diseño químico y genético de biocatalizadores con fines ambientales rafael vazquez-duhalt
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Diseño químico y genético de biocatalizadores con
fines ambientales
Diseño químico y genético de biocatalizadores con
fines ambientales
Rafael Vazquez-DuhaltRafael Vazquez-Duhalt
Desarrollo Tecnológico
ENERGÍA
PROCESOSACTUALESPROCESOSACTUALES
PROCESOSFUTUROS
PROCESOSFUTUROS
AMBIENTE
El petróleo se nos va de las manosEl petróleo se nos va de las manos
Entre 2010 y 2020 será la máxima extracción de petróleo en el mundo, después la inexorable
disminución del recurso no renovable.
(Campbell and Laherrère, 1998, Nature Biotechnology 19: 314-315)
Entre 2010 y 2020 será la máxima extracción de petróleo en el mundo, después la inexorable
disminución del recurso no renovable.
(Campbell and Laherrère, 1998, Nature Biotechnology 19: 314-315)
World Resource Institute, 1996
1900 1950 2000 2050 2100
Disponibilidad de petróleo
Disponibilidad de petróleo
PoblaciónPoblación
45 años65 años
230 añosReservas mundiales a finales de 1995
Gas natural
Petróleo
Carbón
185019001920
1950
1970 1990
2100
2100 2100
2100
2100
0%
0%
0%20%
20%
40%
40% 60%
60%
60%
40%
80%
80%
80%
100%
100%100%
RENOVABLES / NUCLEARRENOVABLES / NUCLEAR
PE
TER
OLE
O / G
AS
PE
TER
OLE
O / G
ASC
ARBO
N
CAR
BON
Historia y Perspectivas del las Fuentes de EnergíaHistoria y Perspectivas del las Fuentes de Energía
A. Grübler (1999) Energy, the next fifty years. OCED.
Consumo energético de diferentes sectores industriales en Francia durante el año 2000.
Ton. eq .de petróleo por añoSector industrial por millón de dólares de v.a. Química mineral y fertilizantes 59.3Siderúrgica 46.2Ciclo del uranio 42.6Papelera 19.2Vidrio 16.9Cementero y materiales de construcción 15.8Química orgánica y farmacéutica 8.5Hulero y transformación de plásticos 5.4Fundición y metalmecánica 4.5Textil 3.8Transportes 2.6Eléctrica y electrónica 1.8Madedero, muebles 2.0
Consumo energético de diferentes sectores industriales en Francia durante el año 2000.
Ton. eq .de petróleo por añoSector industrial por millón de dólares de v.a. Química mineral y fertilizantes 59.3Siderúrgica 46.2Ciclo del uranio 42.6Papelera 19.2Vidrio 16.9Cementero y materiales de construcción 15.8Química orgánica y farmacéutica 8.5Hulero y transformación de plásticos 5.4Fundición y metalmecánica 4.5Textil 3.8Transportes 2.6Eléctrica y electrónica 1.8Madedero, muebles 2.0
Lerey P. Une industrie moins gourmande. Science et Vie. 2001 No. 214, 98-101.
EtilenoEtileno
Toda la industria(uso de energéticos fósiles)Toda la industria(uso de energéticos fósiles)
Mínimo termodinámico para la producción de etilenoMínimo termodinámico para la producción de etileno
19551955 19601960 19651965 19701970 19751975 19851985 1990199019801980
Energía, una fuerza de cambioEnergía, una fuerza de cambio
¿Industriaun riesgo ambiental?
¿Industriaun riesgo ambiental?
US Environmental Protection Agency, Toxic Release Inventory, 2000
Año
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000
Emisones a la atmósfera
Dispersión en aguas superficiales
Infiltración en mantos freáticos
Dispersión en suelos
Transferencia en descargas
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000
Mill
ones
de
libra
s po
r añ
o
Emisones a la atmósfera
Dispersión en aguas superficiales
Infiltración en mantos freáticos
Dispersión en suelos
Transferencia en descargas
Inventario de Sustancias Tóxicas dispersadas en el ambiente en Estados Unidos, 2000
Inventario de Sustancias Tóxicas dispersadas en el ambiente en Estados Unidos, 2000
Emsiones de químicos tóxicos en Estados Unidos durante 1990. Industria Toneladas/año Química 835,000Metalurgia 483,000Papelera 134,000Transportación 107,000Plásticos 98,000Mueblera 63,000Petrolera 57,000Eléctrica 55,000Metalmecánica 30,000Pinturas 26,000Madedera 21,000Textil 17,000
Emsiones de químicos tóxicos en Estados Unidos durante 1990. Industria Toneladas/año Química 835,000Metalurgia 483,000Papelera 134,000Transportación 107,000Plásticos 98,000Mueblera 63,000Petrolera 57,000Eléctrica 55,000Metalmecánica 30,000Pinturas 26,000Madedera 21,000Textil 17,000
US Environmental Protection Agency. Toxics Release Inventory (1990)
HOYAYER MAÑANA
Ambiente, una fuerza de cambioAmbiente, una fuerza de cambio
Tratamientoy
Remediación
Ecología IndustrialEcología Industrial
La Ecología industrial es el estudio por medio de sistemas de ingeniería basado en principios ambientales o ecológicos, que integre a la producción y al consumo aspectos de diseño, proceso, uso y terminado de productos, satisfactores o servicios de una manera en que se minimice el impacto ambiental y la utilización de recursos y energía
La Ecología industrial es el estudio por medio de sistemas de ingeniería basado en principios ambientales o ecológicos, que integre a la producción y al consumo aspectos de diseño, proceso, uso y terminado de productos, satisfactores o servicios de una manera en que se minimice el impacto ambiental y la utilización de recursos y energía
Los industriales deben dejar de ver los productos, efluentes y emisiones como flujos que salen de la
planta y verlos como parte integral y responsabilidad de la compañía.
