evaluaciÓn del efecto de Ácido giberÉlico con agua de coco y caseÍna hidrolizada como fuentes de...
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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE ÁCIDO GIBERÉLICO CON AGUA DE COCO Y CASEÍNA HIDROLIZADA COMO FUENTES DE NITRÓGENO EN LA MADURACIÓN DE EMBRIONES DE PALMA COCO CUMBÉ (Parajubaea cocoides Burret) OBTENIDOS A PARTIR DE CALLOS, MEDIANTE ESTABLECIMIENTO DE SUSPENSIONES CELULARES.
BLANCA ESTHELA ENCALADA ALDAZ
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
M.Sc. Grace Tatiana Páez Barrera Codirectora
Ing. Cristian Javier Peña Pontón Director
Dr. Marcelo Mejía Secretario Académico
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Parajubaea cocoides Burret
Palma alto andina
Palma alto andina
Valles y
alturas ecuatoriales
Suramérica Colombia
hasta Ecuador
Suramérica Colombia
hasta Ecuador
15-20 m. de altura 15-20 m. de altura
EndocarpioEndocarpio
ArecaceaeArecaceae
Palma solitaria monoica
Palma solitaria monoica
Espermatofita
Angiosperma
Dicotiledóna
Tallo lisoTallo lisoHojas pinadas Hojas pinadas
InflorescenciaInflorescenciaInfrutescenciasInfrutescenciasFrutos
elipsoides Frutos
elipsoides
Seis y ocho meses Endospermo sensibleRaíces sensibles
Distrito Metropolitano de Quito emprende proyectos para la
reforestación de esta especie.
Distrito Metropolitano de Quito emprende proyectos para la
reforestación de esta especie.
Especie amenazada
Especie amenazada
Embriogénesis somática
Fusión de gametos Fusión de gametos
ETAPAS-Inducción
-Proliferación-Diferenciación
-Maduración -Germinación
ETAPAS-Inducción
-Proliferación-Diferenciación
-Maduración -Germinación Tipos de
embriogénesis Tipos de
embriogénesis
Embriogénesis Somática Directa
Embriogénesis Somática Directa
Embriogénesis Somática Indirecta
Embriogénesis Somática Indirecta
Eje radicular
Eje apical
v
Fases de los embrionesFases de los embriones
Globular Globular Corazón Corazón Torpedo Torpedo Cotiledonar Cotiledonar
OBJETIVOS OBJETIVOS
Evaluar el efecto de ácido giberélico, agua de coco y caseína hidrolizada en la maduración de embriones somáticos de palma coco cumbé (Parajubaea cocoides Burret) obtenidos a partir de callos, mediante establecimiento de suspensiones celulares.
GENERAL GENERAL
ESPECÍFICOS ESPECÍFICOS
Validar el método de desinfección, establecimiento e inducción de callo embriogénico de palma coco cumbé.
Evaluar el efecto y la concentración adecuada de ácido giberélico en la maduración de los embriones somáticos.
Evaluar el efecto del agua de coco y caseína hidrolizada como fuente de nitrógeno orgánico.
METODOLOGÍA METODOLOGÍA
Fase de maduración de embriones
somáticos
• M& S(1962) a la mitad de su concentración
• 0.1 mg L-1 ácido indol acético• 0.8 mg L-1 de benzilaminupurina• 2.5 mg L-1 sulfato de adenina• 40 g L-1 de sacarosa
Tratamientos GA3 (mg L-1) Fuente de nitrógeno
M1 1.5 Agua de coco (35 ml)
M2 3 Agua de coco (35 ml)
M3 1.5 Caseína hidrolizada (200 mg L-1)
M4Control
3-
Caseína hidrolizada (200 mg L-1)-
Fase de identificación embrionaria
Tratamientos de la maduración Tratamientos de la maduración
Fuente: (Muñoz, 2003; Jha et al., 2007; Sujatha et al., 2008).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN
(A) Embriones sembrados después de la desinfección, (B) Explante sin contaminación, (C) Explante
contaminado
(A) Embriones sembrados después de la desinfección, (B) Explante sin contaminación, (C) Explante
contaminado
Fase de desinfección Fase de desinfección
90 embriones sembrados
90 embriones sembrados
Contaminación del 1,11%
Contaminación del 1,11%
Sobrevivencia del 98,89%
Sobrevivencia del 98,89%
Fase de inducción de callo embriogénico
Fase de inducción de callo embriogénico
(A) Callos sembrados, (B) Porción de callo friable (A) Callos sembrados, (B) Porción de callo friable
Cinética celular Cinética celular
Conteo celular en Parajubaea cocoides Burret (A) fase de retraso, (B) fase exponencial, (C) fase logarítmica, (D) fase estacionaria.
Conteo celular en Parajubaea cocoides Burret (A) fase de retraso, (B) fase exponencial, (C) fase logarítmica, (D) fase estacionaria.
