estudio in vitro del riesgo de fototoxicidad de fármacosjcastell/fototoxicidad.pdf · adverso...
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Estudio in vitro del riesgo de Estudio in vitro del riesgo de fototoxicidad de ffototoxicidad de fáármacosrmacos
IntroducciIntroduccióónn
Fototoxicidad Fototoxicidad (mecanismos y t(mecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón)n)PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídica dica (Da(Dañño celular)o celular)ModificaciModificacióón de proten de proteíínas nas (Fotoalergia)(Fotoalergia)DaDañño al ADN o al ADN (Fotogenotoxicidad)(Fotogenotoxicidad)
FotogenotoxicidadFotogenotoxicidadSSBSSBComet AssayComet AssaySecuenciaciSecuenciacióónn
FotoalergiaFotoalergiaDiferenciaciDiferenciacióónn ((reccionesrecciones fotoalfotoaléérgicas/rgicas/fotoirritantesfotoirritantes))SensibilizaciSensibilizacióón y proliferacin y proliferacióón linfocitosn linfocitos
Fototoxicidad SistFototoxicidad Sistéémicamica
Existen compuestos, que sin tener un efecto Existen compuestos, que sin tener un efecto ttóóxico por si mismos, son capaces de absorber xico por si mismos, son capaces de absorber radiaciradiacióón ultravioleta y producir un efecto n ultravioleta y producir un efecto adverso (toxicidad).adverso (toxicidad).
FOTOSENSIBILIZACIFOTOSENSIBILIZACIÓÓNN
FFáármaco rmaco Sin efecto tSin efecto tóóxicoxicoLuzLuz Sin efecto tSin efecto tóóxicoxicoFFáármacormaco + + LuzLuz ToxicidadToxicidad
TERMOSFERATERMOSFERA
MESOSFERAMESOSFERA
ESTRATOSFERAESTRATOSFERA
TROPOSFERATROPOSFERA
Nivel del mar
TIERRATIERRA
1010--16 Km16 Km
50 Km50 Km
85 Km85 Km
500 Km500 Km
I.R.,
Vis
, UV
: I.R
., V
is, U
V:
λλ>
330
nm>
330
nm
UV
: U
V:
λλ20
020
0 --33
0 nm
330
nm
UV
U
V
λλ<
100
nm<
100
nm
RadiaciRadiacióón Solarn Solar
-90º
+15º
-56º
-2º
Infrarrojo (IR):Infrarrojo (IR): Longitud de onda > 760 Longitud de onda > 760 nmnm
Visible (Visible (VisVis):): 400 400 -- 760 760 nmnm
Ultravioleta (UV):Ultravioleta (UV):
UVUV--A: 320 A: 320 -- 400 400 nmnm
UVUV--B: 290 B: 290 -- 320 320 nmnm (absorbida estrato corneo)(absorbida estrato corneo)
UVUV--C: < 290 C: < 290 nmnm (filtrada por la atm(filtrada por la atmóósfera)sfera)
Espectro SolarEspectro Solar
*
RadiaciRadiacióón Solar y la Pieln Solar y la Piel
UVCUVC
UVC: UVC: no llega a la pielno llega a la piel
UVBUVB UVAUVA VISVIS
UVB: UVB: eritema, quemaduraseritema, quemaduras
UVA/VIS: UVA/VIS: fototoxicidad, fototoxicidad, fotoalfotoaléérgiargia
+ Fotosensibilizante+ Fotosensibilizante UVA/VIS:UVA/VIS: Alcanza capilares Alcanza capilares sangusanguííneosneos
FARMACOS FOTOSENSIBILIZANTESFARMACOS FOTOSENSIBILIZANTES
NaproxenoNaproxeno
SuprofenoSuprofeno AcidoAcido TiaprofTiaprofééniconico
KetoprofenoKetoprofeno
CarprofenoCarprofeno
NH
Cl
COOH
CH3
COOH
CH3OCOOH
CH3
H3CO
HOOC
CH3
OS
OS
COOH
CH3
AINESAINES
FARMACOS NO FOTOSENSIBILIZANTESFARMACOS NO FOTOSENSIBILIZANTES
FlurbiprofenoFlurbiprofenoFenoprofenoFenoprofeno
IndoprofenoIndoprofenoIbuprofenoIbuprofeno
H3C
H3CN
O
COOH
Me
COOH
MeO
F
COOH
MeCOOH
CH3
REACCIONES FOTOTOXICASREACCIONES FOTOTOXICAS
0102030405060
Aci
doTi
apro
feni
co
Prom
etac
ina
Car
prof
eno
Clo
rpro
mac
ina
Fent
iclo
r
Rea
ccio
nes f
otR
eacc
ione
s fot
óó tox
icas
(%)
toxi
cas (
%)
FOTOTOXICIDAD (ley de FOTOTOXICIDAD (ley de GrotthusGrotthus))
UVAUVA
OO22
11OO22
··
DaDaññoocelularcelular
FFáármacormaco
Los efectos tLos efectos tóóxicos pueden ser debidos a:xicos pueden ser debidos a:
Intermedios de vida media Intermedios de vida media muy cortamuy corta(estados activados, radicales etc.)(estados activados, radicales etc.)