Los industriales deben dejar de ver los productos, efluentes y emisiones como flujos que salen de la
planta y verlos como parte integral y responsabilidad de la compañía.
Diseño del producto y del procesoDiseño del producto y del proceso
Productos de menor impacto ambiental.Incrementar eficiencias de transformación.Selección de materia primas de menor impacto ambiental.Minimización del uso de recursos.Reciclaje.Integración de los efluentes y emisiones a otros procesos.Uso eficiente de la energía.
Productos de menor impacto ambiental.Incrementar eficiencias de transformación.Selección de materia primas de menor impacto ambiental.Minimización del uso de recursos.Reciclaje.Integración de los efluentes y emisiones a otros procesos.Uso eficiente de la energía.
RETOSRETOS
Responsabilidad Social de los Industriales+
Impuesto sobre Impacto Ambiental (IIA)
C
CH3
CH3
HO OH C
CH3
CH3
O--
O
C
CH3
CH3
-O O
-
Bu4N+Bu4N+
NaOH
H2O
Bu4N+X-
O
CClCl
C
CH3
CH3
OO C
O
x
Síntesis química tradicional de polycarbonatosSíntesis química tradicional de polycarbonatos
FosgenoFosgenoAltamente tóxicoLetalArma química
Altamente tóxicoLetalArma química
Subproductos tóxicosSubproductos tóxicos
+
OHC
CH3
CH3
HO
O
CO O CH3H3C C
CH3
CH3
C
O
O
LipasaLipasa
+x
Síntesis enzimática de ploycarbonatosSíntesis enzimática de ploycarbonatos
Reducción significativa de la toxicidad de las materias primas y productos.Mejor economía estequiométrica (menos subproductos).Proceso energéticamente menos costoso.
Precios de catalizadores industriales.
Enzima Dólares / kg Catalizador Dólares / kg
Deshidrogenasa láctica 100,000 BINAP 40,000Esterasa de hígado porcino 15,000 Platino 12,000Penicilina amidasa 10,000 ChiraPhos 10,000Aspartasa 10,000 Sharpless 10,000Tripsina 5,000 Pd(Diphos)2 5,000Lipasa 5,000 Rh(PPh3)3Cl 2,000Glucosa isomerasa 500 Jacobsen 1,000Proteasa de detergente 250 Chirald 500Glucoamilasa 100 Niquel Raney 30
Precios de catalizadores industriales.
Enzima Dólares / kg Catalizador Dólares / kg
Deshidrogenasa láctica 100,000 BINAP 40,000Esterasa de hígado porcino 15,000 Platino 12,000Penicilina amidasa 10,000 ChiraPhos 10,000Aspartasa 10,000 Sharpless 10,000Tripsina 5,000 Pd(Diphos)2 5,000Lipasa 5,000 Rh(PPh3)3Cl 2,000Glucosa isomerasa 500 Jacobsen 1,000Proteasa de detergente 250 Chirald 500Glucoamilasa 100 Niquel Raney 30
J.D. Rozzell (1999) Bioorg. Med. Chem. 7: 2253-2261. J.D. Rozzell (1999) Bioorg. Med. Chem. 7: 2253-2261.
Nuevas actividaescatalíticas
Nuevas actividaescatalíticas
Diseño racional de enzimas
Diseño racional de enzimas
BioprospecciónBioprospección
Evolución dirigidaEvolución dirigida
Bioprospección
La secuenciación masiva de muestras de ADN ambiental usando sondas universales ha abierto una ventana hacia la sorprendente biodiversidad bacteriana. Ahora sabemos que, aunque el número exacto varie de acuerdo a la fuente, probablemente más del 99% de los componentes bacterianos del suelo y de los oceános son desconocidos.
