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EFECTO NEUROPROTECTOR DE LA PROTEINA C ACTIVADA ANTE LA APOPTOSIS
INDUCIDA POR C2-CERAMIDA EN CÉLULAS CAD: ACTIVACIÓN DE LA VIA PI3K-AKT
Maria Helena Camargo Jimenez
Trabajo de grado presentado como requisito
para optar al título de Maestría en Bioquímica.
Directores del Proyecto:
Dr. Gonzalo H. Arboleda B. MD, MSc, Ph.D.
Dra. Luisa M. Matheus. MSc, Ph.D.
Departamento de Ciencias Fisiológicas
Facultad de Medicina
Universidad Nacional de Colombia.
2010
2
EFECTO NEUROPROTECTOR DE LA PROTEINA C ACTIVADA ANTE LA APOPTOSIS
INDUCIDA POR C2-CERAMIDA EN CÉLULAS CAD: ACTIVACIÓN DE LA VIA PI3K-AKT
Directores del Proyecto:
Dr. Gonzalo H. Arboleda B. MD, MSc, Ph.D.
_____________________________________.
Dra. Luisa M. Matheus. MSc, Ph.D.
_________________________________.
Departamento de Ciencias Fisiológicas
Facultad de Medicina
Universidad Nacional de Colombia.
Segundo Semestre 2010
3
RESUMEN
Efecto Neuroprotector de la Proteína C Activada ante la Apoptosis inducida por C2-
ceramida en celulas CAD: activación de la vía PI3K-AKT.
La enfermedad de parkinson está caracterizada por apoptosis de neuronas dopaminérgicas,
la ceramida esta implicada en este evento apoptótico. La Proteína C Activada (PCA)
presenta un efecto antiapoptótico en células neuronales primarias murinas y disminuye la
perdida neuronal en conejos con daño isquémico induciendo un aumento en la fosforilación
de la proteína de supervivencia AKT. Esta investigación tiene el propósito de evaluar el
efecto antiapoptótico de PCA en células neuronales dopaminérgicas CAD ante la
exposición a C2-ceramida y la mediación de la vía PI3K-AKT en este proceso. Las células
fueron diferenciadas por cuatro días en ausencia de suero fetal bovino, se aplico PCA (100
nM, 12 horas) y luego C2-ceramida (25 uM, 6 horas) se determino la viabilidad mediante el
ensayo de MTT, la apoptosis mediante el ensayo de la actividad enzimática de la Caspasa-3
y la condensación del ADN por tinción de Hoechst, la detección de la fosforilación de AKT
se realizo mediante Western blot empleando quimioluminiscencia. Los resultados
demuestran que el pretratamiento con PCA aumenta la viabilidad, disminuye la actividad
de caspasa-3 y aumenta la fosforilación de AKT en células tratadas con C2-ceramida,
sugiriendo disminución de apoptosis mediante activación de la vía PI3K-AKT.
Palabras claves: apoptosis, proteina C activada, receptor activado por proteasa (PAR),
receptor endotelial de la proteína C (EPCR), ceramida, caspasas, fosfatidilinositol 3-cinasa
(PI3K), proteína AKT.
ABSTRACT
Neuroprotector effect of Activated Protein C against Apoptosis induced by C2-ceramide
in CAD cells: activation of PI3K-AKT pathway.
Parkinson disease is characterized by apoptosis in dopaminergic neurons. Ceramide is
involved in this apoptotic event. Protein C (PCA) prevents apoptosis in primary murine
neuronal cells and decreases neuronal loss in rabbits with ischemic damage by inducing an
increase in phosphorylation of AKT, an survival protein. This research aims to assess the
antiapoptotic effect of PCA in dopaminegic neuronal cells CAD against exposure to C2-
ceramide and implication of PCA in PI3K-AKT pathway. Cells were differentiated by four
days without Phoetal Bovine Serum; They were treated with PCA (100 nM, 12 hours) and
then C2-ceramide (25 uM, 6 hours); Viability was determinated by MTT; Apoptosis was
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tested by Caspase-3 activity assay and DNA condensation by Hoechst stain.
Phosphorylated AKT was detected by Western blot. The results demonstrated pre-
treatment with PCA increases the viability, reduces the activity of Caspase-3 and increases
the phosphorylation of AKT cells treated with C2-ceramida, suggesting an decrease in
apoptosis through activation of PI3K-AKT pathway.
Key Words: apoptosis, activated protein C, protease-activated receptor (PAR), endothelial protein C receptor (EPCR), ceramide, caspases, phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K), AKT protein.
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1 Introducción.
Se ha encontrado que la proteína C activada (PCA) disminuye la apoptosis inducida por
estaurosporina en células endoteliales EAhy926, efecto en el cual están implicados el
receptor endotelial de la proteína C (EPCR) y el receptor 1 activado por proteasa (PAR1)
(1). En células neuronales primarias murinas PCA disminuye la apoptosis inducida por N-
metil-D-ácido aspártico (NMDA). Este efecto antiapoptótico está asociado a la presencia
de receptores PAR1 y PAR3 (2). Sin embargo, es escasa la investigación acerca del
mecanismo molecular implicado en la protección antiapoptótica mediada por PCA,
particularmente en células neuronales. En neuronas primarias de ratón tratadas con
NMDA y posteriormente con PCA se observa una disminución en el porcentaje de células
apoptóticas, efecto que está asociado con la disminución en la actividad de Caspasa-3,
disminución de los niveles proteicos y de ARNm de p53, y la restitución de los niveles
basales de la proteína antiapoptótica Bcl-2 (2). Adicionalmente PCA está implicada en la
disminución de pérdida neuronal en conejos con daño isquémico, asociado a aumento en
la fosforilación de la proteína AKT (proteína cinasa B) (3), un mediador de supervivencia
celular.
La presente investigación tiene el propósito de evaluar el posible efecto antiapoptótico de
PCA en células neuronales dopaminérgicas ante la exposición a C2-ceramida y la posible
mediación de la vía de supervivencia AKT en este proceso.
2 Hipótesis del proyecto de investigación.
La PCA inhibe la apoptosis inducida por C2-ceramida en células neuronales
dopaminérgicas murinas CAD mediante la activación de la vía de supervivencia PI3K/AKT.
3 MARCO TEÓRICO.
3.1 Apoptosis
3.1.1 Generalidades
La apoptosis es uno de los mecanismos de muerte celular, ocurre durante el desarrollo, el
envejecimiento, en reacciones inmunes o por agentes tóxicos o nocivos tales como
algunos medicamentos para el tratamiento del cáncer, algunas hormonas tales como
corticosteroides y radiación ultravioleta (4).
6
Existen dos vías apoptóticas: la extrínseca, que involucra receptores de muerte, y la
intrínseca, en la cual las señales intracelulares no son mediadas por receptores e inician en
la mitocondria. La vía extrínseca inicia con los receptores de la familia del factor de
necrosis tumoral (TNF) (5), denominados receptores de muerte, incluyendo FasR, TNFR1,
DR3 y sus respectivos ligandos FasL, TNFα y Apo3L entre otros (6); posteriormente a la
interacción ligando-receptor se unen las proteínas adaptadoras entre ellas FADD (para
interacción entre FasR/FasL) y TRADD (para interacción entre TNFα/TNFR1) (7), (8), esta
última proteína adaptadora se une a procaspasa 8 , la cual se activa por autocatalisis (9).
La caspasa 8 media el clivaje de Bid, la cual en el estado clivado se transloca a la
mitocondria en donde promueve la salida de citocromo C (10).
La vía intrínseca es regulada por las proteínas antiapoptóticas y proapoptóticas de la
familia Bcl-2, las cuales están implicadas en la finalización o en la continuación de los
eventos apoptóticos. Uno de los principales reguladores de la vía intrínseca es la proteína
supresora de tumor P53, la cual controla la transcripción de genes de la familia Bcl-2,
incluyendo Bax, una proteína promotora de apoptosis, e inhibe los niveles de Bcl-2 (11). La
proteína Bad, una proteína inductora de apoptosis, en estado defosforilado se transloca a
la mitocondria para inducir la liberación del citocromo C (12). Además Bad se
heterodimeriza con Bcl-XL ó Bcl-2, inhibiendo el efecto antiapoptótico de estas dos
proteínas (13), las cuales están implicadas en la inhibición de la liberación del citocromo C.
Bcl-XL y Bcl-2 han sido además involucradas en la regulación de la activación de caspasas
(14).
Las vías extrínseca e intrínseca convergen en el evento de activación de caspasa-3, la cual
es activada por cualquiera de las caspasas iniciadoras entre ellas caspasa-8, caspasa-9 ó
caspasa-10. La caspasa-3 induce la reorganización del citoesqueleto y la formación de
cuerpos apoptóticos (4), activa a la endonucleasa CAD, la cual cliva el ADN cromosomal y
causa la condensación de la cromatina (15).
La apoptosis se puede distinguir de otros de tipos de muerte mediante la identificación de
características morfológicas y bioquímicas. Los cambios morfológicos incluyen formación
de estructuras globulares en la membrana plasmática, condensación de la cromatina,
fragmentación del ADN y formación de cuerpos apoptóticos (16). Las características
bioquímicas que permiten determinar la apoptosis celular incluyen cambios en la cinética
de exposición de fosfatidilserina (PS) en la superficie externa de la membrana plasmática,
cambios de la permeabilidad de la membrana mitocondrial (17), liberación de proteínas
intermembranales de la mitocondria (18) y translocación al núcleo de una ADNasa
activada por caspasa, la cual cliva el ADN internucleosomal (19) y finalmente pérdida de la
integridad de membrana plasmática (17).
7
3.1.2 Métodos de Detección
Diferentes métodos para el análisis de la morfología celular apoptótica son utilizados,
entre ellos citometría de flujo que permite analizar el tamaño celular, la granulidad y las
células que adquieren los diferentes colorantes fluorescentes, los cuales permiten
determinar características tales como integridad de membrana y presencia de marcadores
de apoptosis en la superficie de la membrana celular (20).
La fosfatidilserina (PS), un aminofosfolípido de la superficie interna de la membrana
plasmática de células viables es expuesto en la superficie externa de la membrana al inicio
de la apoptosis (21), PS es detectado mediante anexina V, una proteína que se une a
fosfolípidos, conjugada con moléculas fluorescentes (22).
Uno de los eventos apoptóticos es el clivaje del ADN en fragmentos de 180 a 200 pares de
bases, que mediante un análisis de electroforesis en gel de agarosa se obtiene un patrón
de segmentos en forma de escalera (23).
