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Enfermedad Inflamatoria Enfermedad Inflamatoria IntestinalIntestinalEstudios complementarios
“ Una década de experiencia”
Dr. Oscar Venegas RMédico InmunólogoMédico Inmunólogo
Dpto. PediatríaDpto. Pediatría
Fac. de MedicinaFac. de Medicina
Univ. de ConcepciónUniv. de Concepción
…1996 --------------------------------���� 2006……….
0 13 24 71 113223
481 611811940
10771234
1505
1861
22722413
27462919
35753518
357636273899
4261
48555034
5384
5818
6243
6633
1731
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
6000
6500
7000
1976
1977
1978
1979
1980
1981
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1983
1984
1985
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1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
PapersDatos Tomados de PubMed usando las palabras: “flow Cytometry”
Proyect ACHS -> ONCOINMUN
Citometría de Flujo : Publicaciones / año
PMT
PMT
PMT
PMT
DichroicFilters
BandpassFilters
Flow Cytometry Optics
Laser
1
2
3
4
Flow cell
FITC Fluorescence
Mo1
CD4 CD8
CD8
CD45
leu11a
CD20 Tube
ID
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas iniciales
� Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias
� Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas
� Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular
� Estudio de HLA-B27
� Estudio de Células Progenitoras (CD34)
� Estudio de Citokinas Intracelulares
1996
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respirato rio,
fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Microbiología• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
2006
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Espectro de presentación.
Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn
Alteración de la Alteración de la inmunoinmuno--regulación regulación de mucosa intestinalde mucosa intestinal
…1996……1997…..1999….2006--------����
Gastroenterología ----- Inmunología ------ Patología
Citometría de Flujo
Clínica Investigación
E I IE I I
Patología---Gastroenterología---Inmunología
CITOMETRIA DE FLUJO CITOMETRIA DE FLUJO Gastroenterología: E I I y CáncerGastroenterología: E I I y Cáncer
�� Inmunología y pólipos de colon.Inmunología y pólipos de colon.
�� Enfermedad Inflamatoria Intestinal.Enfermedad Inflamatoria Intestinal.
� Tumores sólidos:
�Ciclo celular y Ploidía de ADN.
�Proteínas del ciclo celular
�Oncogenes
� Cáncer de Esófago
� Linfoma
2006
COLITIS ULCEROSA ENFERMEDAD DE CROHN
Proceso inflamatorio difuso continuo, limitado al colon
Afecta a todo el tracto digestivo
Inflamación superficial de la mucosa
Proceso transmural y granulomatoso
Compromiso de mucosa discontinuo
Presencia de pseudopólipos
Colon normal
CrohnCrohn
C.U.
A- Colon normal. B- Enferm. Crohn. C- coliti s ulcerosa.
Mucosa del colonDiferencias histológicas en la micro-arquitectura e infiltrado inflamatorio leucocitario
� Auto-reconocimento
� Beneficios:
� Protección de invasores
� Eliminación de Tej. Alteredos
� Deterioros:
� Molestias (inflamación)
� Daño a tejidos (autoinmunidad)
� Auto-reconocimento
� Beneficios:
� Protección de invasores
� Eliminación de Tej. Alteredos
� Deterioros:
� Molestias (inflamación)
� Daño a tejidos (autoinmunidad)
Consecuencias de la RespuestaInmune
ConsecuenciasConsecuencias de la de la RespuestaRespuestaInmuneInmune
AUTOINMUNIDAD
Tolerancia Tolerancia TisularTisular
� “Inmunodeficiencia de la Regulación”
Intolerancia Tisular
Fisiológico
Patológico
Fenómenos Activos
Implicancias
fisiológicas y
patológicas
del “homing”
celular linfoide
Implicancias
clínicas e
inmunopatológicas
del “homing”
celular en la
inflamación
SISTEMA INMUNE MUCOSALSISTEMA INMUNE MUCOSAL
� Estructura, ontogénesis y fisiología.
� Sistema inmune mucosal.
� Fisiopatología e implicancias clínicas.
� Tolerancia / Autoinmunidad
� El sistema inmune de mucosas asociado al tracto gastrointestinal brinda los mecanismos protectores contra la invasión de patógenos potenciales y a su vez pe rmite la tolerancia de productos inmunogénicos de la digesti ón y de la flora microbiana intestinal normal.
� Numerosas alteraciones de la inmunidad de la mucos a intestinal involucran disturbios con mecanismos de daño inmune activos ( tipo I, II, III y IV ).
� Estos mecanismos de daño activados, se manifiestan en modelos inmunopatogénicos clásicos: Hipersensibilidad, autoinmunidad e inmunodeficiencia.
Implicancias clínicasImplicancias clínicas
Alteración de la inmunoregulaciónde mucosa intestinal
• Alt. Tolerancia Inmunológica a Ags. Lumen• Predisposición genética• Epitelio intestinal:
• Permeabilidad aumentada• Secreción de citoquinas• Actúa como CPA
• Macrófagos de la lámina propia:• Perpetúan proceso inflamatorio, al expresar
moléculas de superficie ausentes en mucosa intestinal normal
Macrófagos intestinales:
• Están localizados en la región subepitelial de la mucosa.