Intermedios de vida media Intermedios de vida media cortacorta(especies reactivas de ox(especies reactivas de oxíígeno)geno)
FotoproductosFotoproductos establesestables
Estrategia racional para investigar los efectos Estrategia racional para investigar los efectos fotobiolfotobiolóógicosgicos de nuevos compuestosde nuevos compuestos
La intervenciLa intervencióón relativa de las foton relativa de las foto--reacciones primariasreacciones primarias
La accesibilidad del compuesto La accesibilidad del compuesto fotoactivadofotoactivado al lugar de al lugar de acciaccióónnEl grado de daEl grado de dañño causado a biomolo causado a biomolééculasculas
Los efectos biolLos efectos biolóógicos producidos por un gicos producidos por un compuesto fototcompuesto fototóóxico, van a depender de la xico, van a depender de la contribucicontribucióón de los siguientes factores:n de los siguientes factores:
Propiedades FotofPropiedades FotofíísicassicasEstudios FotoquEstudios Fotoquíímicos con biomolmicos con biomolééculasculasCorrelaciCorrelacióón estructura/actividadn estructura/actividadFotosensibilizaciFotosensibilizacióón in vitro n in vitro (aguda)(aguda) efectos efectos citotcitotóóxicosxicosFotogenotoxicidad, Fotogenotoxicidad, mutagmutagéénesisnesis y y carcinogcarcinogéénesisnesisEfectos inmunolEfectos inmunolóógicos inducidos por la luzgicos inducidos por la luzFototoxicidad sistFototoxicidad sistéémica; fototoxicidad de mica; fototoxicidad de
metabolitosmetabolitos
Estrategia racional para investigar los efectos Estrategia racional para investigar los efectos fotobiolfotobiolóógicosgicos de nuevos compuestos (II)de nuevos compuestos (II)
InvestigaciInvestigacióón n inin vitrovitro del potencial del potencial fototfototóóxico de fxico de fáármacos rmacos
Abu
ndan
cia
rela
tiva
1.4
nm
Abs
orba
ncia
Abs
orba
ncia
0
1
2
00
0.30.3
0.60.6
0.90.9
1.21.2
250 300 350 400
Espectro SolarEspectro Solar
FFáámacomaco No FotosensibilizanteNo FotosensibilizanteFFáámacomaco FotosensibilizanteFotosensibilizante
SuperposiciSuperposicióón de los espectros de absorcin de los espectros de absorcióón de fn de fáármacos y rmacos y el espectro de luz solar incidente en la pielel espectro de luz solar incidente en la piel
Fototoxicidad Fototoxicidad
FFáármacormaco** DaDañño Celular o Celular (interacci(interaccióónn con Lcon Líípidos, Protepidos, Proteíínas o nas o DNA)DNA)
DaDañño celular. To celular. Téécnicas de ancnicas de anáálisislisis
PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotoFoto--uniunióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (FotoFoto--genotoxicidadgenotoxicidad))
Fototoxicidad Fototoxicidad
FFáármaco* interacciona con Lrmaco* interacciona con Líípidos Protepidos Proteíínas o ADN (Danas o ADN (Dañño Celular)o Celular)
Mecanismos y tMecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón del dan del dañño celularo celular
PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotoFoto--uniunióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (FotoFoto--genotoxicidadgenotoxicidad))
0 10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
50
60 TPA DTPA Control
LA h
ydro
pero
xide
s (µ
M)
Irradiation time (min)
(up to 4 isomers; two trans,cis-dienesand two trans,trans-dienes)
200 220 240 260 280 3000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
