evaluación preliminar de la diversidad genética de ... · forjan la identidad de las comunidades...
Post on 19-Nov-2020
7 Views
Preview:
TRANSCRIPT
1
Evaluación preliminar de la diversidad genética de morfotipos de ibia (Oxalis
tuberosa Mol.) en municipios de Ventaquemada y Turmequé (departamento de
Boyacá) por medio de marcadores ISSR
Lucia Carolina Uribe Montes
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
Bióloga
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
Bogotá D.C. 2015
2
Evaluación preliminar de la diversidad genética de morfotipos de ibia (Oxalis tuberosa
Mol.) en municipios de Ventaquemada y Turmequé (departamento de Boyacá) por
medio de marcadores ISSR
Lucia Carolina Uribe Montes
Directora
María del Pilar Márquez Cardona M.Sc.
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Departamento de Biología
Bogotá D.C. 2015
3
Evaluación preliminar de la diversidad genética de morfotipos de ibia (Oxalis tuberosa
Mol.) en municipios de Ventaquemada y Turmequé (departamento de Boyacá) por
medio de marcadores ISSR
Lucia Carolina Uribe Montes
APROBADO
_________________________ _________________________
Andrea Forero Ruiz Concepción Judith Puerta
Directora Carrera de Biología Decana Facultad de Ciencias
4
Evaluación preliminar de la diversidad genética de morfotipos de ibia (Oxalis tuberosa
Mol.) en municipios de Ventaquemada y Turmequé (departamento de Boyacá) por
medio de marcadores ISSR
Lucia Carolina Uribe Montes
APROBADO
_________________________
María del Pilar Márquez M.Sc
Directora
________________________
Neidy Clavijo Ponce M.Sc
Jurado
5
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien
se vean en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
6
Agradecimientos
A mis padres y mi hermana por el inmenso amor que me brindan cada minuto del día y por
hacerme feliz.
A mi directora de trabajo de grado María del Pilar Márquez por su confianza depositada en
mí, su ayuda, enseñanzas y su compañía durante este proceso.
A Neidy Clavijo por ser un ejemplo para mí, a través de su trabajo en el campo con las
comunidades y por sus correcciones y enseñanzas en salida de campo.
A los agricultores de los municipios de Turmequé y Ventaquemada por abrirnos las puertas
de sus hogares y compartir su sabiduría con nosotros.
A mis amigos y compañeros del laboratorio de Biologia Molecular Vegetal por su gran
colaboración, amabilidad, y compañía.
A María Paula y Juan Felipe y mis amigos que me han acompañado y apoyado
inmensamente durante la carrera, gracias.
7
Tabla de contenido
Resumen .............................................................................................................................................. 8
Introducción ........................................................................................................................................ 8
Justificación y planteamiento del problema ..................................................................................... 10
Marco teórico .................................................................................................................................... 12
Los tubérculos andinos.................................................................................................................. 12
Pérdida de diversidad genética y estrategias de conservación .................................................... 13
Oxalis tuberosa Molina ................................................................................................................. 15
El estudio de la diversidad genética .............................................................................................. 17
a. Cómo se estudia la diversidad genética ............................................................................ 17
b. PCR ....................................................................................................................................... 18
c. Marcadores ISSR ................................................................................................................ 19
d. Extracción de ADN ............................................................................................................. 20
e. Estudios de diversidad de ibia por medio de ISSR ............................................................ 22
Pregunta de investigación ................................................................................................................. 24
Objetivos ........................................................................................................................................... 24
Objetivo general ............................................................................................................................ 24
Objetivos específicos ..................................................................................................................... 24
Metodología ...................................................................................................................................... 24
Fase de campo: ............................................................................................................................. 25
Localización y material vegetal ................................................................................................. 25
Fase de laboratorio ....................................................................................................................... 27
Extracción de ADN ..................................................................................................................... 27
Métodos de análisis del ADN .................................................................................................... 29
PCR ............................................................................................................................................ 29
Análisis de Diversidad Genética ................................................................................................ 31
Resultados ......................................................................................................................................... 32
Extracción de ADN ......................................................................................................................... 32
Condiciones de PCR ....................................................................................................................... 34
Polimorfismo ................................................................................................................................. 35
Evaluación de la diversidad ........................................................................................................... 36
Discusión ........................................................................................................................................... 39
Extracción de ADN ......................................................................................................................... 39
Estandarización PCR ..................................................................................................................... 41
8
Evaluación de la diversidad de muestras de ibia .......................................................................... 42
Conclusiones ..................................................................................................................................... 46
Recomendaciones ............................................................................................................................. 47
Bibliografía ........................................................................................................................................ 48
Anexo 1 formato de datos para colecta ............................................................................................ 52
Anexo 2. Ejemplo de formato de etiquetas para herbario ............................................................... 53
Anexo 3. Lista de accesiones incluidas en estudio de diversidad. .................................................... 54
Anexo 4 Individuos de Oxalis tuberosa utilizados para pruebas de extracción ................................ 55
Anexo 5. Gráficos de medias para parámetros evaluados durante la extracción de ADN ............... 56
Anexo 6 Prueba de amplificación con primers RAM ......................................................................... 57
Anexo 7. Protocolo y concentraciones para primers RAM ............................................................... 58
Anexo 8. Evidencia para condiciones adecuadas de PCR .................................................................. 60
Anexo 9. Protocolo Pissard ............................................................................................................... 61
Anexo 10 Matriz binaria .................................................................................................................... 62
Anexo 12.Tabla de colores de tallos .................................................................................................. 69
Anexo 13 Extracción de 29 muestras de ibia por medio de protocolo CTAB1 ................................. 70
Resumen
La región andina ha sido un centro de domesticación de cultivos entre los que se encuentran
tres especies de tubérculos andinos consideradas especies infrautilizadas o marginadas. Las
especies conocidas en Colombia como Ruba, Cubio e Ibia se encuentran fuertemente ligadas
a prácticas de manejo de cultivos y usos tradicionales, que conforman una identidad en las
comunidades de indígenas y pequeños productores. En estas especies se ha reconocido un
posible proceso de erosión genética, lo que indica la necesidad de caracterizar la variabilidad
genética en regiones consideradas microcentros de diversidad, lo cual permite establecer
estrategias de conservación. Uno de los posibles microcentros de diversidad en Colombia
corresponde a los municipios de Ventaquemada y Turmequé en el departamento de Boyacá.
Con base en caracterizaciones previas de los sistemas productivos de estos cultivos en la
región y la determinación de algunos morfotipos, se realizó una caracterización molecular de
la variabilidad genética intraespecífica de la especie Oxalis tuberosa M. (ibia). Para llevar a
cabo el estudio, es necesaria una estandarización de la extracción de ADN y amplificación
por PCR con marcadores moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Se define que
9
la extracción resulta exitosa para las muestras de ibia con un protocolo reportado en estudios
previos de O. tuberosa. En cuanto a las condiciones de PCR se determinó que el patrón de
bandeo más claro resulta de aumentar las concentraciones de los reactivos reportadas en
trabajos previos de diversidad de tubérculos andinos. El estudio de diversidad exhibe que en
general las muestras se agrupan según su morfotipo, sin embargo se hace necesario
corroborar esta evaluación preliminar con datos que permitan obtener análisis más robustos.
Introducción
Considerando que el número de alimentos que conforman la dieta básica de la población
mundial se restringe principalmente a maíz, arroz, trigo y papa, es fundamental indagar en
las posibilidades de diversificación de la dieta. Esta vulnerabilidad actual del sistema
alimentario mundial exige emprender esfuerzos por superarla, tales como la investigación
en torno a cultivos que se han denominado marginados o infrautilizados (Galluzzi et al.,
2013). La contribución de estas investigaciones busca comprender el potencial de estas
especies y su valor cultural, nutricional y económico.
Entre estos cultivos marginados se encuentran tres especies de tubérculos andinos Ruba
(Ullucus tuberosus Caldas), Cubio (Tropaeolum tuberosum Ruiz y Pavón) e Ibia (Oxalis
tuberosa Molina) que han hecho parte de la dieta de comunidades indígenas y campesinas de
los países andinos por cientos de años. Hasta el momento se han adelantado pocos estudios
relacionados con estos cultivos, los cuales provienen principalmente de entidades nacionales
e internacionales en Perú, Ecuador y Bolivia. En el caso de Colombia existen algunas
investigaciones relacionadas con etnobotánica, estudio de las prácticas de manejo, fisiología
vegetal y características morfológicas de los tubérculos. Sin embargo estos estudios no han
tenido una alta divulgación e impacto, a pesar de que son un punto de partida para reconocer
la importancia nutricional, cultural y otros usos potenciales de estas especies (Clavijo et al.,
2014).
Teniendo en cuenta la limitada disponibilidad de información con respecto al estudio de estos
tubérculos, es claro que es necesario un mayor aporte de investigación desde distintitos
enfoques. Entre estos, la biología molecular puede proveer herramientas para el estudio de
estas especies, logrando comprender el posible efecto de las prácticas de manejo tradicionales
y la marginalidad, sobre la diversidad genética de los tubérculos (Pissard et al., 2006).
10
En el presente trabajo se implementan los marcadores moleculares denominados ISSR (Inter-
secuencias simples repetidas) para evaluar la diversidad intra específica en las ibias (Oxalis
tuberosa). Para efectuar el estudio se realizó un muestreo en fincas de pequeños agricultores
en los municipios de Turmequé y Ventaquemada (Boyacá), colectando material vegetal de
diferentes morfotipos identificados por los agricultores con base en las características
externas del tubérculo (color). Los estudios previos en la zona señalan la existencia de 5
morfotipos para esta región que corresponden a ibias amarillas, blancas, rosadas, rojas y
amarillas con rayas rojas (Clavijo et al., 2014).
Junto con un estudio de diversidad de la especie Tropaeolum tuberosum (Cubio) desarrollado
a la par, la presente investigación de variabilidad intraespecífica con la ibia se enmarca dentro
de un macro-proyecto interdisciplinar denominado “Memoria histórica, caracterización
genética y aprovechamiento alimentario de tubérculos andinos marginados en las provincias
de Centro y Márquez (Boyacá)”. Este busca realizar caracterizaciones de la zona y de los
cultivos existentes desde tres enfoques, que además de la caracterización genética incluyen
una caracterización bromatológica y nutricional y finalmente una enfoque histórico, que
estudia los cambios sociales, culturales y agroecológicos de los agroecosistemas y su entorno
a través del tiempo.
El estudio de la diversidad se lleva a cabo por medio de marcadores ISSR y busca evaluar la
posibilidad de considerar estos morfotipos como variedades genéticas. Para lograr un
resultado final es necesario procesar las muestras colectadas en el laboratorio y someterlas a
un proceso previo de extracción de ADN y hallar condiciones adecuadas de la técnica de
PCR. A continuación se presentan los resultados de este proceso, que significarán un aporte
hacia la comprensión de las dinámicas y la importancia de estos cultivos, buscando lograr el
uso sostenible y la conservación de la agrobiodiversidad1 de nuestro país.
Justificación y planteamiento del problema
Por miles de años los países andinos han sido centros fundamentales de diversidad y
domesticación de cultivos que han desarrollado adaptaciones para estas regiones específicas.
De los cultivos domesticados existen tres especies de tubérculos de diferentes familias
1 Considerando que la biodiversidad se refiere a la variedad de organismos vivos a diferentes niveles taxonómicos, la
agrobiodiversidad corresponde específicamente a la diversidad entre y dentro de especies y poblaciones de plantas y animales de importancia agronómica. Dentro de esta diversidad se incluye también parientes silvestres (FAO, 2004).
11
botánicas poco conocidas internacional e incluso localmente, que guardan similitudes
morfológicas entre ellos: la ruba, el cubio y la ibia (Clavijo, 2014).
Estas especies han sido consideradas especies marginadas o infrautilizadas por asociarse a
prácticas de manejo tradicionales, condiciones agroecológicas poco favorables y baja
competitividad en el mercado, distribuyéndose principalmente en mercados locales (Galluzzi
et al, 2013). Sin embargo especies marginadas como los tubérculos andinos tienen una gran
importancia en la búsqueda de la diversificación de la dieta global.
Estos recursos se han mantenido hasta la actualidad gracias a comunidades indígenas y
campesinas, sin embargo, la pérdida progresiva de conocimiento tradicional y la presión del
mercado ha ocasionado un proceso de erosión genética, generando la disminución de recursos
que tienen un uso y valor potencial que aún no se ha estudiado ampliamente. Esto se
encuentra ligado a la pérdida de prácticas de manejo de cultivos y usos tradicionales que
forjan la identidad de las comunidades andinas (FAO, 2012; Galluzzi et al., 2013; Clavijo et
al., 2014;).
Para evitar esta pérdida y establecer métodos de conservación apropiados para los cultivos,
es necesario el estudio de la diversidad genética en zonas estratégicas. Hasta el momento
estos estudios de diversidad en Colombia han sido muy reducidos, reportándose algunos
esfuerzos de caracterización de los sistemas de producción en el departamento de Nariño
(Rosero, 2010) y Boyacá (Clavijo et al., 2011; Aguirre et al., 2012).
Con el fin de construir estrategias de conservación se debe tener en cuenta que la distribución
de la variabilidad se da en forma desigual, concentrándose en zonas denominadas
“microcentros”, los cuales cuentan con condiciones favorables para el establecimiento de
estos cultivos (García & Cadima, 2003). Al respecto Clavijo y Pérez (2014) indican la posible
existencia de un microcentro de diversidad en los municipios de Turmequé y Ventaquemada
(Boyacá), identificando presencia de ibias, cubios y rubas a diferentes escalas de siembra en
la región. Estos cultivos representan la base principal de la alimentación familiar (Clavijo &
Pérez, 2014).
Hasta el momento en la zona se han realizado estudios de reconocimiento de sistemas de
producción y se identificaron diferentes morfotipos de las especies mencionadas (Clavijo,
12
2014). Para contribuir al reconocimiento de los posibles efectos de la erosión genética en
estos cultivos y establecer la posibilidad de reconocer esta región como un microcentro de
diversidad, la caracterización de la variabilidad genética de las diferentes especies es
indispensable (FAO, 2010).
La ibia, Oxalis tuberosa M. es una de las especies de tubérculos cultivados en esta región
de la cual se han identificado hasta el momento en las fincas de los municipios Turmequé y
Ventaquemada, cinco morfotipos (rosados, amarillos, rojos, blancos y amarillos con rayas
rojas) (Clavijo, 2014). En el presente estudio se plantea como objetivo general, la evaluación
molecular de la diversidad existente entre estos morfotipos.
La caracterización molecular debe incluir una fase inicial de estandarización para lograr
finalmente evaluar la diversidad entre la totalidad de las muestras por medio de los
marcadores moleculares ISSR (Weising et al., 2005). Se espera contribuir al conocimiento
de los patrones de diversidad de esta especie, que puedan incluso servir como modelos de
otras especies con condiciones agroecológicas similares y lograr un aprovechamiento
sostenible de la biodiversidad que ofrecen los suelos colombianos.