• Constituyen entre 10 a 20% de las células mononucleares
de la lamina propia.
• Detección de su fenotipo:
• Inmunohistoquímica
• Citometría de Flujo
• Existe diferencia entre las poblaciones de macrófagos
encontrados en mucosa de EII y en personas que no la
presentan
Fiocchi C. Am J Physiol.1997,273:G769-75 Young HE et al. Dev Dyn.1995;202:137-44
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Espectro de presentación.
Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn
Alteración de la Alteración de la inmunoinmuno--regulación regulación de mucosa intestinalde mucosa intestinal
Inflamación persistente y/o recurrente
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn
Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):
• Células epiteliales C.P.A.
• Macrófagos Moduladores
• Linfocitos: TCD4 Perpetuación
Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamatio nFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.
Marcadores de superficie que se Marcadores de superficie que se encuentran alterados en EIIencuentran alterados en EII
CD - 16 Receptor de IgG (Fcγγγγ RIII)
HLA - DR Se expresan en: • Linf. B• Monocitos
• Macrófago
• Céls. dendítricas
Mahida YR et al. Gut.1989;30:826-34Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Academic Publishers 1999 pps.:111-113
Permeabilidad epitelial incrementada y desarrollo de inflamación crónica intestinal mediada por linfocit os T activados por citocinas TNF α, INFγ.
“Expresión de HLA-DR y CD16 en Macrófagos intestinales de pacientes con Enfermedad Inflamatoria Intestinal”
Dr. Fernando Kawaguchi P.Dr. Oscar Venegas R.TM MsC Juan Luis Castillo N.TM MsC Marcelo Castillo N.Dr. Jaime Madariaga B.
Fono: 402138 / 329454 / 09-8463346Email: juanlcastillo@entelchile.net/ labcitometria@entelchile.net
www.citometria.co.cl / www.oncoinmun.co.cl
• Determinar mediante CF, el porcentaje de MI que expresan la molécula HLA-DR y/o CD16 en pacientes con EII y con mucosa intestinal normal.
• Establecer si el fenotipo de MI HLA-DR(+), CD16(+), permite diferenciar pacientes con EII de aquellos sin EII.
• Cálculo de especificidad, sensibilidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y valor global.
Objetivos
�� Estudio de corte analítico con grupo testigo, Estudio de corte analítico con grupo testigo,
doble ciego.doble ciego.
�� Pacientes atendidos en Unidad de Pacientes atendidos en Unidad de
Gastroenterología, Hospital del Trabajador, Gastroenterología, Hospital del Trabajador,
Concepción, Chile.Concepción, Chile.
�� Consentimiento informadoConsentimiento informado
Método
�� Expresión HLAExpresión HLA --DR y CD16 Concordante con DR y CD16 Concordante con EII según EII según RoglerRogler G. et al. (G. et al. ( EurEur J J GastroenterolGastroenterolHepatolHepatol 1997;9:8931997;9:893 --9)9)
�� MI definidos en función CD33(+), CD3(MI definidos en función CD33(+), CD3( --)/CD19 )/CD19 ((--))
�� Anticuerpos:(Anticuerpos:( BectonBecton DickinsonDickinson ))�� CD33CD33--PEPE
�� HLAHLA --DRDR--FITCFITC
�� CD16CD16--FITCFITC
�� Análisis estadístico: Análisis estadístico: Chi Cuadrado con corrección Chi Cuadrado con corrección
de Yates, de Yates, testtest de de FischerFischer p < 0.05p < 0.05
Método
�� Existen diferencias significativas (p<0.05) Existen diferencias significativas (p<0.05) en los fenotipos de MI entre pacientes con en los fenotipos de MI entre pacientes con EII y pacientes sin EII.EII y pacientes sin EII.
�� En MI, el fenotipo HLAEn MI, el fenotipo HLA --DR(+) se expresa DR(+) se expresa en mayor porcentaje en pacientes con EII en mayor porcentaje en pacientes con EII (p<0.001).(p<0.001).
�� En MI, el fenotipo CD16(+) se expresa en En MI, el fenotipo CD16(+) se expresa en mayor porcentaje en pacientes con mayor porcentaje en pacientes con cuadros concordantes con EII, clcuadros concordantes con EII, cl íínica y nica y endoscendosc óópicamentepicamente activos. activos.
Conclusiones
El estudio inmunofenotípico de Macrófagos Intest. demuestra ser un examen eficiente para diferenciar pacientes con EII de aquellos sin EII.