9- and 13-Hydroperoxides
Abso
rptio
n
Wavelength (nm)
(D)TPA Fotosensibiliza la (D)TPA Fotosensibiliza la PeroxidaciPeroxidacióónnde los de los áácidos grasos (cidos grasos (acac. . LinolLinolééicoico))
Photosensitizer
O2R R ´
LAhv
R R ´
OOH
9- and 13-HydroperoxidesR R ´
OOH
FotoperoxidaciFotoperoxidacióónn LipLipíídicadica
ÁÁcido cido LinoleicoLinoleico
FFáármacormaco
233 233 nmnm
233 233 nmnm¡
¡
AbsAbs
AbsAbs
Fototoxicidad Fototoxicidad
FFáármaco* interacciona con Lrmaco* interacciona con Líípidos Protepidos Proteíínas o ADN (Danas o ADN (Dañño Celular)o Celular)
Mecanismos y tMecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón del dan del dañño celularo celular
PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotoFoto--uniunióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (FotoFoto--genotoxicidadgenotoxicidad))
AT
hν(2X)
OH
OHProteína
AT O O ··ATHATH··
Proteína
OH
ATHATH··Proteína
Proteína
OH
Proteína
Modificaciones de proteModificaciones de proteíínasnas
Tyr, Trp, HisTyr, Trp, His
UniUnióónn covalentecovalente
FotocrosslinkingFotocrosslinking
• Chem. Res. Toxicol. 11, 172-177 (1998).• Eur. J. Org. Chem, 497-502 (1999)
FotoFoto--uniunióón a proten a proteíínas (uninas (unióón covalente)n covalente)EspectrofotometrEspectrofotometríía / a / FluorimetrFluorimetrííaa (previa purificaci(previa purificacióón o extraccin o extraccióón)n)DotDot blotblot / / westernwestern blotblot **ELISA ELISA **Radioactividad (compuestos marcados)Radioactividad (compuestos marcados)
FotoFoto--uniunióón a cn a céélulaslulasVisualizaciVisualizacióón directa al microscopio n directa al microscopio (solo compuestos fluorescentes)(solo compuestos fluorescentes)InmunotiniInmunotinióónn **DotDot blotblot / / westernwestern blotblot **CitometrCitometríía de flujo a de flujo **
* Son necesarios anticuerpos especSon necesarios anticuerpos especííficosficos
FormaciFormacióón de aductosn de aductos
FFÁÁRMACO RMACO --COOHCOOH + +
ObtenciObtencióón de Anticuerpos Fn de Anticuerpos Fáármacormaco--EspecEspecííficosficos
RSARSA
NHNH22 EDCEDC
InmunizaciInmunizacióón de los conejosn de los conejos
HaptenoHapteno + + AdjuvanteAdjuvante
sangrsangrííaa
AnticuerposAnticuerpos
HaptenoHapteno
OOFFáármacormaco--CC--NHNH--RSARSA
UVAUVA
GelGel--filtracifiltracióónn
Monitorización espectrofotométrica
FFáármacormacolibrelibre
AductoAductoFFáármacormaco--ProteProteíínana
FotoFoto--uniunióónn a a proteproteíínasnas
BSA-TPA
0
0,5
240 280 320 360 400
nm
Abs
TPA
1
FormaciFormacióón de aductos de proten de aductos de proteíína na
Análisis mediante gel-filtración y monitorización espectrofotométrica
FotoFoto--uniunióónn a a proteproteíínasnas
BSA
Western blotWestern blot
ElectroforesisElectroforesis
TinciTincióón de n de proteproteíínasnas
cpm
+ + SustratoSustrato FFáármacosrmacosradioactivosradioactivos
FotoFoto--uniunióónn a a proteproteíínasnas
33HH1414CC
Western blotWestern blotFFáármacosrmacos marcadosmarcados
MezclasMezclas de de irradiaciirradiacióónn (UV, HSA, (UV, HSA, FcoFco))
Densitometria Densitometria
Proteína Western3 horas
Modificaciones en proteModificaciones en proteíínas fotosensibilizadas por TPAnas fotosensibilizadas por TPA
M BSA + TPA
24 -
198 -
75 -
49 -
Kd
0 15’ 1h 3hTiempoTiempo de de irradiaciirradiacióónn
+ + SustratoSustrato
ELISA ELISA ((EnzymeEnzyme--LinkedLinked ImmunosorbentImmunosorbent Assay)Assay)