Marco teórico
Los tubérculos andinos
Las rubas, cubios e ibias han evolucionado en ambientes inusuales que se caracterizan por
alturas entre 2400 y 4000 msnm, climas fríos y niveles de precipitación anuales entre los
rangos de 700 – 800 mm para rubas, 700-1600mm para los cubios y 570-2500mm para las
ibias. Estas especies de tubérculos poseen una alta tolerancia a condiciones de erosión,
fluctuaciones en temperaturas y lluvias, suelos empobrecidos y alta radiación UV (Flores et
al., 2003).
Estos cultivos son considerados patrimonio ambiental y cultural. Bajo este contexto, las
relaciones entre las prácticas en el campo, los valores e interacciones sociales, son
fundamentales para conformar una memoria colectiva que le confiere un sentido de
pertenencia e identidad a las comunidades. Si bien estas tradiciones se encuentran ligadas a
un sistema económico local, determinan una cultura rural que se mantiene a través de las
generaciones (Clavijo et al., 2011).
13
La investigación alrededor de estos cultivos se empieza a desarrollar a partir de 1979 (Clavijo
et al., 2004). Los estudios se han establecido en torno a temas de conservación, diversidad
genética y sistemas de producción (Malice & Baudoin, 2009). Estos se han desarrollado
generalmente en Ecuador, Bolivia y Perú, donde ha habido mayor disponibilidad de recursos
para colecta, conservación y utilización de estas plantas productoras de tubérculos, ya que
históricamente se ha considerado que estos países poseen la mayor diversidad de especies
(Rosero, 2010).
En Colombia la producción de tubérculos se ubica en los departamentos de Nariño, Cauca,
Cundinamarca y Boyacá. Estos cultivos han complementado la dieta de comunidades
indígenas y campesinas en ecosistemas altoandinos y paramunos de Colombia desde la época
prehispánica hasta la actualidad (Pérez, 2009; Rosero, 2010).
Estas especies tienen una importancia fundamental en la seguridad alimentaria ya que ofrecen
una alternativa para diversificar la dieta en la población general y en particular en
comunidades rurales e indígenas (Clavijo et al., 2011). Por esta razón es crucial evitar la
pérdida de sistemas de producción locales y a pequeña escala, lo cual puede lograrse a través
de investigaciones enfocadas en disminuir eventos de “cuello de botella” y en sistemas de
conservación que complementen los métodos in situ y ex situ (Galluzzi et al., 2013),
incrementando posibilidades de uso de los recursos genéticos de tubérculos de forma
sostenible (García & Cadima, 2003).
Pérdida de diversidad genética y estrategias de conservación
Los tubérculos andinos han atravesado un proceso progresivo de deterioro que ha conducido
a la pérdida de diversidad genética2 (Clavijo et al., 2011). Esta pérdida de diversidad, llamada
erosión genética se ha atribuido a factores asociados a presiones del mercado, dificultades
en comercialización, pérdida de conocimiento tradicional o la asociación del producto a un
alimento propio de poblaciones de bajos recursos. Adicionalmente contribuyen aspectos
2 La diversidad genética corresponde a la diversidad de especies y/o variedades que son producto de procesos de evolución y
adaptación generados por selección natural y artificial. Bajo este contexto la erosión genética se refiere a la pérdida de genes o variedades (en un sentido más amplio) como consecuencia de factores como degradación ambiental, sobreexplotación de especies, cambios en sistemas agrícolas o remplazo de variedades locales o tradicionales por variedades de alto rendimiento (García & Cadima, 2003).
14
como la degradación de la tierra o factores bióticos como enfermedades (García & Cadima,
2003; Malice & Baudoin, 2009).
Con el fin de conservar la diversidad genética existen dos métodos fundamentales conocidos
como in situ y ex situ.
El enfoque in situ consiste en la conservación de poblaciones y ecosistemas en sus hábitats
de origen. Se busca que este tipo de conservación se constituya en zonas de alta diversidad
genética de especies tanto cultivadas como silvestres, favoreciendo los procesos evolutivos
naturales (García & Cadima, 2003). La influencia humana juega un papel fundamental en la
conservación in situ, ya que el uso y manejo de estas especies puede alterar los patrones de
diversidad genética en estas (Rosero, 2010).
La variabilidad de las especies no se distribuye de igual forma en toda la franja andina, por
lo que se debe priorizar que la conservación in situ se realice en zonas denominadas
“microcentros” que cuenten con características ambientales y socioculturales favorables
(García & Cadima, 2003).
Este enfoque beneficia también a agricultores y comunidades asociadas, constituyendo una
base de seguridad alimentaria. De igual forma se debe considerar que forman parte del
equilibrio de los ecosistemas, puede asociarse a la conservación de parientes silvestres y
permite perpetuar procesos de evolución natural (García & Cadima, 2003).
La conservación ex situ consiste fundamentalmente en bancos de germoplasma que
mantienen muestras de poblaciones en lugares físicos con condiciones apropiadas para
conservar los recursos genéticos. Si bien esto puede implicar que se obstaculicen los procesos
evolutivos naturales, puede por otro lado permitir conservar la biodiversidad que se encuentra
amenazada en condiciones naturales por diversos factores (García & Cadima, 2003).
Considerando tanto ventajas como desventajas de cada método o enfoque, las actuales
estrategias de conservación buscan constituirse logrando complementar ex situ e in situ para
evitar la pérdida de recursos genéticos (Malice & Baudoin, 2009).
15
Oxalis tuberosa Molina
Oxalis tuberosa Molina. Pertenece a la familia botánica Oxalidaceae, orden Geraniales; sus
nombres comunes en español incluyen ibia (Colombia); oca, quiba, ciuba, ciuva, huisisai,
(Otras partes de Sur América) y papa roja (México) (National Research Council, 1989).
Además de cultivarse en la región andina con mayor abundancia en Ecuador, Perú y Bolivia,
donde, después de la papa, constituye el cultivo de tubérculo más importante (Flores et al.,
2003), la ibia ha sido cultivada en México y Nueva Zelanda (National Research Council,
1989). La domesticación de esta especie ocurrió probablemente en la región central de Perú
y en el norte de Bolivia donde se presenta la mayor diversidad de formas cultivadas (Pissard
et al, 2006).
Generalmente la propagación de las especies de tubérculos andinos que se han mencionado,
incluyendo la ibia, es vegetativa a través de los tubérculos (Malice & Baudoin, 2009). O.
tuberosa es una hierba anual generalmente de 20 a 30 cm de alto con tallos cilíndricos cuya
variación de color puede ser de verde a rojo (King, 1987). Los tallos normalmente se alzan
desde la base de la planta y son pubescentes. En días largos, los estolones crecen como tallos
aéreos y en días cortos, penetran en el suelo formando tubérculos (National Research
Council, 1989). Los tubérculos exhiben una amplia variación de color y tamaño y poseen
niveles variables de ácido oxálico; las variedades con altos niveles se consideran amargas y
se procesan de diversas formas (King, 1987).
Las hojas son alternas, trifoliadas, pinnadas o palmaticompuestas y pubescentes, los foliolos
son de 1 a 4 cm con color verde oscuro en el haz y purpura o verde en el envés. Las
inflorescencias son axilares con cuatro o cinco flores hermafroditas. El cáliz está conformado
por cinco sépalos y la corola por cinco pétalos unidos en la base, de color amarillo o
anaranjado con bordes trilobados y tres nervios principales de color negro. Los estambres se
encuentran dispuestos en dos verticilos pentámeros de diferente longitud; cuentan con un
ovario pentacarpelar con carpelos separados y cinco estilos libres; El fruto consiste en una
capsula (dehiscencia explosiva) de cinco lóculos de pared membranosa, cada lóculo con una
a tres semillas (Barrera et al, 2004). El ciclo de la planta puede durar entre 7 y 10 meses
dependiendo de la altura a la que se desarrolle el cultivo (Clavijo, 2014)
16
Generalmente se afirma que es una especie octoploide 2n= 8x= 64, sin embargo Rosero
(2010) indica que la naturaleza de la oca no es clara ya que diversas investigaciones
presentan resultados inconsistentes (Rosero, 2010). Posee un sistema trimórfico de
incompatibilidad genética lo que impide el autocruzamiento y conlleva a la polinización
cruzada (Pissard et al, 2006).
O. tuberosa presenta gran variación en los niveles nutricionales y se puede considerar que
su valor nutricional es igual o mejor que la papa. En promedio contienen de 70 a 80% de
humedad, 11-22% de carbohidratos y alrededor de 1% de grasa y fibra. En cuanto a los
niveles de proteína se presenta una gran diferenciación entre variedades, algunos tubérculos
con alta concentración de proteína pueden contener más del 9 % de su peso seco en proteína
de alta calidad con un buen balance de aminoácidos esenciales (National Research Council ,
1989) .
En un estudio realizado por Flores et al. (2002) se presenta una caracterización de la proteína
soluble más importante del tubérculo, denominada Ocatina (constituye del 40% al 60% de
la proteína soluble total) y demostró que posee actividades antibacterianas y antifúngicas
contra diversos microorganismos del suelo, por lo que consideran su función como una
proteína de almacenamiento que puede desempeñar un papel en la resistencia natural a
patógenos (Flores et al., 2002) También se ha determinado que el tubérculo posee un
potencial para producción de almidón, alcohol y alimento de ganado (National Research
Council , 1989).
El germoplasma de ibiaex situ se ha distribuido en diversos bancos de germoplasma en
Suramérica, ubicados principalmente en Perú con el mayor número de accesiones (1696) en
el instituto nacional de investigación agropecuaria (INIA) (Flores et al., 2003).
La caracterización y diversidad de Oxalis tuberosa no ha sido suficientemente explorada en
Colombia y no se registran bancos de germoplasma que conserven una muestra
representativa (Rosero, 2010). Los estudios realizados parecen reflejar una menor
importancia (en cuanto a producción) de este cultivo con respecto a Tropaeolum tuberosus
y Ullucus tuberosus (a diferencia de la tendencia que se presenta en países como Perú y
Bolivia) (Aguirre et al., 2012).
17
El estudio de la diversidad genética
a. Cómo se estudia la diversidad genética
Los organismos se diferencian por variaciones en las secuencias en el ADN y por alteraciones
ocasionadas por el ambiente. El estudio de estas diferencias es fundamental para establecer
estrategias de conservación y esto se ha realizado a través del desarrollo de herramientas
moleculares que han permitido, entre otras utilidades, la identificación de polimorfismos
causantes de la variación genética (FAO, 2010).
Los denominados marcadores genéticos permiten indicar el genotipo de un individuo y de
uno o varios loci relacionados con el marcador, proporcionando herramientas para la
identificación de plantas y el fitomejoramiento (Henry, 2013)
Para determinar un marcador genético ideal se toma en consideración que este sea
polimórfico (con capacidad de revelar variaciones genéticas individuales), multialélico,
codominante (haciendo posible distinción entre homocigotos y heterocigotos), no epistáticos
(independencia entre locus), neutral (lo que implica que las sustituciones de alelos en el locus
del marcador no inciden en el fenotipo o proceso de selección) y que no sean susceptibles a
cambios ambientales. Los marcadores que mejor aplican en la actualidad para estas
condiciones han sido los marcadores de ADN que se han impuesto ante los marcadores
morfológicos o bioquímicos (Vienne, 2003). Esto se debe a que los métodos basados en ADN
permiten un análisis directo en el genoma en lugar de inferencias basadas en el análisis de la
expresión de los genes (Henry, 2013). De igual forma, estos análisis son independientes del
estado de desarrollo o del tejido analizado y son casi infinitos en número, permitiendo
aplicaciones adicionales en biología molecular (Vienne, 2003).
Los marcadores de ADN han sido utilizados ampliamente en análisis de diversidad,
caracterización y mapeo genético (Meena et al., 2015). Los primeros métodos desarrollados
se basaban en la detección de la variación de las muestras mediante la hibridación del ADN.
Este es el caso de la técnica RFLP o polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción,
en la que se hace uso de enzimas de restricción que actúan para obtener fragmentos de ADN
de diferentes longitudes, posteriormente se utilizan sondas que se hibridarán con el fragmento
o fragmentos homólogos (Vienne, 2003).
18
Esta técnica fue ampliamente utilizada hasta la aparición de métodos basados en la reacción
en cadena de la polimerasa o PCR (Joshi et al., 1999). Además de requerir menores
cantidades de ADN, la implementación de los métodos basados en PCR aporta una mayor
sensibilidad, especificidad, poder de resolución y facilidad en la ejecución del
procedimiento, lo que se traduce en una mayor confiabilidad de los datos obtenidos en los
análisis (Henry, 2013).
b. PCR
La técnica de PCR desarrollada por Mullis y colaboradores en 1983 permite la amplificación
in vitro de secuencias de ADN de interés. Desde el momento en el que hubo disponibilidad
de la enzima polimerasa termoestable, esta técnica ha reemplazado ampliamente previas
metodologías de la biología molecular por su mayor sensibilidad y conveniencia (Weising
et al., 2005). La reacción en cadena de la polimerasa se basa en la acción de dos primers
(secuencias de oligonucleótidos o cadenas cortas de ADN o ARN), cada uno complementario
a ambas cadenas opuestas de una sección de ADN. La síntesis de cada nueva cadena debe
direccionarse de tal forma que su extensión se dirija una hacia la otra obteniendo como
producto final la síntesis de una región específica limitada por los dos primers (Mcpherson
et al., 1996).
Para que se lleve a cabo la reacción de amplificación debe prepararse un mix que contenga:
una polimerasa termoestable que adicionará nucleótidos a partir del extremo 3´de los
primers; un buffer que generalmente contiene Tris-HCl, KCl y MgCl; deoxinucleótidos o
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); Primers y el ADN que se pretende amplificar. Durante
el primer ciclo, en una primera fase a 94°C, ocurre la denaturación, permitiendo la separación
de la doble cadena de ADN. Posteriormente ocurre una disminución de la temperatura con el
fin de que los primers se hibriden a las secuencias blanco en la cadena; la siguiente etapa
ocurre a una temperatura óptima para la actividad de la polimerasa termoestable (paso de
elongación). En el segundo ciclo ocurre de nuevo una denaturación con el fin de que la cadena
original y la cadena recién amplificada sirvan como moldes para las siguientes
amplificaciones. Estos ciclos pueden repetirse de 25 a 50 veces, permitiendo la amplificación
exponencial de la región especifica (Weising et al., 2005).
19
Con el fin de optimizar las condiciones para la amplificación es posible modificar ciertos
aspectos del proceso de PCR. Determinar las concentraciones apropiadas para reactivos
como magnesio, dNTPs o la polimerasa puede significar una mejora en los resultados del
proceso. Generalmente la optimización inicia con un ensayo de diferentes concentraciones
de magnesio; las concentraciones óptimas reportadas varían entre 1mM a 6 mM. El magnesio
es un cofactor requerido de la taq polimerasa y las variaciones en este pueden afectar el
funcionamiento de la enzima. Debido a que los dNTPs corresponden a las unidades de
construcción para los amplicones de PCR y que se requieren también como cofactor de la
polimerasa, las variaciones en su concentración deben optimizarse para lograr un resultado
exitoso. De igual forma las concentraciones y la calidad de los primers afectarán la
amplificación. Las modificaciones en el protocolo como tal consisten en cambios en
temperaturas de hibridación o en los ciclos , esto puede aumentar la especificidad del
producto y evitar la unión de primers en regiones inadecuadas (Kennedy & Oswald, 2011)
c. Marcadores ISSR
Los marcadores ISSR se encuentran dentro de los marcadores basados en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Técnicas como ISSR, AFLP o RAPD son sistemas de
marcadores dominantes y por lo tanto no permiten la detección de variabilidad en los alelos.