La detección de la actividad de las caspasas se realiza mediante análisis de western blot,
utilizando anticuerpos contra las subunidades p20 y p10 (24), las cuales incluyen los
residuos de aminoácidos para el reconocimiento del sustrato y para la actividad catalítica
(25). Otro método para el análisis de la activación de las caspasas se realiza mediante la
determinación de la actividad enzimática empleando sustratos fluorogénicos, los cuales
están constituidos por los aminoácidos que corresponden al sitio de clivaje del sustrato
natural que consiste de una secuencia de 4 aminoácidos con un aspartato unido a 7-
amino-4-metilcoumarina (AMC); la hidrólisis del sitio de clivaje libera el AMC que genera
fluorescencia lo cual es detectado por fluorometría (25).
3.2 Proteina C activada.
3.2.1 Generalidades
La proteína C activada (PCA) es una proteasa del plasma, con actividad anticoagulante (26)
y citoprotectora (2), la cual es generada por clivaje de la forma enzimáticamente inactiva
conocida como proteína C (PC) (27). Las concentraciones plasmáticas de PC y PCA son de
70 nM y 40 pM, respectivamente (28).
La PCA es una proteína constituida por 419 aminoácidos, presenta varias modificaciones
post-traduccionales tales como N- glicosilación en los residuos localizados en las
posiciones 97, 248, 313 y 329, β- hidroxilación en asparagina 71 y gamma-carboxilación de
nueve residuos de ácido glutámico en el extremo N- terminal para generar nueve residuos
Gla (dominio Gla). La PCA presenta varios dominios: dominio Gla (residuos 1-37), dos
8
regiones similares al factor de crecimiento epidermal-1 (EGF-1: residuos 46-92) y EGF-2
(residuos 93-136), el dominio de activación (residuos 158-169) y el dominio de actividad
proteasa (residuos 170-419) (29).
La activación de la PC es realizada por la proteína trombina (T) que cliva y modifica a la PC
en el segmento comprendido entre arginina de la posición 169 y leucina de la posición 170
(27). Esta activación es promovida por dos receptores integrales de membrana:
trombomodulina (TM) y el receptor endotelial de la proteína C (EPCR) (30). La activación
de la PC por trombina es una reacción que depende de la presencia de calcio (31). La
disociación entre PCA y EPCR inicia la vía anticoagulante (32). Cuando PCA permanece
unido al receptor EPCR se inducen vías de señalización intracelular (2).
3.2.2 Receptores EPCR
El receptor EPCR es una glicoproteína transmembranal que presenta una homología
estructural con las proteínas de la familia del complejo mayor de histocompatibilidad clase
I (CD1) (33). EPCR presenta dos α-hélices y una hoja β con 8 plegamientos, las α-hélices y
la hoja β forman un surco el cual contiene un fosfolípido que mantiene la interacción de la
PC ó PCA con EPCR, lo cual posiblemente esté relacionado con el mantenimiento de la
estructura de EPCR (34). EPCR es expresada en la superficie de celulas endoteliales (35),
principalmente en grandes vasos sanguíneos y en capilares (36). En células endoteliales la
aplicación de anticuerpos que impiden la unión de PC y EPCR causan una disminución en
la activación de proteína C inducida mediante el complejo T-TM respecto a las células
tratadas con un anticuerpos que no afectan la interacción (37). Adicionalmente, EPCR y
TM incluidos dentro de vesículas de fosfatidilcolina, promueven un aumento en la
activación de PCA dependiente de la concentración de EPCR (38), lo que evidencia la
función de EPCR en la activación de PC.
3.2.3 Receptores PAR
Los receptores PAR son una familia de receptores acoplados a proteína G, que median
señalización celular en respuesta a proteasas que los activan a través de clivaje (39); este
clivaje se realiza en el dominio N-terminal (40). Un estudio in vitro sobre clivaje del
receptor PAR1 indica que el clivaje de los receptores PAR es realizado principalmente por
trombina (41). PAR1 Y PAR2 son expresados en epitelio bronquial (42); el ARNm de PAR2
ha sido detectado en tejido renal, pancreático, hepático entre otros (43), además es
expresado en el endotelio vascular (44). La expresión de ARNm para el receptor PAR3
también fue evaluada en diferentes tejidos humanos encontrándose en celulas hepáticas,
coronarias, pancreáticas y en tráquea y en tejidos de ratón en los cuales se detectó en
únicamente bazo (45). PAR1, PAR2, PAR3 y PAR4 son expresados en tejido nervioso
9
central (46), además PAR1 y PAR2 han sido localizados en endotelio de capilares del
cerebro (47).
Se ha asociado la presencia de los receptores PAR a la protección promovida por la PCA
frente a apoptosis en células neuronales y endoteliales (1) (2). PAR1 ha sido implicado en
la inhibición de hemorragia mediada por PCA en endotelio de cerebro isquémico de
ratones a los que se les ha tratado con activador plasminogénico de tejido utilizado en
terapia como trombolítico (40). Adicionalmente PAR1 es requerido para
neurovascularización determinada por el aumento de la cantidad de celulas progenitoras
neuronales y neuroblastos inducida por PCA en tejido neuronal isquémico (48).
3.2.4 Actividades de PCA
PCA disminuye la disrupción de la membrana de las células endoteliales inducida por
trombina, efecto en el que está implicado Rac1 (49), el cual es un miembro de la familia de
GTP-asas vinculado con la organización de la actina (50). Por otra parte, PCA está
implicada en la activación de las metaloproteinasas de la matriz endotelial (MMP)-2 (51),
las cuales están involucradas en la regulación del remodelamiento de la matriz
extracelular (52). En queratinocitos humanos PCA está implicada en la proliferación
celular, migración y actividad de la MMP-2 (53). Adicionalmente PCA promueve la
cicatrización de heridas de la piel promoviendo la angiogénesis y la prevención de la
inflamación (54).
3.2.4.1 Actividad anticoagulante
La vía mediante la cual se regula la coagulación sanguínea inicia a través de la acción del
factor de tejido (TF), el cual forma un complejo con el factor de circulación VIIa (FVIIa)
(55). El complejo TF-FVIIa activa los factores IX (FIX) y X (FX); los factores activos FIXa y FXa
forman complejo con FVIIIa y FVa, respectivamente, en la membrana de las plaquetas
(56). El complejo FXa-FVa convierte a la protrombina en trombina, mientras que el
complejo FIXa-FVIIIa activa a FX adicionalmente a la activación inicial promovida por el
complejo TF-FVIIa. Trombina induce activación de FV, FVIII y del FXIII el cual es una
transglutaminasa que promueve el entrecruzamiento de la fibrina (57).
La actividad anticoagulante de PCA implica el clivaje proteolítico de FVIIIa y FVa, el cual es
promovido por los cofactores proteína S y FV no activo. El clivaje de FVIIIa se efectúa
mediante acción sinergística de los cofactores S y FV, y el clivaje de FVa, mediante la
proteína S (58).
10
3.2.4.2 Actividad Antiinflamatoria
La PCA previene el daño del tejido vascular pulmonar inducido por LPS mediante la
inhibición de la producción de Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α) (59), el cual favorece
el desarrollo de coagulación intravascular diseminada y otras fallas de órganos en sepsis
(60). Por otra parte el factor nuclear de transcripción NF-KB está implicado en la
producción de las citocinas proinflamatorias incluyendo TNF-α (61). PCA inhibe la
producción de TNF-α inducida por LPS mediante inhibición de la translocación de NF-KB al
núcleo en monocitos THP-1 (62). Adicionalmente, PCA inhibe la producción de otras
citocinas proinflamatorias promovidas por LPS tales como interleucina-1β (IL-1β),
interleucina-6 (IL-6), e interleucina-8 (IL-8) en células en monocitos THP-1 (63). PC y PCA
también están implicadas en la inhibición de la respuesta migratoria de linfocitos inducida
por IL-8, RANTES y S1P, mediante mecanismos que implican al receptor EPCR (64).
3.2.4.3 Actividad Antiapoptótica
La PCA induce un efecto antiapoptótico frente a apoptosis inducida por NMDA en células
neuronales primarias de ratón, en donde se encuentran implicados los receptores PAR1 Y
PAR3. Este efecto está asociado con la disminución en la actividad de Caspasa-3,
disminución de los niveles proteicos y de mRNA de p53, y el restablecimiento de los
niveles basales de la proteína antiapoptótica Bcl-2 (2) (65). La PCA en células endoteliales
EAhy926 también induce inhibición de apoptosis inducida por estaurosporina mediada por
los receptores PAR1 y EPCR (1). Por otro lado, la PCA regula negativamente la síntesis y la
secreción de la proteína proapoptótica TRAIL inducida por tratamiento con TNFα, e induce
la expresión de ARNm para EGR-1 (66), el cual regula negativamente a TRAIL (67).
3.2.4.4 PCA y neuroprotección
Diferentes estudios muestran que PCA presenta efectos antiapoptóticos en el endotelio
cerebral (65) y en neuronas (68). Adicionalmente PCA inhibe la apoptosis de células del
hipocampo y de la materia blanca de ratas neonatales inducidas a hipoxia (69) y en
cerebro isquémico (65).
3.3 Proteína AKT
3.3.1 Generalidades
La proteína AKT (proteína cinasa B) es una cinasa de serina/treonina. Se han identificado
tres isoformas de la proteína AKT: PKBα (70), PKBβ (71) y PKBγ (72). La estructura de las
isoformas consiste de un dominio de homología a plecstrina (PH) localizado en la región
11
amino terminal, un dominio catalítico localizado en la región central y un motivo
hidrofóbico localizado en la región carboxilo terminal (73). El dominio PH consiste de
aproximadamente 100 aminoácidos, se une a los fosfolípidos de la membrana celular
fosfatidilinositol-(3,4)-bifosfato (PIP2) y a fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifosfato (PIP3) (74) con
constantes de disociación (Kd) de 0.57 µM y 0.4 µM respectivamente, indicando mayor
afinidad por PIP3 que por PIP2 (75). El dominio catalítico presenta un residuo de treonina
en la posición 308 (Thr 308) que está implicado en la activación de AKT y el dominio
carboxilo terminal presenta un residuo de serina en la posición 473 (Ser 473). La
fosforilación de ambos residuos, Thr 308 y Ser 473, genera la activación de AKT (76)
El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) activa a fosfatidilinositol 3-cinasa
(PI3K) (77), la enzima que convierte PIP2 en PIP3 (78). AKT es activado por tratamiento de
células con PDGF (77), factor de crecimiento epidermal (EGF) (79) ó Insulina (80). El
pretratamiento de células con inhibidores de PI 3-cinasa, wortmannina o LY 294002,
inhibe la activación de AKT inducida por Insulina ó factores de crecimiento (79), mientras
que la expresión de PI 3-cinasa activada constitutivamente induce la activación de AKTα
(81). Estas evidencias asocian la activación de AKT con la activación de PI 3-cinasa. Ensayos
in vitro definen que la actividad de PI 3-cinasa es necesaria para la translocación de AKT a
la membrana celular en donde es fosforilada en Thr 308 y Ser 473 (82). La cinasa
dependiente de fosfatidilinositoles (PDK1), fosforila a AKTα en Thr308 y PDK2 a la Ser 473
(83).
