma
Paraíso 3 314,7 2,03 1,72 kit sigma-LICL
Pedro Ximenes 1 445,4 2,02 1,86 kit sigma
Pedro Ximenes 2 581,1 1,92 2,01 kit sigma
Pedro Ximenes 3 437,8 2,05 1,87 kit sigma-LICL
Planta Nova 1 342,5 1,91 1,38 kit sigma-LICL
Planta Nova 2 450,3 1,94 1,43 kit sigma-LICL
Planta Nova 3 301,4 1,97 1,82 kit sigma-LICL
Tempranillo Tinto 1 1420,9 1,98 1,71 kit sigma
Tempranillo Tinto 2 84 1,95 1,67 kit sigma-LICL
Tempranillo Tinto 3 82,1 2,01 1,55 kit sigma-LICL
Tinto Velasco 1 810,3 1,89 2,1 kit sigma-LICL
Tinto Velasco 2 610,6 1,95 1,72 kit sigma-LICL
Tinto Velasco 3 156,9 1,81 1,89 kit sigma-LICL
Torrontes 1 1482,6 2,09 2,06 kit sigma
Torrontes 2 3303,4 2,13 2,25 kit sigma-LICL
Torrontes 3 1303 2,06 1,96 kit sigma
Trebbiano Toscano 1 1868,7 1,94 2,01 kit sigma
Trebbiano Toscano 2 965,8 2,02 1,8 kit sigma
Trebbiano Toscano 3 1619,7 2,04 1,95 kit sigma
26
4.1.2 Medida cualitativa (gel de agarosa)
Igualmente, se procedió a evaluar la calidad y el rendimiento de dicha extracción
de manera cualitativa. Para ello, y tal y como se ha comentado en la sección de
materiales y métodos, se realizó una electroforesis en un gel de agarosa teñido con azul
de bromofenol. La imagen del gel con las muestras de RNA migradas se muestra en la
figura 6.
Figura 6. Gel de agarosa con las 60 muestras de RNA migradas. Las muestras se cargaron en los pocillos del gel según el siguiente orden ascendente: pocillos 1,2,3 Cinsaut; pocillos 4,5,6 Italia; pocillos 7,8,9 Albillo Real; pocillos 10,11,12 Alphonse Lavallee; pocillos 13,14,15 Pedro Ximenes; pocillos 16,17,18 Trebbiano Toscano; pocillos 19,20,21 Airén; pocillos 22,23,24 Cabernet Franc; pocillos 25,26,27 Barbera Nera; pocillos 28,29,30 Tempranillo Tinto; pocillos 31,32,33 Planta Nova; pocillos 34,35,36 Listán Prieto; pocillos 37,38,39 Torrontes; pocillos 40,41,42 Moristel; pocillos 43,44,45 Paraíso; pocillos 46,47,48 Delight; pocillos 49,50,51 Merlot; pocillos 52,53,54 Tinto Velasco; pocillos 55,56,57 Aramon Noir; pocillos 58,59,60 Naparo.
Como se puede apreciar en la Figura 6, no se observa degradación del RNA.
Asimismo, se observó que en 6 de las 60 muestras (pocillos 2, 11, 30, 31, 48 y 51) no se
produjo una correcta migración del RNA.
27
4.2 Optimización de los primers utilizados
Con el fin de identificar las concentraciones optimas de cebadores, se diseñó un
ensayo con nueve combinaciones de 3 concentraciones de primer directo (300, 600, 900
mMol) y 3 concentraciones de primer reverso (300, 600 y 900 mMol). En la tabla 3 se
recogen los resultados de estos ensayos.
Tabla 3. Resultados obtenidos del experimento de optimización del primer.
mMol CT Medio
300 28,9839±0,84
600 29,3377±1,39
900 28,6606±0,58
Por observarse resultados muy similares entre las concentraciones ensayadas, y
con el fin de reducir los costes asociados a la compra de reactivo, se consideró que la
opción más adecuada, era emplear la concentración de 600 mMol, siendo también la
opción que marca en el Protocolo RT-PCR (Takara).
4.3 Determinación de la eficiencia
Los ensayos de eficiencia consistieron en la realización de una recta patrón, a
partir de una serie de diluciones seriadas de los primers diseñados (tabla xxxx). Una vez
obtenidos los valores de Ct (el valor Ct se determina en la intersección de la línea umbral
con la curva de amplificación, dicha aplicación está incluida en el software del equipo
RT-PCR) para cada una de las diluciones ensayadas, mediante la amplificación en la RT-
PCR, se estableció una relación lineal entre dichos valores y la concentración de los
primers (figura 7). El valor de la pendiente se empleó para calcular la eficiencia (%) del
gen control y el gen candidato (uclacianina, VviUCC1).