Sin embargo, son fáciles de implementar e implican un menor costo (Vijayan, 2005), esto
aplica especialmente para ISSR, por lo que se está implementando cada vez de forma más
frecuente en estudios filogenéticos, de diversidad genética, mapeo genético, entre otros
(Reddy et al., 2002).
La implementación de estos marcadores se basa en la amplificación de segmentos de ADN
que se encuentran entre dos regiones idénticas repetidas de microsatélites (SSR) situadas en
dirección opuesta (Vijayan, 2005). Los primers utilizados corresponden a microsatélites de
16 a 25 pares de bases de longitud, con repeticiones de di, tri, tetra o pentanucleotidos. Los
primers se unen a diferentes loci en el genoma y se genera la amplificación de las secuencias
intermedias entre los microsatélites de diferentes tamaños. Los primers pueden ser de dos
tipos: no anclados o anclados en el extremo 3´o 5´, los cuales poseen extremos degenerados
que se extienden hacia las secuencias flanqueantes en cualquiera de los dos extremos (Figura
1)
20
Modificado de (Reddy et al., 2002)
Figura 1. A) Primer (AG)n no anclado que se une en cualquier parte de la región repetida de la cadena molde.
B) Primer (AG)n anclado con dos nucleótidos (NN) extra en su extremo 5´. Como resultado, amplifica parte
de la secuencia repetida y el producto tiene una mayor longitud en comparación con el primero
Los productos de amplificación corresponden generalmente a 200 a 2000pb y el nivel de
polimorfismo que se revela puede responder a los distintos métodos de detección. Se ha
reportado una mayor resolución de bandas con la técnica de electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE) con radioactividad, seguido por PAGE con tinción con plata y gel
de agarosa. La longitud de los primers utilizados con ISSR permiten que sea una técnica
altamente reproducible (Reddy et al., 2002)
d. Extracción de ADN
Para lograr llevar a cabo el estudio de diversidad que se pretende desarrollar por medio de
marcadores ISSR es indispensable la disponibilidad de ADN genómico que proceda de un
método de extracción que pueda ejecutarse en el laboratorio de forma simple y rápida sin
implicar un alto costo (Aubakirova et al., 2014).
La estandarización de protocolos de ADN es necesaria debido a que los procedimientos
pueden ser específicos y variar incluso entre individuos de especies del mismo género.
Además, ciertos componentes celulares extraídos pueden llegar a inhibir las reacciones
moleculares (Aubakirova et al., 2014)
En general los métodos de extracción consisten en: una ruptura de la membrana con el fin de
que el material genético sea liberado al buffer de extracción, agentes quelantes que protejan
21
el ADN de endonucleasas y finalmente el aislamiento del ADN de polifenoles, proteínas,
RNA y polisacáridos (Aubakirova et al., 2014).
El primer paso de la extracción corresponde a la disrupción del tejido que consiste en romper
las paredes celulares para facilitar la interacción con los componentes del buffer de lisis.
Este proceso puede realizarse de forma química (en presencia de componentes como
detergentes y proteasas que rompen las uniones celulares) o de forma mecánica (utilizando
nitrógeno líquido que congela inmediatamente la muestra evitando la degradación del ADN
por DNasas) (Henry, 2008).
Para que el ADN tenga acceso al medio de extracción debe ser liberado de la membrana
celular. Entre los componentes del Buffer de extracción se incluyen diferentes tipos de
detergentes que permiten la liberación del ADN unido a la membrana; También se adiciona
Tris (pH 7.0-8.0) que actúa como agente para controlar el pH de la solución, EDTA que
actúa como agente quelante para inactivar la actividad de las nucleasas, sales para solubilizar
el ADN y otras moléculas como β mercaptoetanol para prevenir actividades de la peroxidasa
o polifenoloxidasa (Henry, 2008).
En el siguiente paso que corresponde a la purificación que se realiza con agentes orgánicos
como mezclas de fenol, cloroformo e isoamilalcohol. Posteriormente es necesario separar la
fase orgánica y la fase que contiene el ADN (sobrenadante). Luego de la extracción orgánica
el ADN se precipita por acción de componentes como isopropanol. Finalmente se hidrata el
ADN y se resuspende para mantenerlo en solución, para esto se puede emplear agua a un pH
neutro o Buffer TE (Mezcla de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0) (Cornejo,
Serrato, Rendón, & Rocha, 2014).
Al finalizar el procedimiento, es necesario evaluar el producto obtenido cuantificando
mediante espectrofotometría. De esta forma se puede estimar la concentración y pureza
(evaluada mediante proporciones de absorbancia). Adicionalmente es importante observar la
integridad de la muestra mediante electroforesis (Cornejo et al., 2014)
Con estos criterios es posible determinar si el resultado de un protocolo permite obtener un
ADN genómico con cualidades apropiadas para futuros análisis moleculares como estudios
de diversidad en el caso particular de esta investigación.
22
e. Estudios de diversidad de ibia por medio de ISSR
Los aspectos relacionados con la diversidad genética de esta especie no han sido muy
evaluados y las investigaciones reportadas se han realizado en su mayoría en países andinos
distintos de Colombia como Ecuador, Perú y Bolivia, evaluando la diversidad genética
principalmente a través de marcadores moleculares ISSR (inter-secuencias simples repetidas)
( Pissard et al , 2006; Malice et al., 2007; Pissard et al., 2008).
Al igual que ISSR, se ha implementado la utilización de marcadores AFLP (polimorfismos
en la longitud de fragmentos amplificados) para detectar variación entre taxones
cercanamente relacionados. Sin embargo se indica que los marcadores ISSR pueden tener
una mayor sensibilidad para la distinción de individuos y pares clonales. (Moscoe &
Emshwiller, 2015).
Entre los estudios principales se encuentran los desarrollados por Pissard et al. (2006). En
una primera aproximación a la diversidad de Oxalis tuberosa, Pissard y colaboradores
evaluaron la diversidad entre accesiones de distintos países (Argentina, Bolivia, Perú y
Chile), provenientes de la colección de germoplasma del CIP (Centro internacional de la papa
en Lima, Perú). Los resultados arrojados agrupan las accesiones en conjuntos o clusters de
manera que sugieren que los marcadores ISSR permiten distinguir genotipos cultivados de
acuerdo al sitio de colección. Esto podría indicar que es posible que la estructura genética de
la ibia se encuentre influenciada por la distancia geográfica entre áreas de cultivo (Pissard et
al. 2006).
En un estudio posterior Pissard y colaboradores (2008) evalúan la congruencia entre
marcadores moleculares y morfológicos en la diversidad de accesiones agrupadas en cinco
morfotipos de diferentes regiones de Perú. En los resultados las accesiones correspondientes
al mismo sitio de colección tendieron a agruparse (patrón similar al observado en el anterior
estudio). Sin embargo a pesar de que se presentó una alta correlación entre marcadores
morfológicos y moleculares, el autor expone que esto puede atribuirse a una relación cercana
entre las accesiones y cabe la posibilidad de que no se presente la misma congruencia con un
rango mayor de muestras incluidas en un estudio (Pissard et al. 2008).
Igualmente se ha estudiado la diversidad intra-morfotipo y la influencia que tiene el método
de conservación in situ y ex situ. Pissard y colaboradores (2008) se enfocaron en tres
23
morfotipos de ibia (denominados Señora Oca, K´ellu Qayara y Puca kamusa) cuyas muestras
provienen de orígenes de conservación in situ y ex situ en Bolivia. Los análisis moleculares
arrojan que no fue posible diferenciar dos de los tres morfotipos como variedades
independientes. La totalidad de los grupos reconocidos como morfotipos presentaron una
variabilidad genética dentro de los morfotipos. Los autores determinaron una mayor
variación molecular entre las accesiones ex situ que las in situ (Pissard et al., 2008). Por otro
lado, Malice y colaboradores (2007) evaluaron seis morfotipos y obtuvieron una variación
mayor en las muestras conservadas in situ en comparación con las ex situ. En general, como
en el estudio de Pissard, se evidenció diferenciación genética entre los morfotipos al igual
que un nivel de heterogeneidad dentro de estas (Malice et al., 2007).
Si bien estos trabajos proveen una primera perspectiva de la diversidad de la ibia, la
disponibilidad de información es limitada y los tamaños de las muestras incluidos no parecen
ser lo suficientes para proveer un análisis más robusto.
Hasta el momento los esfuerzos de caracterización de diversidad de la ibia en Colombia se
han llevado a cabo a través de marcadores morfológicos. Rosero (2010) realizó un trabajo de
investigación en seis territorios indígenas en el departamento de Nariño en el cual por medio
de descriptores distinguió ocho grupos entre los que se distribuyen las variedades conocidas
comúnmente por su color. A partir de esta trabajo se conformó el Centro de Conservación de
raíces y tubérculos andinos del Suroccidente Colombiano ubicado en el resguardo indígena
el Gran Cumbal (Nariño) que cuenta con 32 accesiones, este se estableció como una
estrategia de conservación y caracterización, pero sin embargo no constituye una muestra
significativa (Rosero, 2010).
Con la necesidad de fortalecer las investigaciones de esta especie en Colombia para lograr
implementar estrategias sostenibles de conservación, es necesario complementar los estudios
de diversidad incluyendo caracterizaciones genéticas con métodos moleculares.
Debido a que la discriminación de variables se realiza con base en una única característica
morfológica, el color, cabe la posibilidad de una mayor diversidad de variedades que la
reportada en los territorios (Clavijo et al., 2011).
24
Pregunta de investigación
Teniendo en cuenta que para la zona de los municipios de Turmequé y Ventaquemada se han
reportado cinco morfotipos de ibia que corresponden a los colores del tubérculo blanco,
amarillo, rojo, rosado y amarillo con rayas rojas, ¿Existe una correspondencia entre la
diversidad de morfotipos de Oxalis tuberosa M. identificados por medio de características
morfológicas en los municipios de Ventaquemada y Turmequé (Boyacá) y la caracterización
molecular de la diversidad genética realizada por medio de marcadores moleculares ISSR?
Objetivos
Objetivo general
Evaluar la diversidad genética de los morfotipos colectados de Oxalis tuberosa M. existentes
en los municipios de Ventaquemada y Turmequé por medio de marcadores moleculares
ISSR.
Objetivos específicos
- Estandarizar el protocolo de extracción de ADN adecuado para muestras de Oxalis
tuberosa provenientes de municipios de Ventaquemada y Turmequé (Boyacá)
- Estandarizar un protocolo de amplificación por PCR de muestras de Oxalis tuberosa
provenientes de municipios de Ventaquemada y Turmequé (Boyacá) con marcadores
moleculares ISSR
- Realizar la evaluación de la diversidad genética de las muestras de Oxalis tuberosa
colectadas en municipios de Ventaquemada y Turmequé (Boyacá) por medio de
marcadores moleculares ISSR
Metodología
El presente trabajo consiste en una primera aproximación al análisis de diversidad de Oxalis
tuberosa M. en la región de Turmequé y Ventaquemada en el departamento de Boyacá por
medio de marcadores moleculares ISSR. El enfoque metodológico de esta investigación se
compone de una fase de campo y una de laboratorio. Dentro de esta última se describe a su
vez tres etapas acordes con los objetivos específicos formulados. El trabajo se desarrolló en
conjunto con otro estudio de investigación de diversidad genética de cubios (Tropaeolum
tuberosum). Se busca articular los resultados de estos trabajos junto con otras investigaciones
interdiciplinares que involucran el estudio bromatológico de tubérculos andinos, el estudio
de los agroecosistemas y sus cambios a través del tiempo. Esto podría lograr explicar los
25
efectos que han tenido influencia en los patrones de diversidad e identificar propiedades de
estos tubérculos que exalten las bondades de su consumo.
Fase de campo:
Localización y material vegetal
El estudio se llevó a cabo en diferentes agroecosistemas ubicados en los municipios de
Turmequé (ubicado en provincia de Márquez) y Ventaquemada (ubicado en Provincia
Centro), ambos localizados en el departamento de Boyacá. Este departamento, de gran
importancia agrícola ubicado en el centro del país, abastece a las ciudades más importantes
de Cundinamarca, Boyacá e incluso otras regiones de Colombia. Estos municipios se
caracterizan por un legado que conserva aún en la actualidad tradiciones de comunidades
indígenas y el consumo de especies vegetales nativas entre las que se incluyen los tubérculos
andinos hace parte de las tradiciones culturales de esta región (Clavijo et al., 2014).
Turmequé se encuentra a 73° 30´ al oeste de Greenwich a una altura de 2389 msnm y
Ventaquemada se encuentra a 73° 32´al oeste de Greenwich a 2630 msnm (Clavijo, 2014).
La colecta de material se efectuó en diferentes fincas de pequeños productores en ambos
municipios, considerados centros de conservación in situ. Con la colaboración de los
cultivadores se realizó un reconocimiento de la zona, las parcelas y los morfotipos cultivados.
Se registraron las coordenadas geográficas de cada sitio de colecta y datos relacionados con
características particulares de los cultivos, usos o prácticas de manejo, los cuales fueron
consignados en un formato (Anexo 1) diligenciado para cada accesión. Estos datos son
fundamentales en el proceso de análisis, para lograr relacionar los resultados arrojados por el
análisis de diversidad con los factores que han ejercido una influencia sobre los
agroecosistemas y la siembra de estos tubérculos de estudio, en este caso particular, de la
ibia. La tabla a continuación resume las características biofísicas básicas registradas en
campo.
Tabla 1. Resumen de características reportadas en campo
Numero de
Finca
Accesiones
colectadas
Municipio Coordenadas Altura msnm Observaciones adicionales
1 020
022
032
034
035
Ventaquemada N 05°22´39,1”
W073°31´47,5”
2786 Cultivos anexos de papa,
cubio, rubas, maíz, ajo,
habas, entre otros. Las ibias
se siembran en sitios
aleatorios. La parcela donde
26
se siembran los cultivos se
encuentra en una ladera.
2 036
037
038
040
041
043
044
Ventaquemada N 05°25´47,1”
W073°30´41,0”
3027 Parcela en terreno plano.
Gran densidad de
vegetación, cultivo de ibia
alternado aleatoriamente con
cultivos de cubios, rubas,
habas, maíz y otros.
3 051
052
053
054
055
056
Ventaquemada N 05°22´57,5”
W073°30´21,6”
2735 Cultivos situados en surcos,
de forma más homogénea en
el terreno, es posible
identificar más fácilmente
individuos de plantas
aislados.
4 064 Turmequé N 05°19´15,2”
W073°29´59,2”
2387 Asociación de varios
cultivos diferentes
5 068
069
071
074
Turmequé N 05°19´18,7”
W073°30´35”
2368 Plantas de ibia asociados a
otros cultivos.
6 075 Turmequé N 05°18´58,9”
W073°31´38,8”
2374 Asociación de varios
cultivos diferentes
7 079
080
081
082
Ventaquemada N 05°23´54,6”
W073°29´09.1”
2848 Plantas de ibia asociados a
otros cultivos. Gran
densidad de vegetación.