Fase de establecimiento de las suspensiones celulares
Fase de establecimiento de las suspensiones celulares
(a) Eliminación del medio de cultivo, (b) Reposición del medio en la suspensión,
(c) suspensión de color translucida
(a) Eliminación del medio de cultivo, (b) Reposición del medio en la suspensión,
(c) suspensión de color translucida
16 días
C1: 1.5 mg L-1 de GA3 y 35 ml de ACC1: 1.5 mg L-1 de GA3 y 35 ml de AC
C2: 3 mg L-1 de GA3 y 35 ml de ACC2: 3 mg L-1 de GA3 y 35 ml de AC
22 días
C3: 1.5 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada
C3: 1.5 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada
C4: 3 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada
C4: 3 mg L-1 de GA3 y 200 mg L-1 de caseína hidrolizada
Curva de la cinética celularCurva de la cinética celular Ajuste del crecimiento celular Ajuste del crecimiento celular
Día 16
Suspensión uno Suspensión uno
Curva de la cinética celularCurva de la cinética celular Ajuste del crecimiento celular Ajuste del crecimiento celular
Suspensión dos Suspensión dos
Día 16
Curva de la cinética celularCurva de la cinética celularAjuste del crecimiento celular Ajuste del crecimiento celular
Día 22
Suspensión tres Suspensión tres
Curva de la cinética celularCurva de la cinética celularAjuste del crecimiento celular Ajuste del crecimiento celular
Suspensión cuatro Suspensión cuatro
Día 22
Mejor suspensionMejor suspension Formación de células Formación de células
Análisis de varianza paramétrica y prueba de LSD Fisher Análisis de varianza paramétrica y prueba de LSD Fisher
Fase de maduración de embriones somáticos
Fase de maduración de embriones somáticos
(A) embriones necrosados en el tratamiento testigo, (B) embriones en desarrollo
(A) embriones necrosados en el tratamiento testigo, (B) embriones en desarrollo
Sin fuentesSin fuentes
Nitrógeno Nitrógeno GA3 GA3
Necrosan Necrosan
Mueren Mueren
Prueba de Kruskal-Wallis Prueba de Kruskal-Wallis
Embrión globular Embrión globular
73.43%
53.43%
Porcentaje de formación de embriones Porcentaje de formación de embriones
Prueba de Kruskal-Wallis Prueba de Kruskal-Wallis
Embrión corazón Embrión corazón
Porcentaje de formación de embriones Porcentaje de formación de embriones
25.64%23.30%
Prueba de Kruskal-Wallis Prueba de Kruskal-Wallis
Embrión torpedo Embrión torpedo
Porcentaje de formación de embriones Porcentaje de formación de embriones
30.82%
26.34%
Prueba de Kruskal-Wallis Prueba de Kruskal-Wallis
Embrión cotiledonar Embrión cotiledonar
Porcentaje de formación de embriones Porcentaje de formación de embriones
45.36%
40.79%
Porcentajes de embriones en sus distintas fases Porcentajes de embriones en sus distintas fases
Número total de embriones formados en los cuatro tratamientos
Número total de embriones formados en los cuatro tratamientos
Prueba de Kruskal-Wallis Prueba de Kruskal-Wallis
335
386429
486
CONCLUSIONES CONCLUSIONES
El mejor protocolo de desinfección para la inducción de callo, fue utilizando una concentración de NaClO al 2.5%, con un tiempo de inmersión de diez minutos.Se obtuvo un porcentaje de contaminación en la inducción del callo del 1,11%, por lo tanto la sobrevivencia de los embriones fue de 98,89%.El mejor tratamiento para la inducción de callo, fue el tratamiento con (60 mg L-1 2,4 D y 1 g L-1 carbón activado), ya que presentó viabilidad y formación de callos friables.El mejor tratamiento para el establecimiento de las suspensiones celulares, fue el tratamiento con (1.5 y 3 mg L-1 de ácido giberélico con 200 mg L-1 de caseína hidrolizada), ya que presentan la media más alta con respecto a la formación de células en relación al tiempo.El mejor tratamiento para la maduración de embriones, fue el tratamiento con (3 mg L-1 de ácido giberélico con 200 mg L-1 de caseína hidrolizada), ya que se observó embriones en todas las fases, y se obtuvo 45.36% de embriones en fase cotiledonar. El agua de coco como fuente de nitrógeno, no favoreció la obtención de embriones en fase cotiledonar, sin embargo, se obtuvo un 73,43% de embriones en fase globular.
RECOMENDACIONES RECOMENDACIONES
Para el proceso de maduración, se debería probar con la adición de 150 mg L -1 glutamina, que según varios autores incrementa los niveles de aminoácidos libres, y el porcentaje de proteínas; además de mejorar el tamaño de los embriones y su frecuencia de conversión.Para alcanzar un alto grado de sincronización en el crecimiento de los embriones somáticos en un mismo tejido o en suspensión celular, se debería utilizar ácido abcísico (ABA).Realizar un estudio histológico en cada etapa de la embriogénesis somática, para así, determinar los cambios estructurales y morfológicos de los embriones. Es necesario continuar con el proceso de germinación de los embriones y aclimatación de las plántulas, para de esta forma determinar la efectividad del protocolo.
AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS
Ingeniero Cristian Javier Peña PontónM.Sc. Grace Tatiana Páez Barrera
Ingeniero Pedro Romero
Ingeniera Maria Jose Basantes Ingeniero Segundo Aguilar
GRACIAS
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