LavadoLavado LavadoLavado
SIEMBRA:SIEMBRA:MezclasMezclas de de irradiaciirradiacióónn (UV, HSA, (UV, HSA, FcoFco.) .) AntAntíígeno fotoqugeno fotoquíímicomicoAntAntíígeno sintetizadogeno sintetizado ququíímicamentemicamente
pmolpmol TPA/pocilloTPA/pocillo0.10.1 11 1010
Abs
orba
ncia
(10
Abs
orba
ncia
(10-- 33
))
200200
400400
600600
800800
10001000
12001200
14001400
CuantificaciCuantificacióón de foton de foto--aductos por medio de ELISAaductos por medio de ELISA
AbsAbs = 825 x 10= 825 x 10--33
BSA irradiado TPABSA irradiado TPA
pmol = 1
Curva patrCurva patróónn
FotoFoto--uniunióón a proten a proteíínasnas
Fototoxicidad Fototoxicidad
FFáármaco* interacciona con Lrmaco* interacciona con Líípidos Protepidos Proteíínas o ADN (Danas o ADN (Dañño Celular)o Celular)
Mecanismos y tMecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón de dan de dañño celularo celular
PeroxidaciPeroxidacióónn LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotouniFotounióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (Fotogenotoxicidad)Fotogenotoxicidad)
Ruptura de ADNRuptura de ADNModificaciones de basesModificaciones de basesMutacionesMutaciones
Especies Especies reactivasreactivas
hhννFFáármacormaco
Daño al ADN
- -
FOTOGENOTOXICIDAD FOTOGENOTOXICIDAD
EfectosEfectos biolbiolóógicosgicosDaDañño al ADNo al ADN (ruptura de ADN, da(ruptura de ADN, dañño oxidativo)o oxidativo)MutagMutagéénesisnesisCarcinogCarcinogéénesisnesis
TTéécnicas experimentalescnicas experimentalesModificaciModificacióón de ADN n de ADN (rupturas de cadena, bases, Comet (rupturas de cadena, bases, Comet
assayassay))TestTest de reparacide reparacióón de n de SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae mutantemutanteCarcinogCarcinogéénesisnesis in vivoin vivo (e.g. (e.g. SkhSkh--1 1 mousemouse))
FOTOGENOTOXICIDAD FOTOGENOTOXICIDAD
FOTOGENOTOXICIDAD FOTOGENOTOXICIDAD
- -
••SecuenciaciSecuenciacióónn••Ruptura de ADN (SSB)Ruptura de ADN (SSB)••Comet AssayComet Assay
PlPláásmido smido SuperSuper--enrolladoenrollado
FFáármacormaco
Ruptura de Ruptura de cadenacadena SimpleSimple(el pl(el pláásmido se smido se circularizacirculariza))
Ruptura de Ruptura de cadenacadena DobleDoble(el pl(el pláásmido se smido se linearizalineariza))
Forma I
Forma II
Forma III
Ruptura de ADN (SSB)Ruptura de ADN (SSB)
PbrPbr 322322
PbrPbr 322322 PbrPbr 322 + TPA 0.25 mM322 + TPA 0.25 mM
Forma II (circular)Forma III (lineal)Forma I (empaqueta
Forma II
0 15 45 75 105 135
Irradiación UVA (minutos)
0 135
Ruptura de ADN (SSB)Ruptura de ADN (SSB)
00
2020
4040
6060
8080
100100
120120
Control Control 135 135 00
TiempoTiempo de de irradiaciirradiacióónn UVA (UVA (minutosminutos))
1515 4545 7575 135135
% F
orm
a II
y III
% F
orm
a II
y III Forma IIIForma III
Forma IIForma II
CuantificaciCuantificacióón de la n de la abundanciaabundancia relativarelativa de de laslas formasformas II y III II y III ((mediantemediante densitomerdensitomerííaa de un gel)de un gel)
00TPA 0.25 mMTPA 0.25 mM
UtilizaciUtilizacióónn de enzimas de enzimas especespecííficosficos parapara revelarrevelardadaññosos en el ADNen el ADN
T4 T4 EndonucleasaEndonucleasa V: V: Revela los dRevela los díímeros de timidina, meros de timidina, citosina (pirimidinas) y los sitios sin bases.citosina (pirimidinas) y los sitios sin bases.