Se tomaron muestras de tejido foliar correspondientes a los diferentes morfotipos de
tubérculos de ibia existentes, para el posterior análisis molecular en el laboratorio. Estas
muestras se almacenaron inmediatamente en bolsas plásticas que contenían gel de sílice para
absorber la humedad y evitar la rápida oxidación de los tejidos. Posteriormente para
conservar las muestras en el laboratorio, fueron almacenadas en nevera a -80°C.
Igualmente se colectaron muestras de las plantas fértiles (aproximadamente 30cm de la
planta) y de los tubérculos de cada morfotipo correspondiente. De las muestras se registraron
datos que incluyeron ciertas características disponibles en campo que puedieran perderse con
la posterior manipulación en laboratorio. Las muestras se organizaron en papel periódico de
tal forma que sus características más importantes fueran observables y se depositaron en una
prensa botánica para someterlas a un proceso de secado en el horno a una temperatura entre
65 y 69°C. Para el ingreso al herbario de la Pontificia Universidad Javeriana, se consignó la
información recolectada en campo en etiquetas que correspondieron a cada muestra botánica
(Anexo 2). Una vez que se ingresaron las muestras al herbario, estas fueron reportadas al
Sistema de Información sobre Biodiversidad- SIB.
27
Las colecciones de herbario representan fuentes de información fundamentales en cualquier
estudio relacionado con plantas y su conservación, por esta razón se considera una
herramienta importante para incluir en este trabajo ya que será un complemento del proceso
de investigación realizado (Vera et al., 2005). Las muestras botánicas incluyendo los
tubérculos estarán disponibles como elementos de referencia en el herbario, y los datos
asociados representarán también un registro importante en cuanto a la especie, la región y
ecosistema. De esta forma estos registros pueden ser utilizados como referencias para futuras
investigaciones en esta y otras regiones del país.
Fase de laboratorio
Extracción de ADN
Para el procedimiento de extracción de ADN se evaluaron cinco protocolos, cuya prueba
tuvo dos repeticiones.
CTAB1 ( Pissard et al., 2006), SDS (Dellaporta et al, 1983 modificado), CTAB 2 (Doyle &
Doyle, 1990 modificado), Stefenon (Stefenon et al., 2004) y CTAB 3 (Doyle & Doyle, 1990
modificado) (Tabla 2).
En todos los casos, se realizó una maceración del material vegetal colectado con nitrógeno
líquido empleando un mortero. A la totalidad de los protocolos se agregaron
aproximadamente 0,2g de material vegetal macerado a cada buffer de extracción específico
en tubos de centrifuga de 0,5 - 2ml. En los pasos finales de cada protocolo se realizó un
lavado con etanol al 70 % que puede permitir la remoción de reactivos que inhiben el proceso
de PCR, se descartó el sobrenadante y como paso final, el pellet se resuspendió con buffer
T10E1 y se trató con RNasa.
Tabla 2. Especificación de procedimientos en cada fase de extracción de los protocolos evaluados Protocolo Homogeniz
ación
tejido
Lisis Separación de
proteínas y lípidos
Precipitación de ADN Redisolución de
ADN
CTAB 1 Macerado
Nitrógeno
líquido
700µl de Buffer de
extracción precalentado:
100mM Tris HCl pH
8,0; 2M NaCl; CTAB
2%; PVP 2%; 20mM
EDTA pH 8,2; β
mercaptoetanol 1%,
600 µl de
cloroformo alcohol
isoamílico (24:1),
mezclar por
inversión y
centrifugar a
14000rpm por 10 minutos
Transferir fase acuosa a un
tubo nuevo y agregar 550
µl de isopropanol. Agitar
por inversión y precipitar
de 2 a 24 horas a -20°C.
Centrifugar a 14000rpm
por 10 min y descartar
sobrenadante. Realizar
Resuspender pellet en
150 µl de Buffer T10E1
y adicionar 1 µl de
RNasa, dejando incubar a 37°C.
28
mezclar con agitador
Vortex e incubar 65°C por 40 min
lavado con 500 µl etanol al
70%, centrifugando esta vez por 5min a 14000rpm.
SDS Macerado
Nitrógeno
líquido
700µl de Buffer de
extracción precalentado:
100mM Tris HCl pH
8,0; 5M NaCl; SDS 2%;
50mM EDTA pH 8,2; β
mercaptoetanol 10mM
mezclar con agitador
Vortex e incubar 65°C
por 30 min mezclando por inversión cada 5min
500 µl de
cloroformo alcohol
isoamílico (24:1),
mezclar por
inversión 5min y
centrifugar a
14000rpm por 10 minutos
Transferir sobrenadande a
un tubo nuevo y adicionar
1/10 volumen de Acetato
de Sodio 3M pH5,3 y 6/10
volumen de isopropanol,
mezclando por inversión y
dejando incubar a -20°C
por 30 min.
Posteriormente
centrifugar a 14000rpm
por 15 min, descartar el
sobrenadante dejar secar
precipitado a temperatura
ambiente. Lavar el
precipitado con 500 µl de
etanol a 70 %, y
centrifugar por 5 min a 14000rpm
Resuspender pellet en
100 µl de Buffer T10E1
y adicionar 1 µl de
RNasa, dejando incubar a 37°C.
CTAB 2 Macerado
Nitrógeno líquido
600µl de Buffer de
extracción precalentado:
100mM Tris HCl pH
8,0; 1,4M NaCl; CTAB
3%; PVP 1%; 20mM
EDTA pH 8,2; β
mercaptoetanol 0,2%
mezclar con agitador
Vortex e incubar 65°C
por 20 min mezclando por inversión cada 5min
600 µl de
cloroformo alcohol
isoamilico (24:1),
mezclar por
inversión 5min y
centrifugar a
13000rpm por 10 minutos
Transferir sobrenadande a
un tubo nuevo y realizar
un lavado con etanol
absoluto (2.5 volumenes)
más acetato de amonio
1/10 de volumen
mezclando de nuevo por
inversión. Incubar por 2
horas a -20°C.
Posteriormente se
centrifugar a 13000rpm
por 5 min, descartar el
sobrenadante y realizar
lavado con 500 µl etanol al
70%. Centrifugar por 5min a 13000rpm
Resuspender pellet en
100 µl de Buffer T10E1
y adicionar 1 µl de
RNasa, dejando incubar a 37°C.
Stefenon
et al 2004
Macerado
Nitrógeno
líquido
1500µl de Buffer de
extracción precalentado:
100mM Tris HCl pH
8,0; 1,5M NaCl; CTAB
2%; PVP 2%; 20mM
EDTA pH 8,2; β
mercaptoetanol 1%
mezclar con agitador
Vortex e incubar 65°C
por 20 min mezclando
por inversión cada
15min
Adicionar 600 µl de
cloroformo alcohol
isoamilico (24:1),
mezclar por
inversión y
centrifugar a
13000rpm por 5
minutos.
Transferir fase
acuosa a tubo nuevo
y adicionar 5µl de
RNasa. Incubar a
34°C por 40 min.
Posteriormente
adicionar 600µl de
cloroformo alcohol
isoamilico.
Centrifugar 5min a
13000rpm y
transperir
sobrenadante.
Adicionar solución
1 (CTAB 10% y
Agregar 2/3 de volumen
de isopropanol y dejar 30
min a -20°C. Se centrifuga
a 4000 rpm por 5 min y se
descarta el sobrenadante.
Lavar el pellet con etanol
al 75% e incubar a -20°C
por 30 min. Centrifugar a
13000rpm por 5 min y descartar sobrenadante.
Resuspender pellet en
150 µl de Buffer T10E1
y adicionar 1 µl de
RNasa, dejando incubar a 37°C.
29
NaCl 1,4M).
Adicionar 600µl de
cloroformo y
centrifugar
nuevamente 5min a 13000.
CTAB 3 Macerado
Nitrógeno
líquido
600µl de Buffer de
extracción
precalentado: 100mM
Tris HCl pH 8,0;
1,4M NaCl; CTAB
3%; PVP 1%; 20mM
EDTA pH 8,2; β
mercaptoetanol 0,2%
mezclar con agitador
Vortex e incubar
65°C por 20 min
mezclando por
inversión cada 5min
Adicionar 600 µl de
cloroformo alcohol
isoamílico (24:1),
mezclar por
inversión 5min y
centrifugar a
13000rpm por 5
minutos
Transferir sobrenadande a
un tubo nuevo y realizar
un lavado con etanol
absoluto (2.5 volumenes)
más acetato de amonio
1/10 de volumen
mezclando de nuevo por
inversión. Incubar por 2
horas a -20°C.
Posteriormente se
centrifugar a 13000rpm
por 5 min, descartar el
sobrenadante y realizar
lavado con 500 µl etanol al
70%. Centrifugar por 5min
a 13000rpm
Resuspender
pellet en 150 µl
de Buffer T10E1
y adicionar 1 µl
de RNasa,
dejando incubar
a 37°C.
Métodos de análisis del ADN
Por medio de los parámetros de calidad (pureza e integridad) y concentración, se evaluaron
los resultados obtenidos en las pruebas para lograr discernir entre los diferentes protocolos y
elegir el más adecuado para las muestras de O. tuberosa.
La cuantificación de ADN se realizó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop™ Thermo
scientific. La valoración de la pureza se realizó a través de la proporción de absorbancias A
260 nm/ 280nm el valor ideal en el que se considera ADN puro corresponde a un rango entre
1,8 y 2,0. Valores menores a este, pueden indicar contaminación de la muestra con proteínas.
Una segunda proporción utilizada para determinar la pureza corresponde a A 260/230, donde
los valores apropiados se consideran entre el rango 2.0 - 2.2 y un valor menor puede reflejar
contaminación por carbohidratos o fenoles (Cornejo et al., 2014).
Para determinar la integridad de las muestras se realizaron ensayos de electroforesis en gel
de agarosa, utilizando el colorante fluorescente SYBR® Safe. (Weising et al., 2015).
PCR
Para el análisis molecular se emplearon primers ISSR reportados como polimórficos por
Pissard et al. (2006) (tabla 3) y se evaluó el protocolo también reportado por este autor en
estudios de diversidad genética de Oxalis tuberosa (Pissard et al., 2008)
30
Tabla 3. Primers ISSR y su temperatura óptima de anillamiento (tomado de Pissard et al 2008)
En primera instancia se realizaron pruebas preliminares con primers de marcadores
moleculares RAM (Random Amplified Microsatellite) para tener una primera aproximación
a la estimación de la calidad de la amplificación y determinar si el ADN extraído posee la
calidad apropiada para llevar a cabo técnicas moleculares como la PCR. Estas pruebas se
efectuaron con 5 primers (figura 5) preparando reacciones con un volumen de 25 µL y
utilizando concentraciones de 50ng del ADN genómico. La concentración de componentes
en cada reacción preparada equivale a 1x de Buffer; 2,5mM de MgCl2; 0,25mM de dNTPs;
4mM de Primer y 1U de la enzima Taq polimerasa. Finalmente se evaluaron los productos
por medio de electroforesis en gel de agarosa al 2% a un voltaje constante de 65V.
Para los primers ISSR se probó el protocolo reportado por Pissard (2006) para la PCR a
unvolumen final de 25 µL (volumen modificado del protocolo original) que contenía 10ng
de ADN, 0,4 µmol/l de primer, 80 µmol/l cada dNTP, 1U de Taq polimerasa y 1x de Buffer
. Para los primers 1-6 (tabla 3), en primer lugar se realizó una denaturación por 10 min a
95°C (35 ciclos) y la elongación final se efectuó por 5 min a 72°C. Para los primers restantes,
el primer paso de denaturación es de 5 min a 94° (35 ciclos) y un paso final de elongación de
4 min a 72 °C. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis con un gel de agarosa
al 2% a un voltaje constante de 70 V.
Las condiciones de este proceso de amplificación se modificaron de acuerdo a los resultados
que se obtuvieron, buscando que se acoplaran a un protocolo de PCR adecuado para las
muestras de ibia. Con el fin de optimizar los resultados, se realizaron variaciones en la
concentración de los reactivos. Principalmente se inició estimando un valor de concentración
de magnesio al cual se genera una buena amplificación (Kennedy & Oswald, 2011). Debido
a que estudios previos han reportado condiciones adecuadas para la PCR con esta especie, se
31
restringió el gradiente a valores cercanos al rango entre 1.5 a 3 reportado por Pissard et al.
(2006). Las mejores condiciones se determinaron de acuerdo con la intensidad y claridad de
las bandas en la electroforesis.
Análisis de Diversidad Genética
Para la evaluación de la diversidad de morfotipos de ibia, se analizaron los fragmentos de
ADN amplificados de cada una de las 29 accesiones (Anexo 3) con los primers ISSR
escogidos. Los fragmentos se consideran como un carácter unitario y se evidencian por medio
de bandas que se visualizan en un gel de electroforesis. El análisis inicia asignando un valor
binario para la presencia (1) y la ausencia (0) de las bandas. Teniendo en cuenta estudios
reportados que utilizan ISSR, es recomendable tomar en cuenta para la puntuación aquellas
bandas con una separación de aproximadamente 0,5mm y cuya banda se pueda evidenciar
fácilmente (evitar fragmentos con aplificación tenue) debido a que estas condiciones
aumentan las posibilidades de reproducibilidad de los ensayos (Joshi et al.,2000; Chia, 2009).
Con los valores obtenidos de presencias y ausencias se diseñó una matriz en donde se
enfrentaron las accesiones evaluadas y los loci o caracteres tenidos en cuenta. Posteriormente
se realizó una matriz de similitud, producto del cálculo de un coeficiente de similitud para
los datos, utilizando el software estadístico PAST. Los datos se obtuvieron en principio
empleando el coeficiente de Jaccard. Este coeficiente adquiere valores de 0 a 1 y se basa en
la relación de las presencias y ausencias de una característica, en este caso, en dos muestras
o accesiones comparadas. El coeficiente se define a continuación (Figura 2) (Rodríguez et
al., 2001).
Figura 2. A) Combinaciones para condiciones de presencia y ausencia de una característica con dos muestras
comparadas. B) Fórmulas para cálculo de índice de Jaccard .
B.
Índice de Jaccard = a
a + b+ c
A.
X1 y X2= individuos comparados
a. Característica presente en X1 y X2
b. Característica presente en X1 y
ausente en X2
c. Característica Ausente en X1 y
presente en X2
d. Característica ausente en X1 y X2
32
Con esta matriz se realizó un agrupamiento con el algoritmo UPGMA (por sus siglas en
inglés: Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages) el cual permitió agrupar
los individuos de estudio con base en las distancias genéticas. El resultado de la aplicación
de este algoritmo utilizando el software PAST fue un dendrograma o árbol fenético donde se
evidenció de forma gráfica las distancias y el agrupamiento. De igual forma se obtuvieron
representaciones de los agrupamientos en dos dimensiones por medio de un análisis de
coordenadas principales, que permitió observar gráficamente la diversidad reflejando la
relación entre individuos (Barrera et al., 2004).