3.3.2 AKT y Apoptosis
AKT promueve la supervivencia celular por inhibición de apoptosis (84) y regula de manera
directa varias proteínas involucradas en apoptosis como Bad, una proteína inductora de
apoptosis (85), la cual es fosforilada por AKT en un residuo de serina en la posición 136, y
esta fosforilación está asociada con inhibición de apoptosis inducida por Bad (86). Bad
fosforilado se une a la proteína 14-3-3 en el citoplasma mientras que Bad no fosforilado se
une a Bcl-xL, inhibiendo el efecto antiapoptótico de esta proteína (12). La caspasa-9
humana, una proteína que también promueve apoptosis (4), y que es fosforilada in vitro
por AKT en un residuo serina en la posición 196, inhibiendo su actividad proteasa (87).
3.4 Ceramida
3.4.1 Generalidades
La ceramida, una molécula lipídica implicada en diferentes funciones celulares (88), está
constituida por una cadena amino alcohol unida covalentemente a un acido graso de
variable longitud por medio de una unión amida. Las ceramidas celulares presentan
12
diferentes longitudes del ácido graso que puede ser de 16,18 ó 20 carbonos y se conocen
como C16, C18 ó C20-ceramidas, las ceramidas sintetizadas, no celulares, presentan
cadenas de acido graso de longitud corta entre ellas C2, C4, C6 y C8 ceramidas (89).
La Ceramida es sintetizada en la superficie citosólica del retículo endoplásmico (90)
mediante condensación de serina y palmitoil-CoA a través de la enzima
palmitoiltransferasa generándose 3-dehidrosfinganina la cual es reducida a D-eritro-
esfinganina por acción de la enzima D-3-dehydrosphinganina óxidoreductasa. Este
intermediario es modificado para producir esfingosina o dihidroxiceramida; esta última
molécula es generada mediante la acción de la enzima esfinganina N-aciltransferasa. La
cadena alcohol de la dihidroxiceramida se une al ácido graso mediante una amida
generándose ceramida (91). Además de la vía mencionada la ceramida puede se
sintetizada mediante el catabolismo de esfingomielina por acción de esfingomielinasas
(SMase) (92).
3.4.2 Ceramida y Apoptosis
Ceramida induce inactivación de la proteína anti-apoptótica Bcl2 (93), aumento de la
actividad de la proteína fosfatasa activada por ceramida (CAPP), y aumento de la actividad
de la proteína cinasa activada por ceramida (CAPK) (94); esta última es un supresor de Ras
una proteína implicada en la activación de Raf-1 (95), Raf-1 activa por fosforilación a
proteínas cinasas MEK1, las cuales a su vez activan a proteínas ERK mediante fosforilación
(96). Además, la ceramida está implicada en la formación de canales en la membrana
mitocondrial (97), en la liberación de citocromo c mitocondrial (98) y en el aumento de los
niveles basales de calcio mitocondrial (99), (100).
La ceramida está implicada en la translocación a la membrana celular y en la fosforilación
de AKT, en los residuos Thr 308 y Ser 473 inducida por Insulina en preadipocitos 3T3-L1
(101) y disminuye la actividad enzimática de AKT en neuronas corticales de rata (102). En
células de endotelio de cerebro la disminución de la actividad de AKT por acción de
ceramida está asociada al aumento de la actividad de PP2A (103), una fosfatasa que regula
la actividad de proteínas cinasa, entre ellas AKT (104). La ceramida inhibe la activación de
AKT en células musculares L6 tratadas con insulina por inhibición de la unión de AKT a la
membrana celular aunque la insulina promueva el aumento de PIP3 celular (105). La
ceramida induce activación de PKCζ, la cual en estado activado fosforila un residuo
treonina en la posición 34 del dominio PH de AKT, y esto se asocia con una pérdida de la
unión entre el dominio PH de AKT y PIP3 in vitro (106). Treonina en posición 34 esta
localizada dentro del dominio PH de AKT, ubicado corriente abajo de arginina 25 y arginina
23 los cuales interaccionan con PIP3 (107). La ceramida está implicada en la inhibición de
la glicólisis promovida por factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1) en
13
células de origen mesencefálico CAD (108). Adicionalmente, la ceramida disminuye la
fosforilación de proteínas proapoptóticas FDHR, GSK-3β y BAD respecto a los niveles
basales en neuronas corticales de rata (102). Estas proteínas son sustratos de AKT, los
cuales son inactivados mediante fosforilación (109), (110), (111). Por otra parte, la
apoptosis inducida por la ceramida está vinculada con activación de la vía de señalización
SAPK/c-Jun (proteína cinasa activada por estrés/ cinasa N-terminal c-Jun) en células de
leucemia monoblástica humana U937 (112).
3.4.3 Ceramida y Neurodegeneración
La ceramida está asociada con apoptosis en células neuronales (113) y está implicada en
varias condiciones neurodegenerativas tales como Alzheimer (114) y Parkinson (115). El
tratamiento de oligodendrocitos con amiloide β (Aβ), un péptido asociado a la
enfermedad de Alzheimer (116), aumenta los niveles celulares de ceramida y la actividad
de la esfingomielinasa neutral (nSMase) (117), la enzima que cataliza la hidrólisis de la
esfingomielina para generar la ceramida (118). Ensayos en células neuronales primarias
murinas muestran que PCA induce un efecto antiapoptótico frente a NMDA (2), esto
plantea la posibilidad de emplear a PCA en el tratamiento de patologías asociadas con
apoptosis mediada por ceramida.
El efecto de PCA humana recombinante, drotrecogin-α, fue ensayada en ratones con
isquemia, una condición patológica en la que se presenta disfunción endotelial, daño
cerebral e hipoxia (119), inducida por oclusión de la arteria cerebral, se observo una
disminución del edema cerebral, del volumen de la lesión y de los defectos en la
locomoción frente a los ratones con isquemia, no tratados con PCA (120). Estos resultados
demuestran el papel de la PCA en la disminución de daños neuronales, y se hace
importante evaluar su efecto en otros modelos de enfermedades neurodegenerativas.
4 Justificación
La enfermedad de Parkinson (EP) está caracterizada por apoptosis de neuronas
dopaminérgicas del mesencéfalo. La línea celular CAD empleada en el presente estudio y
su tratamiento con C2- ceramida representan un modelo in vitro para la investigación en
la EP y las posibles terapias para su tratamiento. Los antecedentes mencionados sugieren
a la PCA como un potencial tratamiento para prevenir y posiblemente detener la muerte
celular apoptótica en individuos afectados por esta enfermedad.
14
5 OBJETIVOS
5.1 General
Determinar el efecto de PCA sobre la apoptosis inducida por C2-Ceramida en células CAD.
5.2 Específicos
1. Determinar los niveles de expresión de ARNm para los receptores PAR-1, PAR-3 Y
EPCR en células CAD.
2. Determinar el efecto de PCA en la viabilidad de células CAD ante la exposición a
C2-Ceramida.
3. Determinar el efecto de PCA en la apoptosis de células CAD expuestas a C2-
ceramida.
4. Determinar el efecto de PCA sobre la fosforilación de AKT en células CAD tratadas
con C2-Ceramida.
6 MATERIALES Y METODOS
6.1 Materiales y Reactivos
6.1.1 Reactivos
Para la inducción de apoptosis se empleó C2-ceramida (N-Acetil-D-esfingosina-Sigma). C2-
ceramida es un análogo de las ceramidas celulares, permeable a la membrana celular por
lo cual es utilizado frecuentemente en ensayos in vitro (121).
Los cambios en la apoptosis fueron evaluados mediante la aplicación de Proteína C
activada purificada de plasma humano (Sigma).
6.1.2 Modelo celular
Se empleó la línea celular murina catecolaminérgica CAD (expresa L-DOPA un precursor de
dopamina y TH) derivada de células Cath.a, provenientes de células de sistema nervioso
central de ratón transformadas por el oncogén SV40 T el cual no se encuentra presente en
células CAD. Las células CAD presentan diferenciación por deprivación de suero debido a
la ausencia de factores de proliferación celular. Tanto las células diferenciadas como las
no diferenciadas expresan proteínas neuronales entre ellas GAP-43, SNAP-25 y
sinaptotagmina (122).
15
6.2 Metodología
6.2.1 Cultivo de células CAD
Las células CAD se sembraron en una de caja de cultivo de 75 cm2 con medio de cultivo D-
MEM F12 HAM (Gibco) con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-
estreptomicina y 0.1% de glutamina a una temperatura de 37 °C y con 5% de CO2 hasta
alcanzar confluencia.
Para la diferenciación, las células CAD se sembraron a una confluencia de 80% en una caja
de cultivo de 75 cm2 con medio de cultivo D-MEM F12 HAM en ausencia de FBS, 1% de
penicilina-estreptomicina, 0.1% de Glutamina y 50 ng/ml de selenita de sodio a una
temperatura de 37°C y con 5% de CO2 durante 4 días (Protocolo implementado por el Lab.
de Neurociencias Unal).
6.2.2 Determinación de la expresión de receptores EPCR PAR1 y PAR3 en células CAD.
La evaluación de la expresión del ARNm para los receptores EPCR, PAR1 Y PAR3 tiene el
propósito de caracterizar las células CAD diferenciadas y no diferenciadas respecto a la
expresión de estos receptores, esto permitió seleccionar el modelo celular (células
diferenciadas ó no diferenciadas) que se utilizó en los diferentes ensayos. Los niveles de
ARNm se determinaron mediante RT-PCR semicuantitativa, este método permite la
cuantificación relativa del ARNm de los receptores mediante comparación con la cantidad
de ARNm para el gen GAPDH utilizado como referencia.
6.2.2.1 Extracción de ARN con trizol
Las células diferenciadas y las no diferenciadas se trataron con 1 ml de trizol (GIBCO) por
cada 1x106 células y se adicionó 200 µl de cloroformo, las proteínas, ADN y ARN se
separaron por centrifugación a 10000 g, y posteriormente se recolectó el ARN presente en
la fase acuosa, el cual se precipito con 500 µl de isopropanol, se disolvio en etanol al 75% y
se almacenó a una temperatura de -70°C hasta la cuantificación y realización de la RT-PCR.