FpgFpg ((FormamidoFormamido pyrimidine pyrimidine glycolaseglycolase)) :: Revela daRevela dañño oxidativo en o oxidativo en guaninas (8guaninas (8--oxoguaninaoxoguanina) y adeninas. ) y adeninas.
EndonucleasaEndonucleasa III: III: Revela daRevela dañños oxidativos en os oxidativos en timidinastimidinas, , citosinascitosinas y los sitios sin bases.y los sitios sin bases.
NO ENZYMENO ENZYME FPGFPG ENDO IIIENDO III
2,5
2,5
µµ M n
o U
VA
M n
o U
VA
UV
AU
VA
alon
eal
one
1 1 µµ MM
2,5
2,5
µµ MM
0,5
0,5
µµ MM
UV
A 1
5U
VA
15
’’
2,5
2,5
µµ M n
o U
VA
M n
o U
VA
UV
AU
VA
alon
eal
one
2,5
2,5
µµ MM
0,5
0,5
µµ MM
2,5
2,5
µµ M n
o U
VA
M n
o U
VA
UV
AU
VA
alon
eal
one
2,5
2,5
µµ MM
0,5
0,5
µµ MM
1 1 µµ MM
1 1 µµ MM
UV
A 1
5U
VA
15
’’
UV
A 1
5U
VA
15
’’
UtilizaciUtilizacióónn de enzimas de enzimas especespecííficosficos parapara revelarrevelardadaññosos en el ADN en el ADN porpor TPATPA
ESTRUCTURA DEL ADNESTRUCTURA DEL ADN
PlPláásmidosmido
Nucleosome
Solenoid
Uncoiled chromatinDNA strand Chromosome
Estructurade un gen
Comet AssayComet Assay
Control TPA
UVA TPA + UVA
CCéélulaslulas en en suspensisuspensióónn
+ F+ Fáármacormaco
+ Agarosa+ Agarosa
UVAUVA
++ -- TinciTincióónn
TTéécnicascnicas de de valoracivaloracióónn in vitroin vitro de la de la FototoxicidadFototoxicidad a a nivelnivel celularcelular
UVAUVA
OO2211OO22
··
DaDaññoocelularcelular
FFáármacormaco
NeutralRed
MTT
LDH
Mediadores de la inflamaciónIL - 1β, IL - 6, PEG2
FototoxicidadFototoxicidad CelularCelular
FFáármacormaco
células
UVA
Test de viabilidad
FototoxicidadFototoxicidad CelularCelular
X
FFáármacormacoX
Cultivo de cCultivo de céélulas epiteliales humanaslulas epiteliales humanas
KeratinocitosKeratinocitosFibroblastosFibroblastosModelos de piel Modelos de piel ((EpiskinEpiskin, , EpidermEpiderm..)..)
TTÉÉCNICAS DE VALORACICNICAS DE VALORACIÓÓN DE N DE VIABILIDAD CELULARVIABILIDAD CELULAR
•• LDH LDH •• RojoRojo NeutroNeutro (NRU)(NRU)•• MTTMTT
LDHLDH
• J. Pharm. Sci. 76, 374-378, (1987).• Photochem. Photobiol. 46, 991-996 (1987).
COOH COOCH3
+++
+ +
CH2OH
hνCH3OH
7 h.I (1%) II (5%) III (21%)
VI (5%)
OH
V (8%)
O
IV (8%)0
50
100
150
200
250
300
350
400
Control I II IV V Ibup
Xenobiotic
LDH
act
ivity
in c
ultu
re m
ediu
m
(mU
per
pla
te)
FFáármacormacoControlControl
Ibuprofeno
TestTest del Rojo Neutro (RNU)del Rojo Neutro (RNU)
Solo las cSolo las céélulas que no estlulas que no estáán dan daññadas con capaces de tomar el adas con capaces de tomar el rojo neutro en sus lisosomasrojo neutro en sus lisosomas
FFáármacormaco
+ + RojoRojo NeutroNeutro
MMéétodotodo colorimcoloriméétricotrico, , basadobasado en la en la capacidadcapacidad queque presentanpresentan laslas ccéélulaslulas viablesviables de de reducirreducir el MTT (el MTT (salsal de de tetrazoliotetrazolio) en un ) en un compuestocompuesto insoluble en insoluble en aguaagua queque quedaquedaretenidoretenido en en laslas ccéélulaslulas ((azulazul de de formazformazáánn). ). EstaEsta actividadactividad estestáá presentepresente en en laslasmitocondrias y el mitocondrias y el enzimaenzima responsableresponsable eses la la succinatosuccinato deshidrogenasa. deshidrogenasa. TranscurridoTranscurrido el el periodoperiodo de de incubaciincubacióónn con con laslas ccéélulaslulas, el , el colorantecolorante formadoformado se se extraeextrae de de laslas ccéélulaslulas, , se se disuelvedisuelve y se lee y se lee susu absorbanciaabsorbancia a 550 nm.a 550 nm.