Resultados
Extracción de ADN
Como resultado de una primera experiencia en campo se realizó la colecta de 4 individuos
(accesiones) de Oxalis tuberosa (Anexo 4), meterial que se procesó para llevar a cabo el
ensayo de comparación de protocolos en el laboratorio de Biologia Molecular Vegetal de la
Pontificia Universidad Javeriana. El formato de datos de campo de la colecta se incluye en
el Anexo 1.
En la fase extracción de ADN en el laboratorio se pusieron a prueba los protocolos
especificados en la metodología (CTAB 1, SDS, CTAB2, Stefenon y CTAB 3) con las
muestras colectadas.
Tabla 4. Datos de concentración, pureza e integridad de los protocolos evaluados con muestras de ibia.
# de
accesión
ng/ul a 260/280 a 260/230 presencia
de bandas
CTAB 1 005 379,79 2,26 0,99 +
011 275,13 1,89 0,97 +
012 434,28 2,23 1 +
SDS 001b 1022,74 1,93 0,88 +
011 976,63 1,72 0,86 +
012 1388,93 1,81 0,9 +
33
CTAB 2 001b 202,77 2,34 0,73 +
011 107,89 2,08 0,91 +
012 281,81 2,11 0,93 +
CTAB 3 001b 210,89 2,33 0,73 +
011 531,22 2,12 1,06 +
012 374,43 2,13 0,94 +
STEFENON
MODIFICADO
001b 61,03 2,54 0,36 +
011 51,5 2,54 0,45 +
012 32,77 2,6 0,41 +
Los resultados de concentración arrojados por espectrofotometría indican una mayor
concentración en el caso del protocolo SDS, seguido de CTAB 3, CTAB 1 (con un valor
muy cercano a CTAB 3), CTAB 2 y finalmente Stefenon que registró valores mucho menores
en comparación con los otros protocolos (el gráfico de medias de concentración se incluye
en el anexo 5)
En cuanto a los resultados de estimación de la pureza, teniendo en cuenta que se considera
un ADN puro aquel cuya proporción de absorbancia 260 /280 arroje un valor mayor a 1,8, la
totalidad de los protocolos presentan valores óptimos. Si bien los valores no difieren en gran
proporción entre los protocolos, Stefenon modificado exhibe un valor mayor, seguido por
CTAB 3, CTAB 2, CTAB 1 (con un valor muy cercano a CTAB 2) y SDS. La gráfica de
medias de valores de proporciones de absorbancia (anexo 5) permite corroborar estos
resultados demostrando la cercanía entre las medias de los valores. Por otro lado, la
proporción 260 /230 utilizada como indicador de contaminación por compuestos como
carbohidratos y fenoles, no alcanza en ningún resultado el rango óptimo de pureza
considerado entre 2.0 y 2.2. El valor más alto se registra con CTAB 1.
En la evaluación de la integridad por medio de electroforesis, los primeros resultados
comparan el protocolo de SDS con CTAB1, evidenciando degradación del ADN para el
protocolo realizado con SDS (figura 3). En general los resultados muestran un patrón de
34
bandeo de mayor claridad para CTAB 1, con bandas más definidas cercanas a los pozos de
siembra
Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 0,8% con muestras de ibia y los resultados de la extracción de ADN
con los protocolos CTAB 2, CTAB 3, SDS y Stefenon
Finalmente, se escogió el protocolo CTAB 1, que ofrece un buen equilibrio entre los criterios
analizados. El resultado de electroforesis de la extracción con el protocolo CTAB1 con la
totalidad de las muestras colectadas se incluye en el anexo 13. Para evaluar la calidad del
ADN se probó la amplificación por medio de primers de marcadores RAM (Microsatélites
Amplificados al Azar), la cual fue exitosa (Anexo 6) (el protocolo de PCR se encuentra en el
anexo 7).
Condiciones de PCR
Luego de la extracción de ADN se efectuaron las pruebas para observar la amplificación con
los 9 primers de ISSR elegidos según estudios previos de Pissard et al. (2006).
Con el fin de elegir las condiciones más adecuadas para la amplificación, las reacciones se
prepararon según las especificaciones establecidas por Pissard y colaboradores (2006)
comparándolas con las condiciones utilizadas previamente para la amplificación con primers
de los marcadores RAM. Los mejores resultados de amplificación se obtuvieron con las
condiciones evaluadas para los primers de RAM (Anexo 8).
Para optimizar los resultados de amplificación se realizaron modificaciones
fundamentalmente en las concentraciones de magnesio. Los resultados obtenidos indican una
mejor definición de bandas incorporando a la reacción una concentración de MgCl2 de 3mM
(Anexo 8).
35
Bajo estas condiciones se efectuaron pruebas con los primers ISSR restantes para verificar
su amplificación. La totalidad de los primers amplificaron para el ADN de O. tuberosa
extraído, sin embargo, los controles negativos3 permitieron identificar contaminación en
cuatro primers (DHB (CGA)5; VHV (GT)7G; (AG)8T; DDC (CAC) 5), los cuales se
excluyeron de las pruebas posteriores de diversidad. Dos de estos primers (DHB (CGA)5 y
VHV (GT)7G) fueron reemplazados por primers RAM (GT y CGA) que tienen la misma
secuencia microsatélite. Sin embargo, con el primer CGA no se obtuvo amplificación del
ADN de las muestras.
En general comparando los diferentes primers, aquellos que permiten distinguir bandas con
mayor definición son los que incluyen repeticiones de nucleótidos AG, GA y AC.
Finalmente, considerando los resultados de las pruebas, las condiciones elegidas para realizar
la PCR fueron: ADN a 25ng; Buffer 1x, MgCl2 a 3mM, dNTPs 0.25mM, primers 4µM y
1U de Taq polimerasa, en un volumen final de 20ul. Las temperaturas de anillamiento y los
protocolos de PCR usados fueron los propuestos por Pissard et al. (2006) (Anexo 9).
Polimorfismo
En la amplificación de la totalidad de las muestras con los primers elegidos se detectaron
tamaños de fragmentos desde 150 hasta 1700 pb. A través de la matriz binaria generada se
calcularon los porcentajes de polimorfismo de cada uno de los 6 primers utilizados (tabla 5).
Tabla 5. Porcentajes de polimorfismo para primers ISSR seleccionados
primer número
total de
bandas
bandas
monomórficas
bandas
polimórficas
porcentaje de
polimorfismo
VHV(GT)5G 96 28 68 70,80%
BDB(CAC)5 78 54 24 30,80%
(AG)8 YT 135 56 79 58,50%
(GA)8YC 205 56 160 78,04%
(AC)8G 64 0 64 100%
(GA)8A 66 0 66 100%
3 Los controles negativos se incluyen en los experimentos para verificar si hay presencia de alguna contaminación. Estos
consisten en un mix de reacción para la PCR sin incluir un molde de ADN.
36
El menor grado de polimorfismo equivale a un 30% y se obtuvo con el primer BDB (CAC)5.
Los primers más polimórficos fueron (AC)8G y (GA)8A reportando un 100% de
polimorfismo.
Evaluación de la diversidad
Utilizando los 6 primers (tabla 5) que resultaron libres de contaminación y arrojaron una
buena amplificación, se obtuvieron resultados para las accesiones colectadas. La información
proveniente de las bandas evidenciadas en las electroforesis se procesó para obtener una
matriz binaria donde se registró la presencia (1) y la ausencia (0) de cada banda o locus en
los individuos evaluados (Anexo 10 )
Con el análisis de diversidad con el coeficiente de Jaccard se obtuvieron distancias que
oscilaron entre 0.296 y 0.909 lo cual evidencia una alta variabilidad intraespecífica entre los
morfotipos evaluados.
El dendrograma obtenido por medio del software estadístico PAST utilizando el coeficiente
de Jaccard se resuelve en un punto intermedio de similitud entre los valores 0.6 y 0.66 (Figura
5). A este nivel se definen 5 clusters o agrupaciones y una accesión aislada. De estos, los
clusters 2, 3 y 4 agrupan la mayor cantidad de muestras y en general corresponden a los
morfotipos identificados por colores (rojo, rosado y blanco respectivamente). El cluster 1
contiene dos accesiones del morfotipo blanco que se separan de las demás de su tipo, al igual
que dos accesiones rojas (roja 6 y 8) que se agrupan en el cluster 5. Por último, se muestra
una accesión aislada que corresponde a la única muestra del morfotipo amarillo (Figura 5).
Un análisis de coordenadas principales utilizando un índice de Jaccard refleja en un gráfico
de dos dimensiones, patrones de agrupación que corresponden a los generados con el
dendrograma (Figura 4).
37
Figura 4. Análisis de coordenadas principales realizado con coeficiente de Jaccard para 29 muestras de ibia
colectadas.
38
Figura 5. Dendrograma realizado por el método de agrupamiento UPGMA utilizando el coeficiente de
distancias de Jaccard para 29 muestras de ibia colectadas pertenecientes a cuatro morfotipos (roja, rosada,
blanca y amarilla).
39
Discusión
Extracción de ADN
Con un proceso de extracción exitoso, es posible el desarrollo de investigaciones con técnicas
moleculares, logrando obtener resultados confiables y reproducibles.
La principal limitación de la extracción ADN en plantas se atribuye al contenido de proteínas,
polisacáridos (que pueden encontrarse en la pared celular o en acumulaciones como gránulos
de almidón), taninos (u otros compuestos fenólicos), pigmentos y RNA que obstaculizan el
aislamiento y la purificación de la molécula (Bryant, 1997; Puchooa, 2004). Durante la
extracción los metabolitos secundarios pueden liberarse y co-precipitarse con el ADN. Estos
contaminantes son evidenciables durante la extracción e impiden la manipulación de la
molécula de ADN en procesos como el pipeteo y la resuspensión final del pellet ( Porebski
et al., 1997; Puchooa, 2004; Aubakirova et al., 2014)
Las etapas generales de los protocolos manuales de extracción comprenden: la
homogenización o ruptura de uniones celulares del tejido vegetal; etapa de lisis celular por
medio de un Buffer de lisis que incluye detergentes ; separación de proteínas y lípidos;
precipitación y finalmente resuspender el ADN resultante (Cornejo et al., 2014). En la fase
de colecta de material previa a este protocolo es importante buscar en lo posible obtener
muestras frescas y en caso de ser tejido foliar, preferiblemente evitar colectar hojas maduras
con mayor contenido de metabolitos secundarios (Porebski et al., 1997; Wangsomnuk et
al.,2014).
Dentro del Buffer de lisis puede haber diversos tipos de detergentes que permiten la
liberación del ADN. Entre los más comunes se encuentra el Bromuro de cetiltrimetilamonio
(CTAB) y el dodecilsulfato sódico (SDS).
Al momento de comparar un primer protocolo CTAB1 con el protocolo SDS, se observa que
la concentración obtenida con SDS es mucho mayor, sin embargo, la proporción 260/230 es
mejor para CTAB1. Estos criterios evaluados probablemente no proveen información
suficiente para elegir un protocolo más apropiado que otro, sin embargo, la evaluación de
integridad del ADN por medio de electroforesis permite evidenciar mayor degradación de
ADN en las bandas correspondientes al protocolo SDS, ya que además de la banda se observa
un barrido luminoso en el carril (figura 3). Basándose en estos resultados se considera que
40
un protocolo que incluya CTAB es más apropiado para la extracción de ADN de muestras de
ibia.
Estos resultados son consistentes con reportes en la literatura en los que extracción con SDS
en especies con altos contenidos de polifenoles resulta en una baja concentración y pureza
(Minas et al., 2011; Puchooa, 2004). Li et al. (2007) muestran resultados de electroforesis
con bandas degradadas utilizando un protocolo SDS para extracción de ADN de girasol
(Helianthus annuus L.).
Los demás protocolos evaluados (CTAB 2, Stefenon y CTAB 3), además de contener CTAB,
poseen otras sustancias adicionales como NaCl, PVP (polivinilpirrolidona), EDTA y β-
mercaptoetanol. Estos componentes evitan la degradación del ADN, actúan como
antioxidantes y contribuyen a la eliminación de polifenoles y polisacáridos ( Porebski et al.,
1997; Cornejo et al., 2014)
Para lograr separar proteínas y lípidos se utilizan solventes orgánicos, en este caso
Cloroformo alcohol isoamilico (24:1) (Cornejo et al., 2014). Los protocolos que incluyen
solventes orgánicos generan un mejor resultado que protocolos que no utilizan estos
solventes, reportando una gran efectividad (mayor y mejor purificación) en combinar altas
concentraciones de CTAB, NaCl y posteriormente realizar dos lavados con cloroformo-
alcohol isoamílico (Minas et al., 2011; Sá et al.2011). Los protocolos CTAB 1, 2, 3 y SDS
concuerdan con estas condiciones (doble lavado con cloroformo alcohol isoamílico) en su
fase de separación de lípidos y proteínas. A esto podría atribuirse los resultados del índice
260/280 que arrojan valores apropiados de pureza para los protocolos.
Con los resultados obtenidos se escogió el protocolo CTAB 1 que arrojó resultados
adecuados para los criterios evaluados. En promedio se obtuvo una concentración de 363,07
ng/ul. Este protocolo fue reportado por Pissard et al. (2006) para Oxalis tuberosa y se incluye
en reportes de estudios de diversidad con tubérculos andinos ( Pissard et al., 2006; Malice et
al., 2007; Pissard et al., 2008 .
La amplificación exitosa con primers RAM indica que el ADN obtenido se encuentra libre
de contaminantes que inhiben la PCR y por lo tanto permite el acceso para que se lleven a
cabo los procesos de hibridación y la extensión (Bryant, 1997)
41
Estandarización PCR
Para llevar a cabo la amplificación de fragmentos de ADN por la técnica de PCR se debe
tener en cuenta que no existe un único protocolo con variables adecuadas que permita
obtener resultados óptimos para todas las reacciones. Por esta razón es necesario desarrollar
adaptaciones para cada estudio específico, incluso si para este se han reportado condiciones
óptimas previamente (Mcpherson et al., 1995). Por esta razón en el presente trabajo se
realizaron variaciones a las condiciones reportadas para la especie Oxalis tuberosa por
Pissard et al. (2006), debido a que las condiciones establecidas por este autor no resultaron
óptimas para la amplificación del ADN proveniente de las accesiones colectadas.
Los resultados indeseados como barridos, ruido en el patrón de bandeo o bandas poco
distinguibles podrían ser ocasionados por efectos inhibitorios que se traducen en una
reducción de la sensibilidad de la reacción. Las fuentes de inhibición pueden tratarse de
compuestos orgánicos como fenoles, detergentes, polisacáridos, proteínas, etc. que pueden
provenir de un ADN blanco que no se encuentra suficientemente puro (Wilson, 1997).
Esta inhibición puede también ser total manifestándose en la ausencia de bandas, causando
en algunos casos, falsos negativos. Esto podría ser una explicación a la ausencia de bandas
en pruebas con primers como CGA, sin embargo igualmente podría tratarse de un error en el
procedimiento manual de la PCR o posiblemente por la falta de homología entre la secuencia
del primer y de la cadena molde (Mcpherson et al., 1995; Williams et al., 1990; Wilson,
1997). La optimización de las condiciones en donde se utilicen las cantidades adecuadas de
los reactivos minimiza estos efectos inhibitorios.