Conclusiones
Mahida YR et al. Gut.1989;30:826-34
Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Acad. Publishers 1999 pps.:111-113
Mucosa
• HLA-DR• CD16
• CD54
• CD25
• CD68• CD80, CD86• CD11b
Normal
20-30%Ausente
7%
Ausente
AusenteAusente
5%
EII
PresentePresente
C.U. 70%Crohn 46%
C.U. PresenteCrohn ausente
PresentePresentePresente
Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales (Histológicamente normales)
> 5 %> 30 %Inflamación crónica activaInflamación crónica activa
< 5 %> 30 %Inflamación crónica con Inflamación crónica con escasa actividadescasa actividad
> 5 %< 30 %Inflamación AgudaInflamación Aguda
< 5 %< 30 %NormalidadNormalidad
CD16HLA-DRSituaciónSituación
Alteraciones del Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales
Ejemplo de Macrófagos Intestinales
Conclusiones:
• Existe una clara relación entre el fenotipo de macrófagos intestinales crónicamente activos con la severidad clínica de la EII.
• El estudio fenotópico de M.I. crónicamente activos (HLA-DR+/CD16+) podría ser una herramienta eficaz para la categorización clínica de los pctes. con EII.
ζζζζCD3 CHAINS EXPRESION IN PERIPHEREAL T LYMPHOCYTES OF PATIENTS WITH
ADENOMATOUS POLYPS OF THE COLON
(*) Castillo JL 2, Kawaguchi F.1,2, Venegas O.1,2, Castillo M.1,2, Madariaga J.1,2, Ortiz C2 ,
Riquelme F.2, Yañez CG.2, Vega E.2,.
(1) Medicine Faculty, University of Concepción, Chile. (2) Flow Cytometry and Gastroenterology Unit,
Worker Hospital, Concepción, Chile.
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
• Total T lymphocytes :CD3(+)
• T Helper lymphocytes :CD3(+)CD4(+)
• T citotoxic lymphocytes :CD3(+)CD8(+)
• B lymphocytes :CD3(-)CD19(+)
• Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)
• T CD4/CD8 ratio
ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous
polyps of the colon
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
ANTIGEN/MHCANTIGEN/MHC
CD4CD4
TCR/CD3TCR/CD3
LckLck
ZAPZAP--7070
PTK PTK SrcSrcζζζζζζζζ CHAINSCHAINS
• Low ζζζζCD3 expression in:• Colon cancer • Prostate cancer • Renal cells cancer
• Related:• Disease stages • Prognosis• Death
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
• Matsuda M. et al . Int. J. Cancer:61,765-772 (1995).• Healy C. et al . Cytometry32:109-119 (1998).
ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
• It has been proposed that thedetermination of ζζζζCD3 expresion y tumoral and peripheral T lymphocytes, may be a neoplastic disease progresionmarker.
Matsuda M. et al . Int. J. Cancer:61,765-772 (1995).Healy C. et al . Cytometry32:109-119 (1998).Nakagomi H. et al. Cancer Research53, 5610-12,1993.
ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
Objetive: Evaluate the expression of ζζζζCD3 chains in periphereal T lymphocytes by flow cytometry in patients with colon polyps
Patients: 24 reference subjects 19 Patients with adenomatous polips of the colon (APC) 10 Patients with hiperplasic polyps (HP) 5 Patients with recurrent oral thrush (ROT)
Sample type: Periphereal blood
ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
% LT ζζζζ(+)
% LCD4 ζζζζ(+)
% LCD8 ζζζζ(+)
Controln = 24
APCn = 19
HPn = 10
87.291 19.558(P=0.000)
72.948(P=1.000)
87.01987.01987.01987.019 16.404(p=0.000)
77.726(p=1.000)
87.823 17.903(p=0.000)
69.601(p=1.000)
88.640(p=1.000)
88.814(p=1.000)
90.601(p=1.000)
ROTn = 5
Percentage ofζζζζCD3 expression in T lymphocytes. p<0.05
ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
Conclusion:
ζζζζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
1) The diminution of ζζζζCD3 expression is related with the APC in patients without antecedents of any
others neoplasia.
2) There are significant differences in ζζζζCD3 expression between the APC and HP groups (p<0.05).
3) The diminution of ζζζζCD3 in periphery may be suggestive of the APC in absence of any others
neoplasia.
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
3
123
89
18
0
154
80
101
12
171
36
119
8
45
7
31
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
2003 2004 2005 2006
AÑO
Nº Examenes Citometría de Flujo: Inmunopatología
Observación. Linfoma
Macrófagos Intestinales
Ciclo celular
Macrófagos + Ciclo celular
5
8
4
9
1
11
1
5
3
2
0 0
0
2
4
6
8
10
12
2005 2006
AÑO
Nº Examenes Citometría de Flujo: Pacientes con 2 o más controles
Subpoblaciones
Estallido Respiratorio
Subpoblaciones + estallidorespiratorior
Macrófagos intestinalesr
Ciclo celular
Macrófagos intestinales + Ciclocelular
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Espectro de presentación
Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn
Alteración de la inmunoregulaciónde mucosa intestinal
Inflamación persistente y/o recurrente
Congestión ulcerativa Granulomatosa
¿Cáncer? …..2006
www.oncoinmun.co.cl
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