MTTMTT
No absorbe a 550 No absorbe a 550 nmnm MMááximo de ximo de absabs a 550 a 550 nmnm
0102030405060708090
100
Oscuro LUZ 15minutos
LUZ 60minutos
ControlIBUTPA
Via
bilid
adV
iabi
lidad
(% d
el c
ontro
l)(%
del
con
trol)
Test de viabilidad MTTTest de viabilidad MTTFármacos a 0.3 mM.UVA = 0.9 mw/cm2
Medida de Prostaglandina en fibroblastos humanos Medida de Prostaglandina en fibroblastos humanos irradiados en presencia de irradiados en presencia de áácido cido fenoffenofííbricobrico
FFA ( µM)
0.1 1 10 1000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000dark controlirradiated
B
C
FFA ( µM)
0.1 1 10 100 1000
MTT
(% o
f con
trol)
0
20
40
60
80
100
120
dark controlirradiated
A
PGE 2(
pg/m
l)C
IntroducciIntroduccióónn
Fototoxicidad Fototoxicidad (mecanismos y t(mecanismos y téécnicas de valoracicnicas de valoracióón)n)PeroxidacionPeroxidacion LipLipíídicadicaModificaciModificacióón de proten de proteíínas (nas (FotoFoto--uniunióónn))DaDañño al ADN (o al ADN (FotoFoto--genotoxicidadgenotoxicidad))
FotogenotoxicidadFotogenotoxicidadSSBSSBComet AssayComet AssaySecuenciaciSecuenciacióónn
FotoalFotoaléérgiargiaDiferenciaciDiferenciacióónn ((reccionesrecciones fotoalfotoaléérgicas/rgicas/fotoirritantesfotoirritantes))SensibilizaciSensibilizacióón y proliferacin y proliferacióón linfocitosn linfocitos
Fototoxicidad SistFototoxicidad Sistéémicamica
FOTOTOTOXICIDADFOTOTOTOXICIDAD* Generalizada* Generalizada* Manifestaciones en todos los individuos a * Manifestaciones en todos los individuos a
la dosis adecuadala dosis adecuada* Puede aparecer en la primera exposici* Puede aparecer en la primera exposicióónn* Los efectos son dependientes de la dosis* Los efectos son dependientes de la dosis
del agente y la radiacidel agente y la radiacióónn* Erupci* Erupcióón n monomorfamonomorfa con edemacon edema* Per* Perííodo prodrodo prodróómicomico* Citotoxicidad debida a productos * Citotoxicidad debida a productos intermediosintermedios
* Lesi* Lesióón exclusivamente en el n exclusivamente en el áárea expuestarea expuesta* No hay reacci* No hay reaccióón cruzadan cruzada* El individuo no queda sensibilizado* El individuo no queda sensibilizado
FOTOALFOTOALÉÉRGIARGIA* Idiosincr* Idiosincráásicasica* Baja incidencia* Baja incidencia* Requiere una segunda exposici* Requiere una segunda exposicióónn* No dependiente de la dosis de agente y * No dependiente de la dosis de agente y radiaciradiacióónn* Eczema, * Eczema, papulaspapulas, urticaria, urticaria* Las primeras manifestaciones no * Las primeras manifestaciones no aparecen hasta los 7aparecen hasta los 7--21 d21 dííasas* Participaci* Participacióón del Sistema n del Sistema InmunolInmunolóógicgic* Lesiones diseminadas, brotes* Lesiones diseminadas, brotes* Reacciones cruzadas* Reacciones cruzadas* El individuo queda sensibilizado, incluso * El individuo queda sensibilizado, incluso durante adurante aññosos
REACCIONES FOTOALREACCIONES FOTOALÉÉRGICASRGICAS
00.5
11.5
22.5
33.5
Aci
doTi
apro
feni
co
Fent
iclo
r
Car
prof
eno
Prom
etac
ina
Clo
rpro
mac
inaR
eacc
ione
s R
eacc
ione
s fot
oal
foto
aléé r
ficas
rfic
as(%
)(%
)
FOTOALFOTOALÉÉRGIARGIA
TTH 1H 1
DaDaññoo celularcelular mediadomediadoporpor el el sistemasistema inmuneinmune
Activación del sistema inmune
hhνν
FFáármacormacoTcTc/K/K
TH0
APCAPC
IgG IgM
TTH 1H 1
TTH 2H 2
BB
MacrMacróófagosfagos