La principal variable que se evaluó en el presente estudio fue la concentración de MgCl2 ya
que esta es una de las variables más importantes a optimizar para lograr especificidad y
rendimiento óptimo de las reacciones. Hallar la concentración óptima es fundamental debido
a que tanto el exceso como las bajas concentraciones tienen consecuencias negativas. Un
exceso impide la denaturación completa y puede generar la hibridación de los primers en
sitios inespecíficos de la cadena molde; de igual forma, la falta de magnesio imposibilita la
reacción de extensión, limitando la actividad enzimática (Mcpherson et al., 1996; Wilson,
1997).
42
Las condiciones de amplificación de Pissard et al. (2006) indican una concentración óptima
de MgCl2 entre 1.5 y 2.5, sin embargo se usaron las condiciones utilizadas para la
amplificación con RAMs en la que las concentraciones de primer y dNTPs son mayores a las
de Pissard (Anexo7). Resultados de pruebas publicados (Mc phearson et al., 1996) indican
que hay un mejor rendimiento de la reacción cuando el magnesio aumenta proporcionalmente
al aumento de dNTPs , según esto, se consideraría apropiado el aumento en la concentración
de magnesio a 3µM que se indicó en los resultados (Mcpherson et al., 1996).
En concordancia con el trabajo publicado por Pissard et al. (2006), los primers con los que
se obtienen bandas de mejor resolución corresponden en su mayoría a los que incluyen
secuencias de repeticiones AG o GA. De igual forma en primers con repeticiones diferentes
como BDB (CAC)5 se observa una menor cantidad de bandas y también reflejan un menor
grado de polimorfismo (Tabla 6), Pissard indica que estos conjuntos de bases (motivos como
CAC) parecen ser abundantes en el genoma de la ibia.
Evaluación de la diversidad de muestras de ibia
El estudio de la variabilidad genética se puede abordar desde diversos enfoques. Cuando se
implementan marcadores moleculares se busca interpretar esta variabilidad por medio del
análisis de patrones de bandeo a los que se les asignan códigos binarios. A través de estos
patrones binarios se aplican diversas medidas o índices de similitud, los cuales revelan una
información que permitirá dilucidar relaciones genéticas entre individuos. Entre las medidas
más comunes para este tipo de estudios se incluyen los coeficientes de Dice, Jaccard o
distancia Euclídea al cuadrado, que pueden ofrecer distintos resultados y formas de
interpretación (Kosman & Leonard, 2005).
Para este trabajo se utilizó el coeficiente de Jaccard (Anexo 11) que se ha utilizado también
en otros estudios previos de diversidad con O. tuberosa (Malice et al., 2010; Pissard et al.,
2006, 2008;)
Cuando se utilizan marcadores dominantes como ISSR se toma cada banda como un único
locus, por lo tanto se asume que el número de bandas observadas corresponde a los loci que
se pueden identificar para un individuo. Sin embargo, la limitación de los marcadores
dominantes con organismos diploides o poliploides como la ibia es que no es posible
distinguir las bandas que representan un locus con alelos iguales (homocigoto) de un locus
43
con alelos diferentes (heterocigoto). Por esta razón, los resultados obtenidos con estos
marcadores serían estimaciones, mas no una detección exacta de la similitud genética entre
dos individuos (Kosman & Leonard, 2005).
Sin embargo los marcadores moleculares ISSR se han utilizado exitosamente en gran
cantidad de estudios para evaluar la diversidad genética entre e intra variedades en especies
como el piñón (Jatropha curcas L.), manzanilla (Matricaria chamomilla L.) y palma datilera
(Phoenix dactilifera L.). Adicionalmente, los estudios de diversidad que se han realizado
sobre tubérculos andinos, principalmente de la ibia, se han realizado implementando estos
marcadores (Malice et al., 2007, 2010; Pissard et al., 2006, 2008; Sabir et al., 2014; Solouki
et al., 2008; Sujatha, 2007). En algunas ocasiones los ISSR se han comparado con
marcadores morfológicos y se destaca su alta capacidad discriminatoria ya que utilizar
marcadores morfológicos puede acarrear ciertas dificultades. A pesar de ser una medida
indirecta de la diversidad y de su fácil aplicación, los marcadores morfológicos están sujetos
a determinaciones subjetivas y pueden ser influenciados por condiciones ambientales
(Pissard et al., 2008).
La ibia exhibe una alta diversidad morfológica que se evidencia principalmente a través de
los distintos colores de los tubérculos. Este es el principal criterio utilizado por los
agricultores para distinguir la diversidad. Sin embargo, la limitada cantidad o disponibilidad
de estudios de variabilidad genética impiden que estos grupos con características comunes
entre sí puedan denominarse con certeza como variedades. Por esta razón es más preciso
utilizar la unidad taxonómica “morfotipo” ( Pissard et al., 2008). Para la zona de estudio, los
morfotipos identificados se distinguen por cinco colores de los tubérculos: amarillo, rosado,
rojo, blanco y amarillo con rayas rojas. Sin embargo en el muestreo realizado no fue posible
incluir el morfotipo amarillo con rayas rojas, posiblemente debido a que su hallazgo fue
reportado únicamente en una feria de agrobiodiversidad, mas no fue encontrado en las fincas
de agricultores visitadas. De igual forma, la presencia del morfotipo amarillo fue muy poco
frecuente en las fincas muestreadas y por lo tanto se incluye únicamente una accesión (Anexo
3) (Clavijo et al., 2014).
Para el presente estudio se distribuyeron las accesiones en morfotipos con base únicamente
en el color del tubérculo asociándolo a los morfotipos reportados por Clavijo y colaboradores
44
(2014). Adicionalmente se registraron los colores de los tallos utilizando la carta de colores
de la RHS (Royal Horticultural Society) (Anexo 12). Si bien no se realizó una determinación
más profunda utilizando descriptores reportados por el IPGRI/CIP (2001), los estudios de
Pissard y colaboradores (2006, 2008) al igual que el de Malice & Baudoin (2009) indican
una total correspondencia entre la identificación de morfotipos mediante descriptores
morfológicos y los morfotipos establecidos directamente por los agricultores, por lo que
podría considerarse que pocas características morfológicas claves son eficientes para
clasificar los individuos en morfotipos.
Para analizar la diversidad entre las 29 muestras colectadas, se obtuvo un dendrograma
(Figura 5) en el cual se observa variabilidad incluso dentro de los agrupamientos que se
producen.
Como resultado se identificaron 5 clusters y una única accesión aislada. Estos parecen
agruparse de acuerdo a los morfotipos establecidos en un principio según las características
morfológicas (color del tubérculo). El Cluster 2 comprende la mayoría de accesiones del
morfotipo rojo y una única accesión blanca, el cluster 3 incluye las accesiones rosadas (con
excepción de rosada 9) y una blanca; dos clusters más pequeños agrupan cada uno dos
accesiones blancas y dos accesiones rojas respectivamente. Para interpretar estos resultados,
los datos de campo son importantes para analizar posibles situaciones que influyan en los
patrones observados (tabla 1).
Las fincas donde se llevaron a cabo los muestreos se caracterizan por ser parcelas de tamaño
pequeño donde los sitios de siembra de los tubérculos se asocian a otros cultivos como haba,
maíz, papa o arracacha y conforman así un fragmento de tierra bastante heterogéneo (Clavijo
et al., 2014). En ocasiones puede haber una alta densidad de individuos de plantas en una
parcela, lo que puede dificultar el proceso de muestreo al momento de tomar tejido foliar de
individuos independientes y determinar con certeza el morfotipo que se está colectando. Esto
pudo suceder en el caso de las muestras que se incluyen en el cluster 2, ya que entre los datos
de campo se registra una posible imprecisión en la toma de las muestras con respecto al
morfotipo colectado. Igualmente, otro factor que significó un obstáculo en el muestreo fue la
temporada, ya que esta no coincidió con el momento cercano a la cosecha y por lo tanto en
ocasiones no era posible asociar individuos con ningún morfotipo. Ante esta situación, en
45
algunos casos los cultivadores conocían las variedades que habían sembrado en un
determinado sector y con base en esta información se realizó la colecta, sin embargo, sin la
posibilidad de corroborar mediante la observación del tubérculo es posible se procesen datos
equivocados. Por lo tanto estas imprecisiones al momento de la colecta podrían explicar la
inclusión de la accesión “blanco 2” en el cluster 2.
Comparando los datos de campo entre las accesiones que parecen encontrarse agrupadas en
posiciones irregulares en el dendrograma, se observaron diferencias entre los colores
registrados para los tallos de los diferentes individuos. Las accesiones denominadas roja 6 y
roja 8 que se agrupan fuera del cluster 2, son las únicas que presentan coloraciones verdes en
el tallo ya que el resto de accesiones del morfotipo rojo poseen tallos rojizos.
Lo mismo se observa con la accesión “blanca6” que se agrupa con morfotipos rosados. Esta
presenta una coloración rosa o rojiza en los tallos a diferencia del resto de muestras del
morfotipo blanco que poseen tallos verdes. Finalmente la accesión “rosada 9” se diferencia
de las otras accesiones rosadas por expresar una tonalidad verde y rosa en el tallo.
Esto indicaría que para una identificación sencilla de morfotipos de ibia, además del color
del tubérculo, el color del tallo es una característica determinante que se debe tener en cuenta.
Esta información podría ser útil al momento de protocolos de colecta de futuras
investigaciones, sin embargo es necesario corroborar esta información con estudios
adicionales.
La mayoría de estudios de diversidad de la ibia al igual que con otras especies de propagación
vegetativa en agroecosistemas tradicionales como la yuca reportan concordancia entre
marcadores moleculares y morfológicos (Malice et al., 2010; Pissard et al., 2008; Malice &
Baudoin, 2009; Malice et al., 2007; ). Estos estudios y los resultados del presente trabajo
soportarían la información para la forma actual de clasificación que consiste en
características moleculares ( Malice et al., 2007).
Elias y colaboradores (2010) indican que de acuerdo a las prácticas de manejo del cultivo en
las que se utilizan tubérculos de cosechas previas para la nueva siembra se esperaría que se
presentara progresivamente un proceso de deriva genética y en este caso debería encontrarse
una gran diferencia genética únicamente entre posibles variedades. Sin embargo en los
46
resultados evidenciados en el dendrograma (figura ) y análisis de coordenadas (figura ) puede
observarse una variación presente también dentro de los grupos indicando que no se trata de
clones. Esta evidencia se manifiesta también en el resto de estudios de variabilidad de O.
tuberosa mencionados anteriormente.
La variabilidad dentro de un mismo morfotipo puede deberse tanto a procesos de mutación
como a una posible confusión entre individuos con similitudes morfológicas que son
genéticamente diferentes (Elias et al., 2001). Las prácticas de cultivo tradicionales ejercidas
por los cultivadores pueden contribuir en gran medida a esta diversidad. Las actividades que
realizan los agricultores de la zona de Turmequé y Ventaquemada, tales como la rotación de
cultivos, la siembra de las plantas de ibia de diferentes variedades en un mismo espacio y en
diferentes altitudes; al igual que el intercambio constante de semillas entre cultivadores de la
zona que se fomenta por actividades como ferias de agrobiodiversidad, contribuyen a la
diversificación de la especie (Clavijo et al., 2014; Marie Malice et al., 2007).
Este y otros estudios aportan al conocimiento existente de la diversidad de esta especie, sin
embargo es importante para tener una información concluyente, aumentar los tamaños de las
muestras y probablemente incluir otros tipos de marcadores moleculares para obtener un
análisis más robusto y continuar entendiendo las características de la variabilidad y los
factores que contribuyen a esta. Este conocimiento irá permitiendo dilucidar la importancia
de la conservación de la agrobiodiversidad y de conocer y perpetuar las prácticas culturales
que contribuyen a mantenerla en estos campos de conservación in situ. Para lograr objetivos
de conservación debe ejercerse un uso sostenible y en lo posible fomentar la
complementariedad entre conservación in situ y ex situ.
Conclusiones
- El estudio de diversidad parece indicar que efectivamente hay una
correspondencia entre los morfotipos identificados por medio de características
morfológicas y los grupos que se obtienen en el análisis por medio de marcadores
moleculares, lo cual puede indicar un proceso de adaptación de esta especie en la
zona.
- Los individuos de los diferentes morfotipos evaluados en este estudio
presentaron una amplia diversidad genética, la cual se ve reflejada en los índices de
similitud obtenidos que se encuentran en un rango entre 0,296 y 0,909.
47
- Los marcadores moleculares ISSR son una técnica de fácil aplicación. Sin
embargo es fundamental estandarizar los procesos de extracción de ADN para
acoplarse a una especie en particular y optimizar las condiciones de PCR para lograr
determinar de forma confiable patrones de bandeo. Estos marcadores pueden ser una
herramienta polimórfica eficiente para la caracterización de la diversidad genética a
escala de un centro de conservación in situ como son los agroecosistemas evaluados.
- El manejo agronómico tradicional asociado al cultivo de ibia ha contribuido a
mantener una variabilidad genética y morfológica. Esta variabilidad encontrada,
asociada a las condiciones ambientales y socioculturales de la región podría permitir
considerar la zona de los municipios de Turmequé y Ventaquemada como un
microcentro de diversidad para esta especie.
Recomendaciones
- Para la realización de futuros estudios sería pertinente incluir un tamaño
mayor de la muestra, al igual que diferentes marcadores moleculares o una mayor
cantidad de primers en el caso de los marcadores ISSR que permitan identificar
polimorfismos adicionales y obtener análisis más robustos.
-
- Además de considerar únicamente la coloración externa del tubérculo como
indicador de un morfotipo específico, es posible que se deba considerar también el
color de los tallos de las plantas de ibia como una característica principal para
identificar morfotipos en campo.
48
Bibliografía Aguirre, S., Piraneque, N., & Pérez, I. (2012). Sistema de producción de tuberculos andinos en Boyacá, Colombia.
Cuadernos de Desarrollo Rural, 9 (69), 257-273.
Aubakirova, K., Omasheva, M., Ryabushkina, N., Tazhibaev, T., Kampitova, G., & Galiakparov, N. (2014). Evaluation of
five protocols for DNA extraction from leaves of Malus sieversii, Vitis vinifera, and Armeniaca vulgaris. Genetics and Molecular Research, 13(1), 1278–1287. http://doi.org/10.4238/2014.February.27.13
Barrera, V., Tapia, C., & Monteros, A. (2004). Raíces y tubérculos andinos : alternativas para la conservación y uso sostenible en el Ecuador. Quito: International Potato Center.
Bryant, J. A. (1997). 1 DNA Extraction. In J. A. Bryant (Ed.), Methods in plant biochemistry (Vol. 10). San Diego: Academic Press.
Chia J (2009)Caracterización molecular mediante marcadores ISSR de una colección de 50 árboles clonales e híbridos de
cacao (Theobroma cacao L.) de la UNAS-Tingo María. Tesis de Maestría. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad
Nacional Mayor de San Marcos, Perú
Clavijo, N., & Pérez, M. (2014). Tubérculos andinos y conocimiento agrícola local en comunidades rurales de Ecuador y
Colombia. Cuadernos de Desarrollo Rural, 2(74), 140-166.
Clavijo, N., Combariza, J., & Barón, M. (2011). Recognizing rural territorial heritage: characterization of Andean tuber
production systems in Boyacá. Agronomia Colombiana, 29(2), 315-322.