28
Tabla 4: Ct medios de los primers diseñados para el gen de la uclacianina a distintas concentraciones.
Figura 7. Recta de regresión obtenida entre el valor Ct medio de los primers del gen de la uclacianina a distintas concentraciones.
Tal y como se indicó en materiales y métodos, con la pendiente de la recta se obtuvo
la eficiencia de los primers para el gen de la uclacianina (E= 105%) y para el gen de la
ubiquitina, usado como control (E= 95%). Considerando que la eficiencia de ambos
primers (control y candidato) fueron aproximadamente iguales se aplicó la
y = -3,19x + 29,376R² = 0,9685
0
5
10
15
20
25
30
0 1 2 3 4 5 6
Ct
me
dio
Dilución
Ct PRIMERS DILUCIÓN
12,5032 10-5
17,2561 10-6
20,2509 10-7
23,8731 10-8
25,1446 10-9
29
normalización de RT-PCR utilizando el método ∆∆Ct (Livak)(Kenneth J. Livak y Thomas
D. Schmittgen, 2001)
4.4 RT-PCR
Las reacciones de PCR a tiempo real (RT-PCR) se llevaron a cabo en las 60 muestras
analizadas, con tres réplicas por muestra, tal y como se describe en material y métodos.
En cada placa de RT-PCR se añadió un control negativo (igualmente con tres réplicas).
En estas muestras el volumen de RNA se sustituyó por un volumen igual de agua estéril
y libre de RNA. En la Figura 8 se muestran las curvas de amplificación correspondientes
a la primera de las 5 placas realizadas. Las tres curvas finales (las situadas a la derecha
de la figura) se corresponden al control negativo, es fiable ya que surgen en un ciclo muy
tardío.
Figura 8. Curvas de amplificación de la RT-PCR.
30
A partir de estas curvas de amplificación específicas de cada muestra se
obtuvieron nuestros valores Ct para el gen control y el gen candidato. En la tabla XXXX
se muestra el valor ∆Ct para cada una de ellas, resultado de haber restado el valor de Ct
del gen control al Ct del gen candidato (VviUCC1).
Para utilizar el método de ∆∆Ct se necesita una condición de referencia (Kenneth
J. Livak y Thomas D. Schmittgen, 2001). En nuestro caso se seleccionó el valor obtenido
por la variedad Albillo real como condición de referencia, considerando que fue la
variedad con menor expresión media para el gen candidato (tabla 5).
Tabla 5. Valores ∆CT y ∆∆CT (vs Albillo real) obtenidos para cada variedad.
Genotipo Variedad ∆ct ∆∆ct vs albillo real Ratio vs albillo real 2^∆∆ct
C:T Airén 10,1722±0,65 -0,9062 1,8742 C:T Albillo Real 11,07844±0,78 0 1 T:T Alphonse Lavallee 9,534522±1,04 -1,5439 2,9159 C:C Aramon Noir 6,317198±5,39 -4,7612 27,1193 C:C Barbera Nera 8,413551±1,18 -2,6649 6,3418 C:C Cabernet Franc 10,58668±1,45 -0,4918 1,4062 C:C Cinsaut 9,2392±1,09 -1,8392 3,5782 C:C Delight 5,289107±1,58 -5,7893 55,3050 C:T Italia 9,068231±2,16 -2,0102 4,0284 T:T Listán Prieto 6,045905±2,63 -5,0325 32,7299 C:C Merlot 5,26173±1,45 -5,8167 56,3645 C:T Moristel 6,378335±2,71 -4,7001 25,9940 T:T Naparo 1,883537±2,11 -9,1949 586,0612 C:T Paraíso 3,643949±1,88 -7,4345 172,9840 T:T Pedro Ximenes 10,14291±1,68 -0,9355 1,9126 C:T Planta Nova 9,352413±1,29 -1,7260 3,3082 C:C Tempranillo Tinto 4,690108±3,39 -6,3883 83,7685 C:C Tinto Velasco 4,007908±1,38 -7,0705 134,4136 T:T Torrontés 6,269952±1,23 -4,8085 28,0221 C:C Trebbiano Toscano 9,18776±1,54 -1,8907 3,7081
El ratio 2^∆∆CT (tabla 5) nos permitió comparar la expresión del gen candidato
(VvUCC1) entre las 20 variedades analizadas (figura 9).