La cuantificación y determinación de la pureza del ARN se realizó por espectrofotometría a
260 y 280 nm.
6.2.2.2 Síntesis de ADNc
Los restos de ADN genómico se eliminaron de la muestra de ARN mediante tratamiento
con ADNasa (1u/µl) que posteriormente fue inactivada por incubación a 65°C durante 10
16
minutos. El ADNc se sintetizó utilizando la enzima SuperScript II (10u/µl) (estuche-
Invitrogen II), utilizando como iniciadores oligodTs (10 mM).
6.2.2.3 PCR
Un segmento de los genes EPCR y PAR3 se amplificaron utilizando la secuencia de
iniciadores descritos por Nan y colaboradores (123), y Asokananthan y colaboradores
(124). Los iniciadores para la amplificación de un segmento del gen PAR1 se diseñaron
utilizando el software Genrunner. El gen GAPDH se utilizo como control de amplificación.
Como control negativo se utilizó una reacción que contiene todos los reactivos para la
amplificación excepto el ADNc y como control positivo de amplificación del gen EPCR se
utilizó el ADNc de células endoteliales.
La PCR para los receptores EPCR, PAR1 y PAR3 se realizo utilizando 2 µl de ADNc, buffer de
reacción 1X, cloruro de magnesio 2 mM, dNTPs 0.2 mM, iniciadores 0.2 µM y Tag
polimerasa a una concentración de 1.5 u/µl. El volumen final de la reacción fue de 20 µl.
GAPDH se amplifico utilizando 2 µl de ADNc, buffer de reacción 1X, cloruro de magnesio 2
mM, dNTPs 0.2 mM, iniciadores 0.25 µM y Tag polimerasa a una concentración de 1.25
u/µl. El volumen final de la reacción fue de 20 µl.
Las condiciones de amplificación para el segmento del gen EPCR (90 pb) fueron: 1 ciclo de
95 °C por 1 minuto, 40 ciclos de 95 °C por 1.5 minutos, 60 °C por 1 minuto y 72°C por 10
minutos. En la amplificación del gen PAR3 (segmento de 382 pb) se aplico 1 ciclo de 94 °C
por 1 minuto, 35 ciclos de 94 °C por 45 segundos, 65 °C por 45 segundos y 72°C por 2.5
minutos y 1 ciclo adicional de 72 °C por 10 minutos.
Debido a la poca homología entre las secuencias de PAR1 de la línea celular CAD (murina)
y PAR1 de la línea endotelial (humana) se diseñó un par de primers para cada línea celular.
Las condiciones para amplificación del segmento del gen PAR1 en células CAD (507 pb)
fueron: 1 ciclo de 94 °C por 1 minuto, 35 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 57 °C por 1 minuto y
72°C por 2 minutos, y, finalmente, 1 ciclo de 72 °C por 5 minutos. Las condiciones para la
amplificación del gen PAR1 de células endoteliales (280 pb) fueron: 1 ciclo de 94 °C por 45
segundos, 30 ciclos de 94 °C por 40 segundos, 50 °C por 40 segundos y 72°C por 40
segundos, y, finalmente, 1 ciclo de 72 °C por 2 minutos.
El gen GAPDH (segmento de 239 pb) se amplifico mediante 1 ciclo de 94 °C durante 1
minuto, 35 ciclos a 94 °C por 40 segundos, 56°C por 40 segundos y 72 °C por 2 minutos, y,
finalmente, 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos.
17
6.2.3 Determinación de la actividad reductora del MTT en células CAD tratadas con PCA
y C2-ceramida:
Las células CAD se utilizaron para evaluar el efecto de PCA en la actividad de reducción de
(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro MTT). La reducción de la sal genera
un compuesto purpura (formazán), cuya absorbancia es cuantificada por
espectrofotometría (125). Este es interpretado como un equivalente de la viabilidad (126).
Las células CAD se sembraron y diferenciaron en placas de 96 pozos bajo las condiciones
especificadas anteriormente.
Para determinar el efecto de PCA frente a la actividad reductora del MTT en células
tratadas con C2-ceramida, las células CAD diferenciadas se trataron con PCA y
posteriormente con C2-ceramida. Las concentraciones de PCA que se ensayaron se
encuentran en el rango de 50 a 200 nM y los tiempos de tratamiento que se emplearon se
encuentran entre las 0 y las 24 horas (2). Se seleccionó el tratamiento con PCA que
permitió aumentar la actividad reductora del MTT en células expuestas a C2-ceramida
respecto al grupo tratado únicamente con C2-ceramida. La concentración de C2-ceramida
que se utilizó en los ensayos de viabilidad fue de 25 µM durante 6 horas (dosis letal 50)
(127).
Después de aplicados los tratamientos con PCA y C2-ceramida se adicionó la sal de
tetrazolio (Sigma) a una concentración final de 1 mg/ml, se incubó a 37 °C y 5 % de CO2
durante 3 horas, se adicionó buffer de lisis y se cuantificó la presencia de formazán por
medición de la absorbancia a 595 nm.
Los valores de actividad reductora del MTT se normalizaron respecto al control (células sin
tratamiento), a las cuales se les asignó una viabilidad del 100%. El análisis estadístico se
realizó mediante la prueba T STUDENT.
6.2.4 DETERMINACIÓN DE APOPTOSIS
Los métodos que se utilizaron para evaluar la apoptosis fueron la tinción de Hoechst y el
ensayo de la actividad enzimática de la caspasa-3.
6.2.4.1 Evaluación del efecto de PCA previo a C2-ceramida en la condensación del ADN
nuclear de células CAD diferenciadas
La evaluación del efecto de PCA en el porcentaje de células con ADN condensado se
realizó mediante el ensayo de tinción de Hoechst, un compuesto aromático e hidrofóbico
que se une a regiones del ADN abundantes en adeninas y timinas (128).
18
Las células CAD se sembraron en una placa de 6 pozos bajo las condiciones especificadas
anteriormente, después de 4 días de diferenciación las células se trataron con PCA (100
nM-12 horas) y luego con C2-ceramida (25 µM-6 horas).
Después de la aplicación de los tratamientos, las células se fijaron con paraformaldehido
al 4 % a 4°C durante 30 minutos, se lavo con PBS y se adiciono Hoechst 33258 (Sigma) al
50% v/v a 37°C durante 30 minutos en oscuridad. La cuantificación de las células se realizó
por microscopia de fluorescencia con un filtro UV (370-390 nm), se evaluó entre 150 y 300
células por tratamiento, la cantidad de células apoptóticas se normalizo respecto a las
células control.
Los conteos celulares se evaluaron como la relación entre el número de células con
condensación de núcleo y el número total de células, las desviaciones estándar se
calcularon entre agrupaciones aleatorias de 6 campos visuales. El análisis estadístico se
realizó mediante una prueba T STUDENT.
6.2.4.2 Determinación de la actividad de la enzima caspasa-3 en células CAD tratadas con
PCA y C2-ceramida.
Se determinó el efecto de PCA en la actividad de la caspasa-3, la principal caspasa efectora
de la apoptosis (129), mediante el ensayo enzimático (estuche de caspasa-3 fluorescente,
Sigma).
Las células CAD se sembraron y diferenciaron en una placa de 6 pozos bajo las condiciones
especificadas anteriormente.
Con el propósito de obtener valores detectables de la actividad de caspasa-3 en células
tratadas previamente con PCA, las células CAD se trataron con C2-ceramida a una
concentración de 25 µM durante 1,2,4 ó 6 horas.
6.2.4.2.1 Extracción y cuantificación de proteína total de células CAD
Después de la aplicación de los tratamientos se procedió a la extracción de las proteínas
empleando buffer de lisis (EDTA 4 mM, HEPES 20 mM, NP40 1%) y solución de inhibidores
de proteasas (Aprotinina 10 µg/ml, Inhibidor de tripsina 50 µg/ml y Benzamidina 5 mM).
Las proteínas extraídas se cuantificaron mediante el ensayo del ácido bicinconínico BCA
(PIERCE).
19
6.2.4.2.2 Ensayo de actividad caspasa-3
La actividad de la enzima caspasa-3 se ensayo mediante el sustrato fluorescente Ac-DEVC-
AMC (Sigma), 16 µM del sustrato se adiciono a 20 µg de proteína. La actividad de la
enzima caspasa-3 se cuantifico por fluorometría utilizando un filtro de excitación de 360
nm y uno de emisión de 460 nm.
Como control negativo de la actividad de la caspasa-3 se utilizó células con ó sin
tratamiento con C2-ceramida en presencia del inhibidor específico de la actividad de la
caspasa-3 (Ac-DEVD-CHO).
Los datos se normalizaron respecto al grupo de células sin tratamiento (células sin C2-
Ceramida). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba T STUDENT.
Después de determinar el tiempo en que se obtiene la máxima actividad de la caspasa-3
en células tratadas con C2-ceramida se realizó los ensayos con PCA y C2-ceramida
utilizando los mismos controles del experimento descrito.
6.2.5 Determinación del efecto de PCA en la fosforilación de AKT en células CAD tratadas
con PCA y C2-ceramida
Para determinar el efecto de PCA en la fosforilación de AKT y en la activación de la vía
PI3K-AKT en células CAD, la fosforilación de AKT fue evaluada mediante Western Blot. La
cantidad de AKT fosforilado y total se normalizó respecto a las cantidades de actina. Los
niveles relativos de AKT fosforilado se correlacionaron con los niveles relativos de AKT
total.
Las células CAD se sembraron y diferenciaron en una placa de 6 pozos bajo las condiciones
anteriormente descritas.
Las células CAD se trataron con PCA (concentración y tiempo definidos mediante el ensayo
MTT) y con 25 µM de C2-ceramida por 2 horas (tiempo en el que se presenta una
completa defosforilación de AKT por tratamiento con C2-ceramida (Lab. de Neurociencias-
Unal)
Se utilizó el protocolo descrito para extracción y cuantificación de proteínas
anteriormente descrito.
20
6.2.5.1 Ensayo de Western Blot
40 µg de proteína se separaron electroforéticamente en gel de poliacrilamida en
condiciones denaturantes. La detección se realizó mediante quimioluminiscencia
(estuche- GE Healthcare).