Clavijo, N., Barón, M., & Combariza, J. (2014). Tubérculos Andinos: conservacion y uso desde una perspectiva agroecológica (Primera). Bogotá: Editorial Pontificia Universidad Javeriana.
Cornejo, A., Serrato, A., Rendón, B., & Rocha, M. (2014). Herramientas moleculares aplicadas en ecologia: Aspectos
teóricos y prácticos (Primera). Mexico D.F: Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático. Retrieved from file:///C:/Users/Carolina/Downloads/710.pdf
Dellaporta, S. ., Wood, J., & Hicks, J. . (1983). A Plant DNa minipreparation: version II. Plant Molecular Biology Reporter, 1, 19–21.
Doyle, J. ., & Doyle, J. . (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12, 13–15.
Elias, M., Penet, L., Vindry, P., McKey, D., Paunaud, O., & Robert, T. (2001). Unmanaged sexual reproduction and the
dynamics of genetic diversity of a vegetatively propagated crop plant , cassava ( Manihot esculenta Crantz ), in. Molecular Ecology, 10, 1895–1907.
FAO. (2004). El futuro de la agricultura depende de la biodiversidad. Recuperado de http://www.fao.org/Newsroom/es/focus/2004/51102/index.html
FAO. (2010). Marcadores moleculares: una herramienta para explorar la diversidad genética. En FAO, La situacion de los
recursos zoogenéticos mundiales para la alimentación y la agricultura (págs. 393-416). Roma: Organización de las
Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación.
Flores, T., Alape, A., Flores, M., & Flores, H. (2002). Ocatin. A Novel Tuber Storage Protein from the Andean Tuber Crop
Oca with Antibacterial and Antifungal Activities. Plant Physiology, 128, 1291–1302.
Flores, H., Walker, T., Guimaraes, R., Bais, H., & Vivianco, J. (2003). Andean Root and tuber crops: undergrownd
rainbows. Horticultural science, 38(2), 161-167.
Galluzzi, G., Padulosi, S., & Bordoni, P. (2013). Una agenda global para las especies olvidadas e infrautilizadas (NUS:
Neglected and Underutilized Species). Ambienta(102), 1-6.
49
García, W., & Cadima, X. (2003). Manejo sostenible de la agrobiodiversidad de tuberculos andinos: sintesis de
investigaciones y experiencias en Bolivia. Cochabamba : Proinpa.
Haque, I., Bandopadhyay, R., & Mukhopdhyay, K. (2008). Plants, An optimised Protocol for Fast Genomic DNA Isolation from High Seconday Metabolites and Gum containing. Asian Journal Od Plant Sciences, 7(3), 304–308.
Henry, R. (2008). Plant Genotyping II: SNP technology. Pondicherry: CABI. Retrieved from
https://books.google.com.co/books?id=Vj-XgNxupEAC&pg=PA231&dq=nacl+in+dna+extraction&hl=es-
419&sa=X&ved=0CCsQ6AEwAWoVChMIrP3Z1q3axwIVR3YeCh1sEgIP#v=onepage&q=nacl in dna extraction&f=false
Henry, R. (2013). Molecular markers in plants. Hoboken: John Wiley & Sons.
Joshi, S. P., Gupta, V. S., Aggarwal, R. K., Ranjekar, P. K., & Brar, D. S. (2000). Genetic diversity and phylogenetic
relationship as revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza. Theoretical and Applied Genetics, 100, 1311–1320. Retrieved from http://dx.doi.org/10.1007/s001220051440
Joshi, S. P., Ranjekar, P. K., & Gupta, V. S. (1999). Molecular Markers in plant genome analysis. Current Science, 77(2), 230–240.
Kennedy, S., & Oswald, N. (2011). PCR Troubleshooting and Optimization; the essentian guide. Norfolk: Caister
Academic Press.
King, S. (1987). Four Endemic Andean Tuber Crops: Promising Food Resources for Agricultural Diversification. Mountain
research and development, 7(1), 43-51.
Kosman, E., & Leonard, J. (2005). Similarity coefficients for molecular markers in studies of genetic relationships
between individuals for haploid , diploid , and polyploid species. Molecular Ecology, 14, 415–424.
http://doi.org/10.1111/j.1365-294X.2005.02416.x
Li, J. T., Yang, J., Chen, D. C., Zhang, X. L., & Tang, Z. S. (2007). An optimized mini-preparation method to obtain high-quality genomic DNA from mature leaves of sunflower. Genetics and Molecular Research, 6(4), 1064–1071.
Malice, M., & Baudoin, J. (2009). Genetic diversity and germplasm conservation of three minor Andean tuber crop species. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment, 13(3), 441–448.
Malice, M., Bizoux, J. P., Blas, R., & Baudoin, J. P. (2010). Genetic Diversity of Andean Tuber Crop Species in the in situ Microcenter of Huanuco , Peru, (October), 1915–1923. http://doi.org/10.2135/cropsci2009.09.0476
Malice, M., Martin, N., Pissard, A., Rojas-Beltran, J. a., Gandarillas, A., Bertin, P., & Baudoin, J. P. (2007). A
preliminary study of the genetic diversity of Bolivian oca (Oxalis tuberosa Mol.) varieties maintained in situ and ex
situ through the utilization of ISSR molecular markers. Genetic Resources and Crop Evolution, 54(4), 685–690.
http://doi.org/10.1007/s10722-006-9180-7
Mcpherson, M. ., Hames, B. ., & Taylor, G. . (1995). PCR 2 A practical approach. New york: Oxford University Press.
Mcpherson, M. ., Quirke, P., & Taylor, G. . (1996). PCR 1: A practical approach. (M. . Mcpherson, P. Quirke, & G. . Taylor, Eds.). Oxford: Oxford University Press - Practical approach series.
Meena, R. K., Verma, A. K., & Thakur, S. (2015). Molecular Identity Using Inter-simple Sequence Repeat & Random Amplified Polymorphic DNA Markers in Soybean ( Glycine max ) Cultivars, 9(January), 16–22.
Minas, K., Mcewan, N. R., Newbold, C. J., & Scott, K. P. (2011). Optimization of a high-throughput CTAB-based
protocol for the extraction of qPCR-grade DNA from rumen fluid, plant and bacterial pure cultures. FEMS Microbiology Letters, 325(2), 162–169. http://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2011.02424.x
50
Moscoe, L., & Emshwiller, E. (2015). Diversity of Oxalis tuberosa Molina: a comparison between AFLP and microsatellite
markers. Genetic Resources and Crop Evolution(62), 335–347.
Muñoz, E., Morillo, a, & Coronado, Y. (2008). Microsatélites amplificados al azar (RAM) en estudios de diversidad genética vegetal. Acta Agron(Palmira), 57(4), 219–226.
National Research Council . (1989). Lost Crops of the Incas Little-Known Plants of the Andes with Promise for Worldwide
Cultivation. Washington. D. C.: National Academy Press.
Perez (2009) Estado del arte de tuberculos andinos (oxalis tuberosa, ullucus tuberosus, tropaeolum tuberosum) en la
provincia Sugamuxi. Facultad de ciencias agrícolas y pecuarias, Universidad Nacional Abierta y a Distancia, Colombia
Pissard, a., Rojas-Beltran, J. a., Faux, a. M., Paulet, S., & Bertin, P. (2008). Evidence of intra-varietal genetic variability
in the vegetatively propagated crop oca (Oxalis tuberosa Mol.) in the Andean traditional farming system. Plant
Systematics and Evolution, 270(1-2), 59–74. http://doi.org/10.1007/s00606-007-0605-3
Pissard, A., Arbizu, C., Ghislain, M., Faux, a. M., Paulet, S., & Bertin, P. (2008). Congruence between morphological and
molecular markers inferred from the analysis of the intra-morphotype genetic diversity and the spatial structure of Oxalis tuberosa Mol. Genetica, 132(1), 71–85. http://doi.org/10.1007/s10709-007-9150-9
Pissard, A., Ghislain, M., & Bertin, P. (2006). Genetic diversity of the Andean tuber-bearing species , oca Oxalis ... Genome, 49(1), 8–16. http://doi.org/10.1139/G05-084
Porebski, S., Bailey, L. G., & Baum, B. R. (1997). Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology Reporter, 15(1), 8–15.
Puchooa, D. (2004). A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from lychee (Litchi
chinensis Sonn.). African Journal of Biotechnology, 3(4), 253–255. Retrieved from
http://www.academicjournals.org/AJB
Reddy, M. P., Sarla, N., & Siddiq, E. a. (2002). Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, 128(1), 9–17. http://doi.org/10.1023/A:1020691618797
Rodríguez, M., Álvarez, S., & Bravo, E. (2001). Coeficientes de Asociacion (primera). Mexico D.F: Plaza y Valdés
Editores. Retrieved from
https://books.google.com.co/books?id=hitW9gbEGwoC&pg=PA27&dq=indice+de+dice+y+jaccard&hl=es-
419&sa=X&ved=0CBsQ6AEwAGoVChMIpqnJsJ3pxwIVR5IeCh0DPgt2#v=onepage&q=indice de dice y
jaccard&f=false
Rosero M (2010) Colección, caracterización y conservación de variabilidad genética de oca (oxalis tuberosa mol) en
agroecosistemas paramunos del departamento de Nariño-Colombia. Trabajo de grado Maestría. Facultad de ciencias
agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia, Palmira
Sá, O., kira, J. A., & Baptista, P. (2011). Optimization of DNA extraction for RAPD and ISSR analysis of Arbutus unedo
L. leaves. International Journal of Molecular Sciences, 12(6), 4156–4164. http://doi.org/10.3390/ijms12064156
Sabir, J. S. M., Arasappan, D., Bahieldin, A., Abo-aba, S., Bafeel, S., Zari, T. A., … Jansen, R. K. (2014). Whole
Mitochondrial and Plastid Genome SNP Analysis of Nine Date Palm Cultivars Reveals Plastid Heteroplasmy and
Close Phylogenetic Relationships among Cultivars. Plos One, 9(4). http://doi.org/10.1371/journal.pone.0094158
Solouki, M., Mehdikhani, H., Zeinali, H., & Emamjomeh, A. A. (2008). Scientia Horticulturae Study of genetic diversity
in Chamomile ( Matricaria chamomilla ) based on morphological traits and molecular markers. Scientia Horticulturae, 117, 281–287. http://doi.org/10.1016/j.scienta.2008.03.029
Stacey, J., & Isaac, P. G. (1994). Isolation of DNA from plants. In Methods in molecular biology Protocols for Nucleic
Acid Analysis by Nonradioactive Probes (Vol. 28, pp. 9–15). Humana Press. http://doi.org/10.1385/0-89603-254-X:9
51
Stefenon, V., Nodari, R., & Sedrez, M. (2004). AFLP protocol standarization and its informative capacity to genetic
diversity analysis in Araucaria angustifolia. Scientia Forestalis, 64, 163–171.
Sujatha, S. D. B. Æ. M. (2007). Inter and intra-population variability of Jatropha curcas ( L .) characterized by RAPD and
ISSR markers and development of population-specific SCAR markers. Euphytica, 375–386. http://doi.org/10.1007/s10681-007-9387-5
Vera, A., Yépez, M., Martínez, M., López, O., & Morillo, K. (2005). Recolecta de muestras vegetales para la
investigación botánica y su importancia en la productividad Collecting Plant Samples in the Botanical Research
Process and its Importance for Scientific Productivity. Multiciencias, 5(2), 140–149. Retrieved from
file:///C:/Users/Carolina/Downloads/19814-23898-1-PB.pdf
Vienne, D. (2003). Molecular Markers in Plant Genetics and Biotechology. Enfield: Science Publishers, Inc.
Vijayan, K. (2005). [ Review ] Inter Simple Sequence Repeat ( ISSR ) Polymorphism and Its Application in Mulberry Genome Analysis, 10(2), 79–86.
Wangsomnuk, P. P., Rittithum, W., & Ruttawat, B. (2014). Comparative analysis of DNA extracted from mature leaves of rubber tree and application for amplification. International Journal of de Bioflux Society, 6(1), 45–57.
Weising, K., Nybom, H., Wolff, K., & Kahl, G. (2005). DNA fingerprinting in plants: principles, methods, and applications. Boca Ratón: Taylor & Francis Group.
Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A., & Tingey, S. V. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers useful as genetic markers are, 18(22), 6531–6535.
Wilson, I. A. N. G. (1997). Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid Amplification, 63(10), 3741–3751.
52
Anexo 1 formato de datos para colecta
Proyecto Tubérculos Andinos
No. de colecta: GTA_____
Especie: __Oxalis tuberosa_______ Morfotipo: __________________
Fecha: ______________________
Lugar de colecta (incluir topónimos físicos):
Altitud: ____________ Coordenadas: _
Descripción de la planta:
Descripción del tubérculo:
Usos del tubérculo: ___________
Usos de otras partes de la planta: ___________
Método de propagación: Sexual ____ Asexual ____
Procedencia de la semilla: __________
Observaciones:
53
Anexo 2. Ejemplo de formato de etiquetas para herbario
54
Anexo 3. Lista de accesiones incluidas en estudio de diversidad.
Morfotipo # de
accesión
Nombre en
dendrograma
Ibia Roja 032 Roja 1
034 Roja 2
035 Roja 3
037 Roja 4
041 Roja 5
051 Roja 6
054 Roja 7
055 Roja 8
056 Roja 9
081 Roja 10
Ibia
blanca
022 blanca 1
036 blanca 2
038 blanca 3
052 blanca 4
053 blanca 5
069 blanca 6
079 blanca 7
082 blanca 8
Ibia
rosada
040 rosada 1
043 rosada 2
044 rosada 3
064 rosada 4
068 rosada 5
071 rosada 6
074 rosada 7
075 rosada 8
080 rosada 9
Ibia
amarilla
020 amarilla 1
55
Anexo 4 Individuos de Oxalis tuberosa utilizados para pruebas de extracción
Número de
accesión
Duplicado de la
muestra
Morfotipo de
tubérculo
001
001a
001b
No posee
005 No presenta No posee
011 No presenta Ibia Blanca
012 No presenta Ibia Roja
Estas son las muestras de ibia colectadas en primera salida de campo con las que se realizó la primera fase de
extraccion de ADN en el estudio.
56
Anexo 5. Gráficos de medias para parámetros evaluados durante la extracción de
ADN
a.
Gráfico representando las medias de los datos de concentración de ADN (ng/ml) en los protocolos evaluados
con muestras de ibia.
b.
Gráfico representando las medias de las proporciones de absorbancia 260/280 para determinar
presencia de proteínas y 260/230 para determinar carbohidratos u otros contaminantes en los
protocolos evaluados con muestras de ibia.
363,07
1129,43
197,49
372,18
48,43
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
1200,00
CTAB1 SDS CTAB 2 CTAB 3 STEFENONmodificado
Co
nce
ntr
acio
n n
g/u
l
Concentracion de ADN en protocolos
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
CTAB1 SDS CTAB 2 CTAB 3 STEFENONmodificado
Valores de pureza en protocolos evaluados A260/280 A 260/230
57
Anexo 6 Prueba de amplificación con primers RAM
a) CCA b) GT y TG c) CA y AG). Los números de los carriles corresponden a las cinco muestras colectadas
de ibia (1y 6= 001a; 2 y 7= 001b; 3y 8= 005; 4 y 9= 011; 5 y 10=012).
a
.
b
C.