31
Figura 9. Expresión relativa del gen VviUCC1 en las 20 variedades de vid analizadas en este trabajo.
A partir de los resultados obtenidos se realizó un análisis de la varianza de una vía
(ANOVA) para determinar si existen diferencias significativas entre los tres genotipos
existentes para el SNP K-88 (C:T, T:T, C:C), usando para ello el ratio 2^∆∆CT.
Los resultados se muestran en la tabla 6. A pesar de observarse que algunas de las
variedades con el genotipo T:T presentan mayores valores de expresión para el gen
candidato (FIGURA 9), se observó un resultado no significativo (α= 0,42) para el ANOVA,
lo que indica que no existe diferencia significativa en la expresión del gen VvUCC1 entre
los tres genotipos detectados para K-88.
0
100
200
300
400
500
600
700
Air
én
Alb
illo
Rea
l
Alp
ho
nse
Lav
alle
e
Ara
mo
n N
oir
Bar
be
ra N
era
Cab
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et
Fran
c
Cin
sau
t
De
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t
Ital
ia
List
án P
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to
Me
rlo
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Mo
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el
Nap
aro
Par
aíso
Pe
dro
Xim
en
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Pla
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No
va
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pra
nill
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into
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to V
elas
co
Torr
on
tés
Treb
bia
no
To
scan
o
Rat
io v
s al
bill
o r
eal (
2-d
dct
)
Variedades
Expresión Uclacianina
32
Tabla 6 .Análisis de la varianza (ANOVA)
Análisis de varianza de un factor RESU
MEN
Grupos Cuenta Suma Promedi
o Varianza
Columna 1 6
209,188818
34,864803
4667,5048
Columna 2 5
651,641637
130,328327
65102,2391
Columna 3 9
372,005197
41,3339107
2093,44539
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las
variaciones Suma de
cuadrados Grados
de libertad
Promedio de los
cuadrados F Probabilidad
Valor crítico para F
Entre grupos
31602,9339 2
15801,467
0,8939443
0,42741822
3,59153057
Dentro de los grupos
300494,043 17
17676,1202
Total 332096,
977 19
33
5. CONCLUSIONES
Se consiguió extraer satisfactoriamente el RNA de las inflorescencias de las 20
variedades distintas de vid y sintetizar sus correspondientes cDNAs.
Al estudiar los resultados obtenidos de la expresión génica del gen candidato
uclacianina (VvUCC1) mediante la técnica de RT-PCR, los valores más altos de
expresión se obtuvieron en algunas de las variedades que presentaban el genotipo
T:T.
De las 20 variedades de vid estudiadas con diferentes genotipos (C:C, C:T, T:T) para
el polimorfismo(K-88) detectado en el promotor del gen uclacianina (VvUCC1), se
obtuvo un resultado no significativo (α= 0,42) para el ANOVA, lo que indica que no
existe diferencia significativa en la expresión del gen VvUCC1 entre los tres genotipos
detectados para K-88 en el estadío estudiado.
La variedad con los valores más altos de expresión del gen uclacianina (VvUCC1) fue
la variedad Naparo. Esto es debido a que el gen control ubiquitina no se expresó.
Esto puede ser debido, a que esta variedad es femenina, motivo por el cual dio
problemas al extraer el RNA de las inflorescencias.
Estos resultados obtenidos nos indican que sería interesante realizar estudios
posteriores en los estadios anterior y posterior al realizado en este trabajo, así como
una optimización en el diseño de los primers.
34
6. BIBLIOGRAFÍA
Aikaterini N. Vartholomaiou, Emmanuel I. Navrozidis (2008). Agronomic
techniques to control Lobesia botrana. Volume 36, Issue 3, pp 264-271.
Barco Royo, Emilio (2008). Análisis de un sector: el Rioja entre dos siglos. (Ed.)
Gobierno de La Rioja. Colección monografías 14, 352 pp.
Bayo-Canha, A., Fernandez-Fernandez, J. I., Martinez-Cutillas, A., Ruiz-Garcia, L.
(2012). Phenotypic segregation and relationships of agronomic traits in Monastrell x
Syrah wine grape progeny. Euphytica 2012, 186:393-407.