La electroforesis se realizó en un gel de corrido constituido de acrilamida al 10%, 0.1% de
SDS, 0.1% de Persulfato de Amonio (APS), 0.04% de TEMED y 25% de una solución de 1.5
M de TRIS–HCL y 0.1 % de SDS a PH 8.8. EL gel de stacking que se utilizo consistió de
acrilamida al 5%, 0.1% de SDS, 0.1% de APS, 0.02% de TEMED y 12.5% de una solución de
0.5 M de TRIS–HCL y 4 % de SDS a PH 6.8, El buffer de corrido de la electroforesis consistió
de TRIZMA base 188 mM, Glicina 188 Mm y SDS 0.1%. La electroforesis se realizo a 50
voltios durante 4 horas.
La transferencia se realizó utilizando un buffer de transferencia compuesto por 25 mM de
TRIZMA base, 192 mM de glicina y 20% de metanol, las condiciones de transferencia
fueron 100 Voltios durante 2 horas.
Cada una de las membranas de nitrocelulosa se coloco en Buffer de bloqueo (Leche
descremada en polvo 10%, TBS 10% y 0.2% de Tween 20) durante una hora a temperatura
ambiente. Las membranas se colocaron en un tubo con capacidad de 50 ml con la solución
de Buffer de bloqueo y el anticuerpo primario anti-fosfoAKT serina 473 o anti-AKT total
(Cell Signaling Technology) a una dilución 1:1000, a una temperatura de 4°C durante toda
la noche, Posteriormente, las membranas se lavaron cada 15 minutos durante una hora en
TBS 1X y colocadas en un tubo con capacidad de 50 ml con la solución de Buffer de
bloqueo y el anticuerpo secundario en proporción 1:1000 a temperatura ambiente
durante una hora. La detección de las proteínas se realizó mediante quimioluminiscencia
(estuche-GE Healthcare).
Se utilizó como control positivo de la fosforilación de AKT células tratadas con IGF-1 (108)
y como control negativo de la fosforilación de AKT células tratadas con C2-ceramida (101),
las células tratadas con el inhibidor de PI3K LY294002 únicamente (10 µM durante 12
horas) ó células tratadas con el inhibidor LY294002 simultáneamente a la aplicación de la
PCA se utilizaron como un control negativo de la activación de la vía PI3K-AKT. LY294002
es un inhibidor que compite por el sitio de unión del ATP de la enzima PI3K, inhibiendo
específicamente su actividad enzimática (130).
21
7 Resultados y discusión
7.1 Determinación de los niveles de la expresión de ARNm para los receptores PAR-1,
PAR-3 Y EPCR en células CAD.
En neuronas primarias murinas el efecto antiapoptótico de PCA frente a NMDA esta
asociado a la expresión de los receptores PAR1 y PAR3 (2), además EPCR es uno de los
receptores implicados en la activación de PC (30). Por esta razón se evaluó la expresión del
ARNm de los receptores EPCR, PAR1 y PAR3 en células CAD diferenciadas y no
diferenciadas. El control negativo consistió en una reacción en donde se encuentran
presentes todos los reactivos para la amplificación excepto el ADNc, como control positivo
del gen EPCR se utilizó el ADNc de células endoteliales (35).
Las células SH-SY5Y se evaluaron en la expresión del RNAm para los receptores EPCR,
PAR1 y PAR3 debido a que son células de neuroblastoma humano empleadas como un
modelo de neuronas dopaminérgicas para investigación en la enfermedad de Parkinson
(131), al ensayarlas se buscó comparar un modelo de neuronas murinas con un modelo
neuronal humano.
La amplificación del segmento del gen GAPDH a partir del ADNc de células CAD
diferenciadas, CAD no diferenciadas, SH-SY5Y y endoteliales generó una banda con un
tamaño que se encuentra entre 200 a 250 pb (figura 1).
FIGURA 1: Electroforesis de ADN amplificado para un segmento del gen GAPDH en células CAD diferenciadas, CAD no
diferenciadas, SH-SY5Y y endoteliales. Los diferentes tipos celulares fueron cultivados durante 4 días, hasta alcanzar
confluencia, en presencia ó ausencia de suero; CAD no diferenciadas ó diferenciadas, se realizo extracción de ARN,
transcripción reversa y PCR como se indica en la metodología. P: Marcador de peso molecular (pb) (línea 1); control:
corresponde a una PCR en ausencia de ADNc (línea 2); CAD dif: CAD diferenciadas (línea 3); CAD no dif: CAD no
diferenciadas (línea 4); SH-SY5Y: células de la línea celular SH-SY5Y (línea 5); Endot: células endoteliales (línea 6). GAPDH
se utilizó como control de amplificación de EPCR, PAR1 y PAR3 y como control para la cuantificación.
P
Control
CAD dif.
CAD no
dif
SH-SY5Y Endot.
250
150 100
50
22
La amplificación del segmento del gen EPCR a partir del ADNc de células CAD diferenciadas
generó una banda con un tamaño de aproximadamente 90 pb, que corresponde al
tamaño esperado del segmento del gen EPCR amplificado (123) y que esta presente en
células endoteliales, las cuales expresan constitutivamente dicho receptor (35). Esto indica
que las células CAD diferenciadas expresan el ARNm para el receptor EPCR, mientras que
las células CAD no diferenciadas no presentan expresión detectable de dicho receptor
(figuras 2A y 2B). Adicionalmente, se presentó una banda de aproximadamente 50 pb en
el control negativo, CAD no diferenciadas y SH-SY5Y que corresponde probablemente a la
formación de dímeros de los iniciadores (figura 2).
A.
B.
FIGURA 2: Electroforesis de ADN amplificado para un segmento del gen EPCR en células CAD diferenciadas, CAD no
diferenciadas, SH-SY5Y y endoteliales. A. P: Marcador de peso molecular (pb) (línea 1); control: PCR en ausencia de
ADNc (línea 2); CAD dif: CAD diferenciadas (línea 3); CAD no dif: CAD no diferenciadas (línea 4); SH-SY5Y: células de la
línea celular SH-SY5Y (línea 5); Endot: células endoteliales (línea 6). B. Cuantificación de ADN obtenido por amplificación
del ADNc proveniente del ARNm del receptor EPCR. La cuantificación se realizó respecto al gen GAPDH de cada uno de
los diferentes tipos celulares utilizando el software ImageJ.
Se realizó la PCR a partir del ADNc de los diferentes tipos celulares para un segmento de
ADN de 382 pb que codifica para el receptor PAR3 (124). Las células CAD diferenciadas
muestran la amplificación de un segmento de ADN entre 350 y 400 pb que corresponde al
P
Control CAD
dif.
CAD no dif
Shsy5y Endot.
400
150 100
50
23
tamaño esperado para el segmento del receptor PAR3 amplificado, el cuál no es
detectable en células CAD no diferenciadas, en SH-SY5Y ni en endotelio (figuras 3A y 3B).
A.
B.
FIGURA 3: Electroforesis de ADN amplificado para un segmento del gen PAR3 en células CAD diferenciadas, CAD no
diferenciadas, SHSY-5Y y endoteliales. A. P: Marcador de peso molecular (pb) (línea 1); control: PCR en ausencia de
ADNc (línea 2); CAD dif: CAD diferenciadas (línea 3); CAD no dif: CAD no diferenciadas (línea 4); SH-SY5Y: células de la
línea celular SH-SY5Y (línea 5); Endot: células endoteliales (línea 6). B. Cuantificación de ADN obtenido por amplificación
del ADNc proveniente del ARNm del receptor PAR3. La cuantificación se realizó respecto al gen GAPDH de cada uno de
los diferentes tipos celulares utilizando el software ImageJ.
La amplificación del segmento del gen PAR1 a partir del ADNc de células CAD no
diferenciadas generó una banda con un tamaño de 507 pb aproximadamente (iniciadores
diseñados utilizando el software Genrunner), que corresponde al tamaño esperado del
segmento del gen PAR1. Las células CAD diferenciadas no presentan expresión detectable
del receptor PAR1, tampoco las Shsy5y ni endotelio (figuras 4A y 4B).
P
Control CAD dif. CAD no dif
Shsy5y Endot.
400
150 100 50
24
A.
B.
FIGURA 4: Electroforesis de ADN amplificado para un segmento del gen PAR1 en células CAD diferenciadas, CAD no
diferenciadas, SHSY-5Y y endoteliales. A. P: Marcador de peso molecular (pb) (línea 1); control: PCR en ausencia de
ADNc (línea 2); CAD dif: CAD diferenciadas (línea 3); CAD no dif: CAD no diferenciadas (línea 4); SH-SY5Y: células de la
línea celular SH-SY5Y (línea 5); Endot: células endoteliales (línea 6). B. Cuantificación de ADN obtenido por amplificación
del ADNc proveniente del ARNm del receptor PAR1. La cuantificación se realizó respecto al gen GAPDH de cada uno de
los diferentes tipos celulares utilizando el software ImageJ.
La cuantificación del ADN proveniente del ARNm de los receptores mostró la expresión del
ARNm para los receptores EPCR y PAR3 en las células CAD diferenciadas. En células
endoteliales el receptor EPCR está implicado en la activación de la PC (30) mientras que el
receptor PAR3 y PAR1 están conjuntamente asociados al efecto antiapoptótico inducido
por PCA en neuronas primarias (2). En células CAD diferenciadas no se detectó expresión
de ARNm para el receptor PAR1, sin embargo, estas células se utilizaron como modelo
neuronal para evaluar el efecto antiapoptótico de PCA frente a apoptosis promovida por
C2-ceramida debido a la expresión detectable de ARNm para el receptor EPCR (figura 2B)
que plantea la posibilidad para la activación de la PC y la mediación de la PCA en procesos
antiapoptóticos.
Con el método utilizado no se detecta expresión de ARNm para los receptores EPCR y
PAR3 en células CAD no diferenciadas, sin embargo, existe la posibilidad de que tales
cantidades sean muy bajas y no puedan ser detectadas mediante análisis de RT-PCR
P Control
CAD dif. CAD no dif
Control Shsy5y
Endot.
500
400
150
100
50
25
semicuantitativo. Otros métodos de mayor sensibilidad para la determinación de las
cantidades de ARNm podrían ser utilizados entre estos RT-PCR en tiempo real (132).
7.2 Determinación de la actividad reductora del MTT en células CAD diferenciadas
tratadas con PCA y C2-ceramida.