FotoFoto--uniunióón a proten a proteíínas (uninas (unióón covalente)n covalente)EspectrofotometrEspectrofotometríía / a / FluorimetrFluorimetrííaa (previa purificaci(previa purificacióón o extraccin o extraccióón)n)DotDot blotblot / / westernwestern blotblot **ELISA ELISA **Radioactividad (compuestos marcados)Radioactividad (compuestos marcados)
FotoFoto--uniunióón a cn a céélulaslulasVisualizaciVisualizacióón directa al microscopio n directa al microscopio (solo compuestos fluorescentes)(solo compuestos fluorescentes)InmunotiniInmunotinióónn **DotDot blotblot / / westernwestern blotblot **CitometrCitometríía de flujo a de flujo **
* Son necesarios anticuerpos especSon necesarios anticuerpos especííficosficos
FFáármacormaco
células
Inmunotinción
FotoFoto--uniunióónn a a ccéélulaslulas
Citometría de flujoXX
UVAUVA
OSCURIDAD
Control TPA (0.3 mM)
Texas Red
Peroxidase
(Anti TPA + labelled 2nd antibody)
InmunotinciInmunotincióónn de de ccéélulaslulas 3T3 3T3 irradiadasirradiadas con TPAcon TPA
+ + enzimaenzima
CitometrCitometríía de a de flujoflujo de de ccéélulaslulas de de ratratóónn irradiadosirradiados en en presenciapresencia de TPA y DTPAde TPA y DTPA
KineticKinetic UVA UVA irradiationirradiation
IrrdiationIrrdiation ((JulsJuls))
Fluo
resc
ence
Fluo
resc
ence
(( Geo
met
ricG
eom
etric
mea
n)m
ean)
11
22
33
44
55
66
77
88
99
0.00.0 0.50.5 1.01.0 1.51.5 2.02.0
TPA 50 TPA 50 µµg/mlg/mlDTPA 50 DTPA 50 µµg/mlg/ml
Control Control withoutwithout drugdrug
(Anti TPA labelled with texas red)
ConcentrationConcentration ((µµg/ml)g/ml)
00 1010 2020 3030 4040 5050
55
DTPADTPA
Control Control DarkDark
2 J. 2 J. IrradiationIrradiation
TPATPA
Fluo
resc
ence
Fluo
resc
ence
(( Geo
met
ricG
eom
etric
mea
n)m
ean)
11
22
33
44
55
66
77
88
99
* * FotoantFotoantíígenogeno (SUP)(SUP)* * MitogenoMitogeno (Con A)(Con A)* * Control negativoControl negativo
InmunizaciInmunizacióón n de Ratonesde Ratones
ExtracciExtraccióón del Bazo, n del Bazo, obtenciobtencióón de linfocitosn de linfocitos(gradiente de centrifugaci(gradiente de centrifugacióón)n)
ProliferaciProliferacióónnde linfocitosde linfocitos
Siembra en PlacaSiembra en Placa
Fibroblastos de ratFibroblastos de ratóón n irradiados con SUPirradiados con SUP
DetecciDeteccióón de Linfocitos sensibilizados contra fn de Linfocitos sensibilizados contra fáármacosrmacos
33H TimidinaH Timidina + +
Ratón Control Ratón SUP400400
600600
800800
10001000
12001200
14001400
16001600
18001800
20002000
Control -SUPCon A
Tim
idin
a Ti
mid
ina
33 H (
H ( c
pmcpm
// min
min
))ProliferaciProliferacióón de Linfocitosn de Linfocitos
UVAUVA
Medida inflamaciMedida inflamacióón de la orejan de la oreja(mediante un micr(mediante un micróómetro)metro)
ExtracciExtraccióón y ann y anáálisis de nlisis de nóódulos linfdulos linfááticos prticos próóximos a la zonaximos a la zona(contaje total de c(contaje total de céélulas y subpoblaciones)lulas y subpoblaciones)
FFáármacormaco
Modelo integrado para la diferenciaciModelo integrado para la diferenciacióón entre fn entre fáármacos que rmacos que inducen a reacciones fotoalinducen a reacciones fotoaléérgicas y/o rgicas y/o fotoirritantesfotoirritantes
0,19
0,2
0,3
1,8
14,5
0,1
5,8
0,8
16,6
0,010,01 0,10,1 11 1010 100100
oral + UVoral + UV
SPA SPA
31183118
88--MOP MOP
CHLCHL
OLA OLA
dermal +UVdermal +UV
88-- MOP 0,3% MOP 0,3% epicu.+UVAepicu.+UVA
TCSA 1% TCSA 1% epicuepicu. +UVA. +UVA
dermal dermal -- UVUV
CROT.1% CROT.1% epicuepicu..