58
Anexo 7. Protocolo y concentraciones para primers RAM
Primer Segmento Temperatura °C Tiempo Ciclos Reacción
AG 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial
2 95° 30 seg Desnaturalización
3 54° 45 seg Anillamiento
4 72° 2 min Extensión
5 72° 7 min Extensión final
CT 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial
2 95° 30 seg Desnaturalización
3 50° 45 seg Anillamiento
4 72° 2 min Extensión
5 72° 7 min Extensión final
CA 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial
2 95° 30 seg Desnaturalización
3 41° 45 seg Anillamiento
4 72° 2 min Extensión
5 72° 7 min Extensión final
GT 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial
2 95° 30 seg Desnaturalización
3 58° 45 seg Anillamiento
4 72° 2 min Extensión
5 72° 7 min Extensión final
CGA 1 95° 10min 40 Desnaturalización inicial
2 95° 30 seg Desnaturalización
3 44° 45 seg Anillamiento
4 72° 2 min Extensión
5 72° 7 min Extensión final
CCA 1 95° 10min 40 Desnaturalización inicial
2 95° 30 seg Desnaturalización
3 44° 45 seg Anillamiento
4 72° 2 min Extensión
59
5 72° 7 min Extensión final
TG 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial
2 95° 30 seg Desnaturalización
3 58° 45 seg Anillamiento
4 72° 2 min Extensión
5 72° 7 min Extensión final
Secuencias
Reactivos Concentración final
Buffer 1x
MgCl2 2.5mM
dNTPs 0.25mM
Primer 4µM
Taq polimerasa 1U
ADN 25ng
60
Anexo 8. Evidencia para condiciones adecuadas de PCR
Comparación entre amplificación con condiciones reportadas en Pissard et al. (2006) y condiciones utilizadas
previamente para amplificación con primers de marcadores moleculares RAM. a) prueba de amplificación con
primer ISSR: DHB (CGA)5. b) Prueba de amplificación con primer ISSR: DDC (CAC)5.
Diferencias en patrones de bandeo bajo distintas concentraciones de MgCl2 en la reaccion de PCR. Primer
ISSR utilizado: BDB (CAC) 5
Condiciones Pissard Condiciones RAM
a
b
61
Anexo 9. Protocolo Pissard
Protocolo para primers 1 a 6
- Paso de denaturacion de 10 min a 95°C
- 30 seg a 95°C
- 45 seg a Ta
- 2 min a 72°C
- Paso de elongación final 5 min a 72°C
Protocolo para primers 7-9
- Paso de denaturacion de 5 min a 94°C
- 1min a 94°C
- 45 seg a Ta
- 2 min a 72°C
- Paso de elongación final 4 min a 72°C
Reactivos Concentración final
Buffer 1x
MgCl2 1.5 - 2.5mM
dNTPs 0.08mM
Primer 0,4µM
Taq polimerasa 1U
ADN 5-10ng
35 ciclos
35 ciclos
62
Anexo 10 Matriz binaria
VHV (GT)5G BDB (CAC)5
150 200 400 500 600 650 1000 1100 1300 300 375 500
Roja1 1 ? 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1
Roja2 1 ? 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1
Roja3 1 ? 1 0 0 ? 0 0 0 1 1 1
Roja4 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1
Roja5 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1
Roja6 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1
Roja7 1 0 1 0 0 ? 0 0 1 1 1 1
Roja8 1 0 1 ? 0 1 0 0 0 1 1 1
Roja9 1 0 1 ? 0 ? 0 0 1 1 1 1
Roja10 1 ? 1 ? 0 0 0 0 0 1 1 1
Blanca1 1 ? 1 ? 0 1 0 0 0 1 1 0
Blanca2 1 0 1 ? 0 ? 0 0 1 1 1 1
Blanca3 1 0 ? 0 1 0 0 0 0 1 1 0
Blanca4 1 0 1 0 0 0 0 0 ? 0 0 0
Blanca5 1 0 1 ? 0 0 0 0 ? 1 1 1
Blanca6 1 1 1 ? 1 1 1 1 1 1 1 1
Blanca7 1 0 1 0 0 ? 0 0 ? 1 1 1
Blanca8 1 0 1 0 0 0 0 ? ? 1 1 1
Rosada1 1 0 ? 0 0 ? 0 0 0 1 1 1
Rosada2 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1
Rosada3 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0
Rosada4 1 1 1 ? 0 1 1 1 1 1 1 1
Rosada5 1 1 1 ? 0 1 1 1 1 1 1 1
Rosada6 1 ? ? 0 0 1 0 0 0 1 1 1
Rosada7 1 ? 1 ? 0 1 0 0 0 1 1 1
Rosada8 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1
Rosada9 1 ? 1 1 0 ? 0 0 0 1 1 1
Amarilla1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1
63
(AG)8 YT
250 350 450 500 700 900 1000 1500
1 1 1 0 0 0 0 0
1 1 1 0 1 1 1 0
1 1 1 0 1 1 1 0
1 1 1 0 1 1 1 0
1 1 1 0 0 1 0 0
1 1 1 1 1 1 0 1
1 1 1 0 0 1 0 0
1 1 1 1 1 1 0 1
0 1 1 1 0 1 0 0
0 1 1 1 ? 1 0 0
1 1 1 0 ? 1 0 0
1 1 1 1 1 1 0 0
1 1 1 1 1 1 0 0
0 1 1 0 0 1 0 0
0 1 1 1 ? 1 1 0
1 1 1 ? 0 1 ? 0
0 1 1 0 0 1 0 0
0 1 1 0 0 1 ? 0
1 1 1 0 0 1 1 0
1 1 1 0 0 1 1 0
1 1 1 0 0 1 1 0
1 1 1 0 0 1 1 0
1 1 1 0 0 1 1 0
0 1 1 0 0 1 1 0
1 1 1 0 0 1 1 0
0 1 1 0 0 1 0 0
0 1 1 ? 0 1 ? 0
0 1 1 0 0 1 1 0
64
(GA)8YC
150 200 250 300 350 400 500 550 700 800 900 1000 1750
0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1
? 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1
? 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1
? 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1
0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0
? 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0
0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1
? 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0
0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1
0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1
? 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1
? 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1
? 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0
1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1
0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1
0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0
0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1
? 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1
1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1
1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0
1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1
1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1
0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1
1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1
0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1
0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1
0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1
1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0
65
(AC)8 G (GA)8A
375 440 470 500 650 1750 200 300 700 1000
1 0 1 0 0 0 1 1 0 0
1 0 1 0 0 0 1 1 0 0
1 0 1 0 0 0 1 1 0 0
1 0 1 0 0 0 1 1 1 0
1 0 1 0 0 0 1 1 0 1
0 1 1 1 1 0 1 1 0 0
1 0 0 0 0 0 1 1 0 1
0 1 1 1 0 0 1 1 0 1
1 0 0 0 0 0 1 1 0 1
1 0 0 0 1 0 1 1 1 0
1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 1 0 0 1 1 1 0 0
0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
1 1 0 1 0 1 1 1 0 0
0 0 1 1 0 0 1 1 0 0
1 0 1 1 0 0 1 1 0 0
0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
1 0 0 0 0 0 1 1 1 0
1 0 1 0 1 0 1 1 1 0
1 0 1 1 0 0 1 1 1 1
1 0 1 1 1 0 1 1 1 1
1 0 1 0 1 0 1 1 0 1
1 0 1 1 1 0 1 1 0 0
1 0 1 0 0 0 1 1 0 1
1 0 1 0 0 0 1 1 0 0
1 0 1 1 0 0 1 1 0 0
0 0 0 0 1 1 1 1 0 0
1 0 1 0 0 0 1 1 0 0
66
Anexo 11. Matriz de Jaccard
Roja1 Roja2 Roja3 Roja4 Roja5 Roja6 Roja7 Roja8
Roja1 1
Roja2 0.85714286 1
Roja3 0.85714286 1 1
Roja4 0.72 0.84 0.875 1
Roja5 0.66666667 0.65384615 0.65384615 0.65517241 1
Roja6 0.55172414 0.6 0.62068966 0.55882353 0.58064516 1
Roja7 0.73913043 0.72 0.72 0.74074074 0.83333333 0.5483871 1
Roja8 0.53571429 0.5862069 0.60714286 0.59375 0.56666667 0.79310345 0.5862069 1
Roja9 0.65217391 0.64 0.64 0.66666667 0.68 0.48387097 0.82608696 0.62962963
Roja10 0.65217391 0.66666667 0.66666667 0.69230769 0.55555556 0.53333333 0.68 0.57142857
Blanca1 0.59090909 0.60869565 0.63636364 0.64 0.5 0.48275862 0.65217391 0.57692308
Blanca2 0.64 0.69230769 0.69230769 0.71428571 0.60714286 0.63333333 0.66666667 0.74074074
Blanca3 0.5 0.56521739 0.56521739 0.51851852 0.48 0.5 0.48 0.6
Blanca4 0.44444444 0.46428571 0.46428571 0.4516129 0.5 0.46875 0.55555556 0.40625
Blanca5 0.57692308 0.65384615 0.65384615 0.62068966 0.62962963 0.63333333 0.62962963 0.56666667
Blanca6 0.53571429 0.55172414 0.57142857 0.64516129 0.71428571 0.57575758 0.62068966 0.51515152
Blanca7 0.58333333 0.57692308 0.57692308 0.57142857 0.64 0.53333333 0.70833333 0.46666667
Blanca8 0.6 0.61538462 0.61538462 0.64285714 0.65384615 0.48484848 0.72 0.42424242
Rosada1 0.64 0.72 0.72 0.74074074 0.60714286 0.5483871 0.60714286 0.48387097
Rosada2 0.57142857 0.64285714 0.66666667 0.7 0.65517241 0.57575758 0.62068966 0.61290323
Rosada3 0.53333333 0.6 0.62068966 0.65625 0.5625 0.54285714 0.58064516 0.52941176
Rosada4 0.57142857 0.64285714 0.66666667 0.73333333 0.63333333 0.47222222 0.65517241 0.5
Rosada5 0.60714286 0.65517241 0.67857143 0.74193548 0.5625 0.52777778 0.63333333 0.51428571
Rosada6 0.625 0.70833333 0.73913043 0.73076923 0.59259259 0.46875 0.68 0.55172414
Rosada7 0.73913043 0.79166667 0.82608696 0.80769231 0.62962963 0.53125 0.72 0.56666667
Rosada8 0.59259259 0.5862069 0.60714286 0.67741935 0.5483871 0.47222222 0.62068966 0.51515152
Rosada9 0.53846154 0.55555556 0.55555556 0.55172414 0.51724138 0.51612903 0.62962963 0.46666667
Amarilla1 0.56 0.64 0.66666667 0.5862069 0.65384615 0.56666667 0.55555556 0.51724138
67
Roja9 Roja10 Blanca1 Blanca2 Blanca3 Blanca4 Blanca5 Blanca6
1
0.81818182 1
0.63636364 0.60869565 1
0.72 0.68 0.58333333 1
0.52173913 0.54545455 0.63157895 0.65217391 1
0.48148148 0.46428571 0.48 0.44827586 0.2962963 1
0.61538462 0.59259259 0.42857143 0.62962963 0.48 0.62962963 1
0.51724138 0.46666667 0.44827586 0.51612903 0.42857143 0.48387097 0.64285714 1
0.625 0.6 0.5 0.55555556 0.4 0.64 0.79166667 0.57142857
0.64 0.68 0.5 0.51724138 0.37037037 0.68 0.76 0.5862069
0.53571429 0.65384615 0.52 0.55172414 0.44444444 0.51724138 0.64285714 0.56666667
0.55172414 0.53333333 0.5 0.51612903 0.48148148 0.51612903 0.63333333 0.7
0.51612903 0.5483871 0.51724138 0.48484848 0.44827586 0.53125 0.59375 0.60606061
0.5862069 0.53333333 0.5 0.5483871 0.36666667 0.42424242 0.53125 0.73333333
0.56666667 0.56666667 0.51724138 0.5625 0.38709677 0.45454545 0.61290323 0.76666667
0.66666667 0.57692308 0.54166667 0.55555556 0.42307692 0.5 0.62962963 0.55172414
0.64 0.61538462 0.625 0.62962963 0.48 0.48275862 0.66666667 0.64285714
0.62962963 0.57142857 0.51851852 0.56666667 0.36666667 0.48387097 0.62068966 0.75862069
0.6 0.66666667 0.48 0.59259259 0.38461538 0.59259259 0.75 0.5
0.56 0.53846154 0.5 0.51851852 0.4 0.44827586 0.59259259 0.60714286
68
Blanca7 Blanca8 Rosada1 Rosada2 Rosada3 Rosada4 Rosada5 Rosada6 Rosada7 Rosada8 Rosada9
1
0.90909
091 1
0.65384
615
0.79166
667 1
0.55172
414
0.64285
714
0.77777
778 1
0.56666
667
0.65517
241
0.85185
185
0.86206
897 1
0.5
0.55172
414
0.68965
517 0.65625
0.66666
667 1
0.58620
69
0.62068
966
0.72413
793
0.63636
364
0.69696
97
0.83333
333 1
0.66666
667
0.70833
333 0.8
0.74074
074 0.75
0.74074
074
0.71428
571 1
0.70833
333 0.72
0.83333
333
0.71428
571
0.72413
793
0.71428
571
0.81481
481
0.86956
522 1
0.62962
963
0.64285
714 0.6
0.57575
758
0.58823
529
0.73333
333
0.89285
714
0.70370
37
0.76923
077 1
0.82608
696 0.76
0.62962
963
0.48387
097
0.54838
71
0.55172
414
0.64285
714 0.64
0.70833
333
0.64285
714 1
0.53846
154
0.57692
308
0.59259
259
0.62068
966 0.53125
0.56666
667 0.5
0.61538
462
0.61538
462
0.51612
903
0.51851
852
69
Anexo 12.Tabla de colores de tallos
Morfotipo # de accesión Nombre en dendrograma Código de color del tallo
Ibia Roja
032 Roja 1 187A
034 Roja 2 178D con 59b
035 Roja 3 59A
037 Roja 4 187A
041 Roja 5 59A
051 Roja 6 145b
054 Roja 7 187A
055 Roja 8 145b
056 Roja 9 187A
081 Roja 10 187A
Ibia blanca
022 blanca 1 145b
036 blanca 2 145b
038 blanca 3 145b
052 blanca 4 145b
053 blanca 5 145b
069 blanca 6 178D
079 blanca 7 145b
082 blanca 8 145b
Ibia rosada
040 rosada 1 178D
043 rosada 2 178D
044 rosada 3 178D
064 rosada 4 178D
068 rosada 5 59A
071 rosada 6 59B
074 rosada 7 194A
075 rosada 8 178C
080 rosada 9 194A
Ibia amarilla 020 amarilla 1 145b
194 A 178 C 178 D 145B 178C 178D 59 A 59B 187A
70
Anexo 13 Extracción de 29 muestras de ibia por medio de protocolo CTAB1
71
top related