Bergqvist, J., Dokoozlian, N., Ebisuda, N. (2002). Sunlight exposure and temperature
effects on berry growth and composition of Cabernet sauvignon and Grenache in the
Central San Joaquin Valley of California. American Journal of Enology and Viticulture
2002, 52(1):1-7.
Checa Caratachea, M.A. (2007). Polimorfismos genéticos: Importancia y
aplicaciones Unidad de Investigación, INER Ismael Cosío Villegas. T.
Diaz-Riquelme, J., J.M. Martínez-Zapater, and M.J. Carmona (2014). Transcriptional
analysis oftendril and inflorescence development in grapevine (Vitis vinifera L.). PLoS
ONE 9, e92339.
Fasoli, M., S. Dal Santo, S. Zenoni, G.B. Tomielli, L. Farina, A. Zamboni, A. Porceddu,
L. Venturini, M. Bicego, V. Murino, A. Ferrarini, M. Delledonne, and M. Pezzotti (2012).
The grapevine expression atlas reveals a deep transcriptome shift driving the entire
plant into a maturation program. The Plant Cell 24, 3489-3505.
Ginzinger DG (2002). Gene quantification using real-time quantitative PCR: An
emerging technology hits the mainstream. Exp Hematol 30(6): 503-512.
Gu C, Chen S, Liu Z, Shan H, Luo H, Guan Z, Chen F (2011). Reference gene selection
for quantitative real-time PCR in Chrysanthemum subjected to biotic and abiotic stress.
Oct;49(2):192-7. doi: 10.1007/s12033-011-9394-6.
35
Hidalgo Togores, J. (2006). La calidad del vino desde el viñedo. Ediciones Mundi-
Prensa.
Kainz P (2000). The PCR plateau phase- towards an understanding of its limitations.
BBA-Gene Struct Expr 1494(1-2): 23-27.
Kenneth J. Livak y Thomas D. Schmittgen (2001). Analysis of Relative Gene
Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 22DDCT Method.
Labrador-Silva, A. (2002). Avaliação das paisagens da bacia hidrográfica da ribeira
de Colares-Estudo geográfico e de percepção ambiental.
Laguna-Ullan, N. (2011). Estudio preliminar de la compacidad de racimo de vid.
Trabajo final cursos de doctorado "Ecosistemas Agrícolas Sostenibles". Universidad de
la Rioja.
Martínez de Toda Fernando, Juan Carlos Sancha, Javier Tardáguila (2007).
Estimación de la calidad de la uva en el viñedo mediante un nuevo índice vitícola.
Martínez de Toda, F. (2008). Claves de la viticultura de calidad. Nuevas técnicas de
estimación y control de la calidad de la uva en el viñedo. Ediciones Mundi-Prensa.
Martins Marques Costa, Thais (2013). Caracterización fisiológica y genética de las
poblaciones naturales de Botrytis cinerea de los viñedos de Castilla y León.
Méndez Sánchez, JV. (2005). Estudio de la maduración fenólica y antociánica en uvas
tintas de bobal para diferentes condiciones agrológicas. Universitat Politècnica de
València. doi:10.4995/Tesis/10251/1853.
O.I.V. Organización internacional de la Viña y el Vino. Situation and statistics of the
vine and wine sector worldwide.
Sánchez Díaz, Ana Cristina (2012). Identificación y cuantificación de especies del
género Merluccius mediante la utilización de PCR a Tiempo Real. Tesis Doctoral, 2012.
Tardaguila, J., Martinez de Toda, F., Poni, S., Diago, M. P. (2010). Impact of early
leaf removal on yield and fruit and wine composition of Vitis vinifera L. Graciano and
Carignan. American Journal of Enology and Viticulture 2010, 61(3):372-381.
36
Tello Javier, Rafael Torres‑ Perez, Jérôme Grimplet, Javier Ibáñez (2016).
Association analysis of grapevine bunch traits using a comprehensive approach.
Tello, J., R. Aguirrezábal, S. Hernáiz, B. Larreina, M.I. Montemayor, E. Vaquero y J.
Ibáñez (2015). Estudio intervarietal y multi-factorial de la diversidad natural para la
compacidad del racimo de vid (Vitis vinifera L.).
Tello-Moro, J. (2012). Estudio del caracter compacidad de racimo de vid (Vitis
vinifera L.) y propuesta de indices para su medida objetiva. Trabajo final cursos de
doctorado "Ecosistemas Agrícolas Sostenibles". Universidad de la Rioja.
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