OXA 1% OXA 1% epicuepicu..
Irritant Potential Irritant Potential Irritant Potential
Allergic Potential Allergic Potential
IndiceIndice de de DiferenciaciDiferenciacióónn::% del n% del nºº mmááximo de cximo de céélulas del NL lulas del NL
incremento en % del la inflamaciincremento en % del la inflamacióónn
Fototoxicidad epitelial mediada por metabolitos Fototoxicidad epitelial mediada por metabolitos producidos en otros producidos en otros óórganos ( Hrganos ( Híígado) gado)
Fototoxicidad sistFototoxicidad sistéémica mediada por mica mediada por fotoproductosfotoproductosproducidos en la pielproducidos en la piel
Fototoxicidad de metabolitosFototoxicidad de metabolitos
CYPCYP--VirusVirus
24 24 horashoras
FFáármacormaco
FormaciFormacióónn dedemetabolitosmetabolitos
CCéélulaslulas epitelialesepiteliales Test de Test de viabilidadviabilidadCCéélulaslulas modificadasmodificadas((expresanexpresan CYPs)CYPs)
UsoUso de de ccéélulaslulas modificadasmodificadas geneticamentegeneticamente parapara producirproducir metabolitosmetabolitos
EnsayoEnsayo in vitroin vitro parapara investigarinvestigar el el riesgoriesgofototfototóóxicoxico de de loslos metabolitos de un metabolitos de un ffáármacormaco
hν
FototoxicidadFototoxicidadsistsistéémica mica mediadamediadaporpor fotoproductosfotoproductosproducidosproducidos en la en la pielpiel
EfectosEfectos en DNAen DNA• SSB plasmid DNA• Daño Oxidativo Efectos
Efectos en en LLíípidos
pidos
•Oxidación del ácido
Linoleico (UV; HPLC)Efec
tos
Efec
tos e
n en P
rote
Prot
eííansan
s
•Cr
ossli
nkin
g(P
AGE)
•Fo
to-u
nió
(ELI
SA)
PrePre--screeningscreening
Análisis de fármacos potencialmente fotosensibilizantes
22ºº ScreeningScreening
Efectos fototóxicosdependientes de
metabolitos• Fotoxicidad de Fotoproductos
• Fototoxicidad de Metabolitos
EfectosEfectos fototfototóóxicosxicosdependientesdependientes de de
metabolitosmetabolitos• Fotoxicidad de Fotoproductos
• Fototoxicidad de Metabolitos
Genotoxicidad• Comet assay
• Daño oxidativo a ADN celular
• Reparación def. Sacharomyces
GenotoxicidadGenotoxicidad• Comet assay
• Daño oxidativo a ADN celular
• Reparación def. Sacharomyces
FFáármacormaco FotosensibilizanteFotosensibilizante((--)) ((++))
Test de Test de viabilidadviabilidad 3T3/fibroblastos 3T3/fibroblastos humanoshumanos11erer ScreeningScreening
Inmunotoxicidad & Fotoalérgia
• Discriminación entre potencial(foto) irritante/alérgico
InmunotoxicidadInmunotoxicidad & & FotoalFotoaléérgiargia
• Discriminación entre potencial(foto) irritante/alérgico
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