El ensayo de reducción del MTT permite la detección de la actividad metabólica, como un
criterio de viabilidad. El MTT es internalizado por la célula a través de endocitosis y
después de ser reducido es transportado a la superficie de la membrana celular por
exocitosis. La reducción del MTT requiere de NADH y ATP (126), los cuales se generan
mediante glicolisis, la cual junto con el transporte vesicular es realizado por células vivas,
sin embargo algunas condiciones de cultivo, entre ellas el pH del medio de cultivo, el
aumento del tamaño celular (133) y las propiedades reductoras del mediador que se
evalúa (134), pueden ocasionar que el número de células viables no corresponda con la
magnitud del MTT reducido, razón por la cual usualmente se evalúan otros criterios de
viabilidad tales como la síntesis de ADN (135) y la integridad de la membrana (136). En
células CAD la deprivación de suero durante 4 días disminuye significativamente la
proliferación celular respecto a las células cultivadas en presencia de suero (137), por lo
cual no es aplicable la ejecución de ensayos para la determinación de la proliferación y por
tanto de la síntesis de ADN en el modelo celular utilizado.
En células apoptóticas tempranas la membrana plasmática no presenta alteraciones en la
permeabilidad celular (21) (138) (16), razón por la cual colorantes hidrofílicos, tales como
azul de tripan ó yoduro de propidio, no ingresan al interior celular (139). En esta
investigación se evaluó la actividad metabólica como un criterio de viabilidad, la cual se
determinó mediante el ensayo de reducción del MTT y no se realizó evaluación de la
integridad de la membrana debido a que no es posible discriminar entre las células
apoptóticas no viables que mantienen su integridad de membrana y las células normales.
Aunque la actividad de reducción del MTT no es una prueba exacta de viabilidad, en el
presente estudio se analizó la actividad metabólica del MTT como un indicador de
viabilidad.
El efecto de PCA en la viabilidad de las células CAD diferenciadas tratadas con C2-ceramida
se evaluó mediante el tratamiento con 100 nM de PCA durante 4, 8, 12 ó 24 horas
después de las cuales se aplicó tratamiento con 25 µM de C2-ceramida durante 6 horas.
Las células tratadas únicamente con C2-ceramida muestran una disminución significativa
de la viabilidad respecto a las células control (p= 0.002), las células tratadas con PCA
durante 12 ó 24 horas previo al tratamiento con C2-ceramida presentan un aumento
significativo de dicha actividad respecto a las células tratadas con C2-ceramida
26
únicamente (p= 0.013 y 0.012 respectivamente), mientras que las células tratadas con PCA
por 4 ó 8 horas previo al tratamiento con C2-ceramida no presentan diferencias
significativas respecto a las tratadas con C2-ceramida (p= 0.265 y 0.559 respectivamente)
(figura 5). Estos resultados indican que PCA aplicada durante 12 ó 24 horas previo a C2-
ceramida induce un aumento de la viabilidad en células CAD diferenciadas.
Los tratamientos con PCA durante 12 ó 24 horas no presentan diferencias significativas
(p= 0.833), por esta razón el tiempo de aplicación de PCA que se empleo en los siguientes
ensayos fue de 12 horas previos al tratamiento con C2-ceramida.
FIGURA 5: Efecto de PCA aplicada por diferentes tiempos previo a C2-ceramida en la actividad reductora del MTT,
como un indicador de viabilidad de las células CAD diferenciadas. Las células CAD diferenciadas fueron tratadas con
PCA a una concentración de 100 nM durante 4, 8, 12 ó 24 horas y luego con C2-ceramida a una concentración de 25 µM
durante 6 horas. La actividad MTT reductasa fue determinada como se describe en la sección de materiales y métodos.
Control: células sin tratamientos; C2-cer: tratamiento con C2-ceramida únicamente; PCA 24h: tratamiento con PCA
durante 24 horas; 4h+C2, 8h+C2, 12h+C2, 24h+C2: tratamientos con PCA durante diferentes tiempos y posterior
tratamiento con C2-ceramida. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba T STUDENT. * Diferencias
significativas (p<0.05) respecto a las células tratadas con únicamente C2-ceramida.
El efecto de PCA previamente aplicada a C2-ceramida en la viabilidad en células CAD
diferenciadas se evaluó a diferentes dosis de PCA (50, 100 ó 200 nM) por 12 horas (tiempo
en que PCA contrarresta la disminución de la viabilidad inducida por C2-ceramida-figura
5), posteriormente se aplicó el tratamiento con 25 µM de C2-ceramida durante 6 horas.
Las células tratadas con C2-ceramida muestran una disminución significativa de la
viabilidad respecto a las células control (p= 0.0003), las células tratadas con 100 nM de
PCA durante 12 horas y posteriormente con C2-ceramida presentan un aumento
significativo de la viabilidad respecto a las células tratadas con C2-ceramida únicamente
(p= 0.04). En contraste, las células tratadas con 50 nM de PCA previamente a C2-ceramida
27
no contrarresta la disminución en la viabilidad inducida por C2-ceramida (p= 0.90),
igualmente el tratamiento con 200 nM de PCA no induce una recuperación significativa en
la viabilidad respecto a las células tratadas con únicamente C2-ceramida (p= 0.22) (figura
6).
FIGURA 6: Efecto de PCA aplicada a diferentes concentraciones previo a C2-ceramida en la actividad reductora del
MTT como un indicador de viabilidad de las células CAD diferenciadas. Las células CAD diferenciadas fueron tratadas
con PCA a una concentraciónes de 50, 100 ó 200 nM durante 12 horas y posteriormente con C2-ceramida a una
concentración de 25 µM durante 6 horas. La actividad MTT reductasa fue determinada como se describe en la sección
de materiales y métodos. Control: células sin tratamientos; C2-cer: tratamiento con C2-ceramida únicamente; PCA 100:
tratamiento con 100 nM de PCA; PCA50+C2, PCA100+C2 y PCA200+C2: tratamientos con PCA a diferentes
concentraciones y tratamiento posterior con C2-ceramida. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba T
STUDENT. * Diferencias significativas (P<0.05) respecto a células tratadas con únicamente C2-ceramida.
Los resultados anteriores muestran el efecto neuroprotector de PCA previo a la exposición
a C2-ceramida. Adicionalmente se ensayo el efecto de 100 nM de PCA por 12 horas
posterior al tratamiento con 25 µM de C2-ceramida por 6 horas. Las células tratadas
únicamente con C2-ceramida muestran una disminución significativa de la viabilidad
respecto a las células control (p= 0.03). El tratamiento con PCA posterior a C2-ceramida no
presenta cambios significativos respecto a las células tratadas únicamente con C2-
ceramida (p= 0.362) (figura 7), lo que indica que el postratamiento con PCA no revierte el
efecto de C2-ceramida sobre la viabilidad de células CAD.
De acuerdo con los resultados de pretratamiento con PCA (figura 5), no se evaluó
diferentes tiempos de postratamiento con PCA debido a que el efecto de PCA en la
viabilidad requiere de 12 horas, mientras que el efecto con C2-ceramida requiere de 6
horas, por lo tanto mayor tiempo de tratamiento con PCA implica a la vez mayor tiempo
en el desarrollo de los eventos apoptóticas iniciados por C2-ceramida y por tanto menor
efecto de PCA en la supervivencia de las células apoptóticas. De igual manera se ensayo
28
únicamente la concentración de 100 nM de PCA (figura 7) debido a que concentraciones
superiores ó inferiores no contrarrestan la disminución de la viabilidad inducida por C2-
ceramida (figura 6).
FIGURA 7: Efecto del tratamiento de PCA posterior a la aplicación de C2-ceramida en la actividad reductora del MTT
como un indicador de viabilidad de las células CAD diferenciadas. Las células CAD diferenciadas fueron tratadas con
C2-ceramida a una concentración de 25 µM durante 6 horas y posteriormente con PCA a una concentración de 100 nM
durante 12 horas. La actividad MTT reductasa fue determinada como se describe en la sección de materiales y métodos.
Control: células sin tratamientos; C2-cer: tratamiento con C2-ceramida únicamente; PCA: tratamiento con 100 nM de
PCA por 12 horas; C2+PCA: células tratadas con C2-ceramida y posteriormente con PCA. El análisis estadístico se realizó
mediante la prueba T STUDENT.
7.3 Determinación de Apoptosis
7.3.1 Evaluación del efecto de PCA previo a C2-ceramida en la condensación del ADN de
células CAD diferenciadas
Una de las características de las células apoptóticas es la condensación del ADN (16), la
detección se realiza mediante moléculas fluorescentes, entre ellas Hoechst, una molécula
de naturaleza hidrofóbica que se une a regiones del ADN en donde predomina las
adeninas y timinas (128). Varios estudios empleando Hoechst para la determinación de
apoptosis han utilizado en conjunto colorantes como Ioduro de Propidio (PI) y la técnica
de TUNEL (140). PI es una molécula que atraviesa la membrana plasmática de células que
pierden su integridad de membrana uniéndose al ADN y emitiendo fluorescencia (141).
TUNEL consiste en la utilización de nucleótidos marcados que se unen a los extremos 3´-
OH del ADN fragmentado (142).
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
110%
120%
Control C2-cer. PCA C2+PCA
Via
bili
dad
re
lati
va (
%)
Tratamientos
Viabilidad- Actividad reductora del MTT
29
La evaluación del efecto de PCA en la condensación del ADN se realizó únicamente
mediante el ensayo de tinción de Hoechst, procedimientos adicionales que permitan la
verificación del método de Hoechst son convenientes para disminuir las incertidumbres de
la determinación del estado celular (normal, apoptosis, necrosis u otros), sin embargo, la
escasez de recursos hizo inviable la realización de métodos tales como TUNEL; en el caso
del método de permeabilidad con PI, las células apoptóticas no podrían ser discriminadas
de las células normales debido al mantenimiento de la integridad de la membrana (21)
razón por la cual no proporcionaría información adicional.
Las células CAD diferenciadas fueron tratadas con 100 nM de PCA por 12 horas y luego
con 25 µM de C2-ceramida por 6 horas y se analizaron cambios apoptóticos mediante la
tinción de Hoechst. Las células apoptóticas presentaron una alta intensidad de
fluorescencia, lo que sugiere la condensación de la cromatina (figura 8B) similar a las
observaciones realizadas por Kelly y colaboradores (140). Las células normales
presentaron una baja intensidad de fluorescencia comparada con las células apoptóticas
(figura 8D).
La población de células tratadas con C2-ceramida presentó un aumento en el porcentaje
de células con condensación del ADN respecto a las células control, efecto que es
disminuido por el tratamiento con PCA previo a la aplicación de C2-ceramida (figura 9),
esto sugiere un efecto protector de PCA frente a apoptosis inducida por C2-ceramida en
células CAD diferenciadas.
30
A B
C D
FIGURA 8: Condensación del ADN en células tratadas con C2-ceramida comparado con células tratadas con PCA. Las
células CAD diferenciadas fueron tratadas con 100 nM de PCA por 12 horas y luego con 25 µM de C2-ceramida por 6
horas Después de la aplicación de los tratamientos las células fueron fijadas con paraformaldehido (4%) y teñidas con
Hoechst (50 % v/v). La visualización se realizo por microscopia de fluorescencia. A y B: microscopia de luz y microscopia
de fluorescencia de las células CAD diferenciadas tratadas con 25 µM C2-ceramida durante 6 horas, C y D: microscopia
de luz y microscopia de fluorescencia de las células CAD diferenciadas tratadas con 100 nM PCA durante 12 horas.
FIGURA 9: Efecto del tratamiento de PCA previo a C2-ceramida en el porcentaje de células con ADN nuclear
condensado. Las células CAD diferenciadas fueron tratadas con PCA a una concentración de 100 nM durante 12 horas y
posteriormente con C2-ceramida a una concentración de 25 µM durante 6 horas. El número de células con núcleo
condensado fue determinado por cuantificación de las células con tinción de Hoechst, los valores corresponden a la
relación entre el número de células con condensación de núcleo y el total de celulas, las desviaciones estándar se
31
calcularon entre agrupaciones aleatorias de 6 campos visuales. Control: células sin tratamientos; C2-cer: células tratadas
con C2-ceramida; PCA: tratamiento con PCA únicamente; PCA+C2: células tratadas con PCA previo a C2-ceramida. El
análisis estadístico se realizó mediante la prueba T STUDENT. * Diferencias significativas (p<0.05) respecto a las células
tratadas con únicamente C2-ceramida.
7.3.2 Determinación de la actividad de la enzima caspasa-3 en células CAD diferenciadas
tratadas con PCA previo a C2-ceramida.
La caspasa-3 es señalada como una de las principales proteínas efectoras de la cascada
apoptótico, que presenta una actividad enzimática no específica por diferentes sustratos
(143) entre ellos poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y la subunidad catalítica de la
proteína cinasa dependiente de ADN (144). Dentro de la cascada de las caspasas, caspasa-
3 se activa tardíamente, corriente abajo de caspasa 9 (143), por lo cual se puede
considerar un marcador del avance del proceso apoptótico.
Las células CAD se trataron con C2-ceramida a una concentración de 25 µM durante 1, 2,
4 ó 6 horas para determinar el tiempo en que se presenta la máxima actividad de la
enzima caspasa-3. En este ensayo se utilizó como control negativo de la actividad de la
caspasa-3 el extracto proteico de las células control en presencia del inhibidor de la
caspasa-3 (Ac-DEVD-CHO), se observa que la actividad de la caspasa-3 disminuyó en los
extractos proteicos de las células control en presencia del inhibidor Ac-DEVD-CHO
respecto a los extractos de las células control en ausencia del inhibidor, sugiriendo que la
actividad detectada corresponde específicamente a la actividad de la caspasa-3, la máxima
actividad de la caspasa-3 se presenta a las 2 horas de tratamiento con C2-ceramida (figura
10), mientras que la aplicación de C2-ceramida durante 6 horas presenta valores de la
actividad caspasa-3 inferiores a los obtenidos para células control los cuales
probablemente no puedan ser detectados cuando se aplica el pretratamiento con PCA
(figura 10). Se obtuvo valores negativos de fluorescencia para el extracto proteico de
células tratadas con C2-ceramida en presencia del inhibidor Ac-DEVD-CHO, por lo cual este
grupo control no fue reportado.
32
FIGURA 10: Máxima actividad caspasa inducida por C2-ceramida. Las células CAD diferenciadas fueron tratadas con C2-
ceramida a una concentración de 25 µM durante 1, 2, 4 ó 6 horas. Control: células sin tratamientos; Inhibidor: extracto
proteico de las células sin tratamientos en presencia de inhibidor de la actividad de las caspasa-3; C2-cer.1h, C2-cer.2h,
C2-cer.4h y C2-cer.6h: células tratadas con C2-ceramida durante 1, 2, 4 ó 6 horas. Se determino la actividad de la enzima
caspasa-3 y se cuantifico dicha actividad mediante fluorometría. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba T
STUDENT. * Diferencias significativas (p<0.05) respecto a las células control.
Posteriormente se determinó la activación de caspasa-3 inducida por C2-ceramida en
presencia del pre-tratamiento con PCA. Las células se pretrataron con 100 nM de PCA por
12 horas y posteriormente con 25 µM de C2-ceramida por 2 horas (tiempo en el que se
alcanza la máxima actividad de la caspasa-3 en células tratadas con C2-ceramida-figura
10). Se observa que en las células tratadas con C2-ceramida se presenta un aumento de la
actividad de la caspasa-3 relativo a las células control, y que esta actividad disminuyó en
presencia del inhibidor para caspasa-3 Ac-DEVD-CHO, sugiriendo que la fluorescencia
detectada corresponde a la actividad de la caspasa-3, las células pretratadas con PCA
muestran una disminución de la actividad de la caspasa-3 inducida por C2-ceramida a
niveles similares a los que se presentan en células control, esto sugiere un efecto
antiapoptótico de PCA frente a C2-ceramida en células CAD diferenciadas (figura 11).
33
FIGURA 11: Efecto de PCA en la actividad de la caspasa-3 en células CAD diferenciadas. Las células CAD diferenciadas
fueron tratadas con PCA a una concentración de 100 nM por 12 horas y posteriormente con C2-ceramida a 25 µM
durante 2 horas. Control: células sin tratamientos; C2-cer: células tratada con C2-ceramida durante 2 horas;
C2+inhibidor: extracto proteico de células tratadas con C2-ceramida en presencia del inhibidor de la actividad de la
caspasa-3; PCA+C2: células tratadas con PCA previo a C2-ceramida. Se determino la actividad de la enzima caspasa 3 y se
cuantifico dicha actividad mediante fluorometría. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba T STUDENT. * Diferencias significativas (p<0.05) respecto a las células tratadas con únicamente C2-ceramida.
7.4 Determinación de la fosforilación de AKT en células CAD tratadas con PCA previo a
C2-ceramida.
Las células CAD se trataron con 100 nM de PCA durante 30 minutos, 2 ó 12 horas para
determinar la cinética de la fosforilación de AKT. Este ensayo se realizó con el propósito de
obtener valores detectables de fosforilación después del tratamiento con C2-ceramida. De
acuerdo con los resultados anteriores, uno de los tiempos de pre-tratamiento con PCA fue
12 horas debido a que este tiempo fue el requerido para contrarrestar la disminución de
la viabilidad inducida por C2-ceramida (figura 5). Se observa que las células control, sin
tratamiento, no presentan niveles detectables de AKT fosforilado (figura 12A, línea 5),
mientras que las células tratadas con PCA presentan un aumento en los niveles de AKT
fosforilado en función del tiempo (figura 12A, líneas 2 a 4). Las células tratadas con PCA
durante 12 horas presentan el mayor nivel de fosforilación de AKT (figura 12A, línea 4). Las
cantidades de AKT total son similares para cada uno de los grupos de células (figura 12A),
indicando que PCA no afecta la expresión de AKT
La cuantificación de la fosforilación de AKT en células tratadas con PCA muestra un
aumento de la cantidad relativa de AKT fosforilado respecto a las células control, efecto
dependiente del tiempo de aplicación de PCA (figura 12B). Se seleccionó 12 horas de
tratamiento con PCA para los siguientes ensayos.
34
A.
B.
FIGURA 12: Efecto de PCA previo a C2-ceramida en la fosforilación de AKT en células CAD diferenciadas. Las células
CAD fueron tratadas con 100 nM de PCA durante 30 minutos, 2 ó 12 horas. B. Fosforilación de AKT detectada mediante
western blot utilizando anticuerpos AKT-P (Ser 473) y un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa, la detección
de AKT total se realizo mediante un anticuerpo que reconoce las formas fosforilada y no fosforilada de AKT y uno
secundario conjugado con peroxidasa, la detección de AKT fosforilado y total se realizo mediante quimioluminiscencia.
IGF: células tratadas con IGF-1 (0.1ug/mL-2 horas) (línea 1); PCA 30 min, 2h y 12 h: PCA aplicada durante diferentes
tiempos (líneas 2 a 4); Cont: células control (sin tratamiento) (línea 5). B. Cuantificación de las cantidades relativas de
AKT fosforilado realizado por densitometría de las intensidades de las bandas del western blot utilizando el software
ImageJ.
kDa IGF PCA 1/2 h
PCA 2h
PCA 12h
cont
85
Akt-total (60 KDa)
kDa IGF PCA 1/2h
PCA 2h
PCA 12h
cont
85
Akt-P(ser 473) (60 KDa)
35
Para determinar el efecto de PCA previo al tratamiento con C2-ceramida en la
fosforilación de AKT, las células se trataron con 100 nM de PCA durante 12 horas (tiempo
en que se presenta las mayores cantidades relativas de AKT fosforilado-figura 12B) y
posteriormente con 25 µM de C2-ceramida durante 30 minutos (tiempo en el que se
presenta la inhibición de la fosforilación de AKT por tratamiento con C2-ceramida) (Lab. de
Neurociencias-Unal).
Se observa que las células control (sin tratamiento) presentan cantidades basales
detectables de AKT fosforilado (figura 13, línea 1), mientras que el tratamiento con C2-
ceramida resulta en una disminución en la fosforilación de AKT respecto a las células
control (figura 13, línea 2). Esta disminución es contrarrestada por PCA previo a la
aplicación de C2-ceramida (figura 13, línea 5). La aplicación de PCA posterior a la
aplicación de C2-ceramida no contrarresta la disminución de la fosforilación de AKT (figura
13, línea 6). Las células tratadas con el inhibidor de PI3K, LY294002, presentan una
disminución de los niveles basales de AKT fosforilado (figura 13, línea 3) de igual manera,
las células tratadas con el inhibidor LY294002 simultáneamente al tratamiento con PCA
presentan una disminución de los niveles de AKT fosforilado (figura 13, línea 7), los
resultados anteriores indican que PCA previo al tratamiento con C2-ceramida se asocia
con la inducción de la fosforilación de AKT mediante la vía PI3K-AKT en células CAD
diferenciadas.
36
A.
B.
FIGURA 13: Efecto de PCA previo al tratamiento con C2-ceramida en la fosforilación de AKT de células CAD
diferenciadas. Las células CAD fueron tratadas con 100 nM de PCA durante 12h y luego con 25 µM de C2-Ceramida
durante 30 minutos. A. Fosforilación de AKT detectada mediante western blot utilizando anticuerpos AKT-P (Ser 473) y
un secundario conjugado con peroxidasa, la detección de AKT fosforilado, AKT total y actina se realizo mediante
0
1
2
3
4
5
6
Control C2-cer. LY294002 PCA PCA+C2 C2+PCA LY294002 + PCA
Can
tid
ade
s re
lati
vas
Tratamientos
Cuantificación relativa de AKT fosforilado
kDa Cont C 2 - cer . LY. . PCA . PCA + C2 . C2 + PCA LY + PCA . .
75
50
. . . . .
kDa
Cont
C 2 - cer .
LY. .
PCA .
PCA + C2 .
C2 + PCA LY + PCA . .
75
. . . . .
Akt-P (Ser473) (60KDa)
Akt-Total (60 KDa)
Actina
Actina
37
quimioluminiscencia. Cont: células sin tratamiento; C2-cer: células tratadas con C2-ceramida únicamente; LY ó
LY294002: células tratadas con el inhibidor LY294002 únicamente; PCA: tratamiento con PCA únicamente; PCA+C2:
tratamiento con PCA previo a C2-ceramida; C2+PCA: tratamiento con C2-ceramida previo a PCA; LY+PCA ó LY294002 +
PCA: células tratadas con el inhibidor LY294002 simultáneamente a PCA. B. Cuantificación de las cantidades relativas de
AKT fosforilado realizado por densitometría de las intensidades de las bandas del western blot utilizando el software
ImageJ.
La cuantificación de AKT fosforilado muestra que PCA contrarresta su disminución cuando
es aplicada previamente a C2-ceramida y que el inhibidor LY294002 aplicado
simultáneamente a la aplicación de la PCA inhibe los niveles de AKT fosforilado
promovidos por PCA, sugiriendo la implicación de la vía PI3K-AKT en la inducción de la
fosforilación de AKT por parte de PCA (figura 16).
En neuronas primarias murinas el efecto antiapoptótico de PCA frente a NMDA está
asociado a la expresión conjunta de los receptores PAR1 y PAR3 (2) mientras que EPCR es
está implicado en la activación de PC (30), (37), (38). Las células CAD diferenciadas
presentan expresión detectable del ARNm para los receptores EPCR y PAR3, los cuales
posiblemente estén asociados con los efectos en la viabilidad, apoptosis y fosforilación de
AKT identificados en células CAD diferenciadas tratadas con PCA previo a C2-ceramida.
En la presente investigación se evaluó el efecto de PCA en la apoptosis inducida por C2-
ceramida, un inductor de muerte celular apoptótica en diferentes modelos celulares
incluyendo mastocitos (145) y células de leucemia mieloide (146), entre otras. La
aplicación de PCA como tratamiento previo a C2-ceramida mostró un 25% de mayor
viabilidad que las células que no fueron pretratadas con PCA, evidenciándose un efecto
protector de PCA frente a C2-ceramida. Concordante con estos resultados el efecto de
PCA en la viabilidad ha sido evaluado frente a diferentes inductores de muerte apoptótica
en otros modelos celulares incluyendo células de leucemia monocítica (63), células
endoteliales (147) y células neuronales (68) en los cuales se obtuvo aumento en la
supervivencia celular.
PCA aplicada posteriormente a C2-ceramida no mostró recuperación de la viabilidad, lo
que posiblemente esté relacionado, en este modelo, con el tiempo requerido por PCA
para lograr protección frente C2-ceramida. Concordante con los presentes resultados,
varios estudios han empleado entre 18 y 24 horas de tratamiento con PCA en diferentes
modelos celulares y frente a diferentes inductores apoptóticos; células endoteliales
tratadas con estaurosporina (1), neuronas primarias tratadas con NMDA (2), (68) y
monocitos tratados con camptotecina (63).
El aumento de la viabilidad de las células tratadas con PCA previo a la aplicación de C2-
ceramida fue acorde con la disminución de la apoptosis determinada mediante los
ensayos de actividad de la caspasa-3 y condensación de la cromatina, indicando un efecto
38
protector de PCA frente a apoptosis promovida por C2-ceramida. En relación con lo
anterior también se ha encontrado que PCA presenta un efecto antiapoptótico en
diferentes tipos celulares incluyendo queratinocitos primarios (148), células endoteliales
Eahy926, células de riñón HEK293 (149), y células de páncreas (150).
Se ha identificado a la ceramida como un inductor de apoptosis relacionada con inhibición
de la actividad enzimática de AKT en diferentes modelos neuronales tales como neuronas
corticales primarias de rata (102), en células tumorales de la glándula adrenal PC12 (151),
en neuronas motoras de neuroblastoma HMN1 (152), entre otras. El aumento en los
niveles de AKT fosforilado en células tratadas con PCA previo a C2-ceramida mostró un
150% más fosforilación que las células tratadas con únicamente C2-ceramida, indicando
que PCA tiene un efecto inductor en la fosforilación de AKT. Este efecto ha sido además
observado en animales a los que se les indujo daño isquémico y que fueron inoculados
con PCA posterior a la isquemia (3).
La proteína AKT está implicada en la inactivación de proteínas inductoras de apoptosis
entre ellas Bad (85) y caspasa 9 (87), en el presente estudio se muestra un aumento de los
niveles de la fosforilación de AKT, promovido por pretratamiento de PCA frente a
inducción de apoptosis por C2-ceramida, lo cual sugiere un posible efecto antiapoptótico
de la PCA en celulas CAD diferenciadas, como también lo sugiere conjuntamente la
evaluación de la actividad de la caspasa-3 y Hoechst realizado en el presente trabajo.
Otros estudios han asociado a la PCA en la inhibición de la apoptosis mediante la
disminución de los niveles de las proteínas inductoras de la apoptosis P53 y Bax y un
aumento de la proteína antiapoptótica Bcl-2 (65), e inhibición de la expresión de la
proteína proapoptótica TRAIL inducida por TNF-ALFA (66) lo que indica un efecto de la
PCA en la vía apoptótica.
La proteína AKT es un blanco corriente abajo de PI3K (153), (79), (154), (155), en base a
esto se evaluó la implicación de la PCA en la vía PI3K-AKT mediante el tratamiento de las
células con un inhibidor específico de PI3K (LY294002) y simultáneamente con la
aplicación de la PCA, se evidenció una disminución casi total de la fosforilación de AKT
inducida por PCA, indicando que la fosforilación de AKT promovida por la PCA es mediada
a través de la vía PI3K-AKT.
Con la presente investigación se hace un acercamiento al conocimiento sobre los
mecanismos moleculares de la PCA frente a apoptosis inducida por C2-ceramida en células
neuronales dopaminérgicas, particularmente, sobre la implicación de la vía PI3K-AKT en el
papel antiapoptótico de PCA, los resultados obtenidos son una aproximación a estos
mecanismos. En esta investigación se evaluó el efecto de PCA como un potencial
antiapoptótico en neuronas dopaminérgicas, lo cual aporta una valiosa información para
39
las investigaciones que busquen el desarrollo de terapias, particularmente en
enfermedades como Parkinson.
40
8 CONCLUSIONES
Las células CAD diferenciadas expresan ARNm para los receptores PAR-3 Y EPCR.
Pretratamiento con PCA se asocia con protección anti-apoptótica ante la exposición a C2-
ceramida en células CAD diferenciadas.
La neuroprotección asociada a PCA frente a C2-ceramida posiblemente esta relacionada
con la inducción de la fosforilación de AKT.
41
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56
Contenido 1 Introducción. ............................................................................................................................... 5
2 Hipótesis del proyecto de investigación. .................................................................................... 5
3 MARCO TEÓRICO. ........................................................................................................................ 5
3.1 apoptosis ............................................................................................................................. 5
3.1.1 Generalidades ............................................................................................................. 5
3.1.2 Métodos de Detección ................................................................................................ 7
3.2 Proteina C activada. ............................................................................................................ 7
3.2.1 Generalidades ............................................................................................................. 7
3.2.2 Receptores EPCR ......................................................................................................... 8
3.2.3 Receptores PAR ........................................................................................................... 8
3.2.4 Actividades de PCA ...................................................................................................... 9
3.3 Proteína AKT ...................................................................................................................... 10
3.3.1 Generalidades ........................................................................................................... 10
3.3.2 AKT y Apoptosis ......................................................................................................... 11
3.4 Ceramida ........................................................................................................................... 11
3.4.1 Generalidades ........................................................................................................... 11
3.4.2 Ceramida y Apoptosis ................................................................................................ 12
3.4.3 Ceramida y Neurodegeneración ............................................................................... 13
4 Justificación ............................................................................................................................... 13
5 OBJETIVOS ................................................................................................................................. 14
5.1 General .............................................................................................................................. 14
5.2 Específicos ......................................................................................................................... 14
6 MATERIALES Y METODOS .......................................................................................................... 14
6.1 Materiales y Reactivos ...................................................................................................... 14
6.1.1 Reactivos ................................................................................................................... 14
6.1.2 Modelo celular .......................................................................................................... 14
6.2 Metodología ...................................................................................................................... 15
6.2.1 Cultivo de células CAD ............................................................................................... 15
6.2.2 Determinación de la expresión de receptores EPCR PAR1 y PAR3 en células CAD. . 15
57
6.2.3 Determinación de la actividad reductora del MTT en células CAD tratadas con PCA y
C2-ceramida: ............................................................................................................................. 17
6.2.4 DETERMINACIÓN DE APOPTOSIS .............................................................................. 17
6.2.5 Determinación del efecto de PCA en la fosforilación de AKT en células CAD tratadas
con PCA y C2-ceramida ............................................................................................................. 19
7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................ 21
7.1 Determinación de los niveles de expresión de ARnm para los receptores PAR-1, PAR-3 Y
EPCR en células CAD. ..................................................................................................................... 21
7.2 Determinación de la actividad reductora del MTT en células CAD diferenciadas tratadas
con PCA y C2-ceramida. ................................................................................................................ 25
7.3 Determinación de Apoptosis ............................................................................................. 28
7.3.1 Evaluación del efecto de PCA previo a C2-ceramida en la condensación del ADN de
células CAD diferenciadas ......................................................................................................... 28
7.3.2 Determinación de la actividad de la enzima caspasa-3 en células CAD diferenciadas
tratadas con PCA previo a C2-ceramida. ................................................................................... 31
7.4 Determinación de la fosforilación de AKT en células CAD tratadas con PCA previo a C2-
ceramida. ....................................................................................................................................... 33
8 CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 40
9 Bibliografía ................................................................................................................................ 41
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