Bioprospección
La secuenciación masiva de muestras de ADN ambiental usando sondas universales ha abierto una ventana hacia la sorprendente biodiversidad bacteriana. Ahora sabemos que, aunque el número exacto varie de acuerdo a la fuente, probablemente más del 99% de los componentes bacterianos del suelo y de los oceános son desconocidos.
La estrategia consistió en la eficacia de la actividad de nitrilasa para la hidrólisis de cianohidrinas.
La estrategia consistió en la eficacia de la actividad de nitrilasa para la hidrólisis de cianohidrinas.
OH
R CN
OH
R CN
O
R H
HCN
(S)-1 (R)-1
OH
R COOH
(R)-2
De Santis et al. J. Am. Chem. Soc. 2002. 124:9024
Caso de éxito de bioprospeccion en la selección de biocatalizadores enantioselectivos
Caso de éxito de bioprospeccion en la selección de biocatalizadores enantioselectivos
Uno de los organonitrilos utilizados como sustratos fue el mandelonitrilo, precursor del ácido mandélico, compuesto muy utilizado en las industrias farmaceútica y cosmética. Solo 27 de 200 nitrilasas obtenidas en un primer ensayo resolvieron la mezcla de mandelonitrilos en mas de 90% ee. Solo una de ellas fue estudiada en mayor detalle y se lograron obtener eficiencias de >98% ee.
Uno de los organonitrilos utilizados como sustratos fue el mandelonitrilo, precursor del ácido mandélico, compuesto muy utilizado en las industrias farmaceútica y cosmética. Solo 27 de 200 nitrilasas obtenidas en un primer ensayo resolvieron la mezcla de mandelonitrilos en mas de 90% ee. Solo una de ellas fue estudiada en mayor detalle y se lograron obtener eficiencias de >98% ee.
OH
CN
OH
COOHCN
OH
Acido R-mandélico
Una biblioteca numerosa, usualmente en el rango entre 104 y 107, se prepara por mutagenesis al azar del gene entero, recombinacion in vitro o por mutagenesis de una sección subgenómica del gene. La clonación y expresión de la librería resulta en una colección de moléculas de la enzima potencialmente activas que deben ser seleccionadas en función de la actividad enzimática o propiedad determinada.
Una biblioteca numerosa, usualmente en el rango entre 104 y 107, se prepara por mutagenesis al azar del gene entero, recombinacion in vitro o por mutagenesis de una sección subgenómica del gene. La clonación y expresión de la librería resulta en una colección de moléculas de la enzima potencialmente activas que deben ser seleccionadas en función de la actividad enzimática o propiedad determinada.
Evolución dirigidaEvolución dirigida
Gene silvestreD
esem
peño
Dist. en el espacio de secuencia
Mutagenésis al azar
Rondas sucesivas de mutagénesis al azar, recombinación y selección
Selección
Des
empe
ño
Selección
Recombinación
Dist. en el espacio de secuencia
Recombinación
Rondas sucesivas de recombinación y selección
Selección
Des
empe
ño
Selección
Recombinación
Dist. en el espacio de secuencia
Gene silvestre Genes homólogos
Mutagenésis al azar
Rondas sucesivas de mutagénesis al azar y selección
Selección
Selección
Mutagenésis al azar
Caso exitoso de enantioselectividad por evolucion dirigidaCaso exitoso de enantioselectividad por evolucion dirigida
C8H17
NO2
CH3
O
O
C8H17
NO2
CH3
O
O
C8H17
CH3
O
OH
Lipasa de P. aeruginosa
H2O
+
p-nitrofenil 2-metildecanoato Acido S-2-metildecanoico
Resolucion hidrolitica del p-nitrofenil 2-metildecanoatoResolucion hidrolitica del p-nitrofenil 2-metildecanoato
La enzima silvestre cataliza la reaccion con una enantioselectividad hacia el enantiomero S del 2% ee a una tasa de conversión del 50%.La enzima silvestre cataliza la reaccion con una enantioselectividad hacia el enantiomero S del 2% ee a una tasa de conversión del 50%.
Despues de cuatro rondas de PCR mutagénico, se detectaron variantes con un incremento en enantioselectividad de ee = 81%. La clona mas activa se mejoró al mutagenizar a saturación aquellas posiciones seleccionadas en la primera etapa. Se obtuvieron variantes con valores de ee = 90-94% hacia el enantiomero S.
Despues de cuatro rondas de PCR mutagénico, se detectaron variantes con un incremento en enantioselectividad de ee = 81%. La clona mas activa se mejoró al mutagenizar a saturación aquellas posiciones seleccionadas en la primera etapa. Se obtuvieron variantes con valores de ee = 90-94% hacia el enantiomero S.
Liebeton, K. et al. Chem Biol. 2000. 7:709.Liebeton, K. et al. Chem Biol. 2000. 7:709.
Diseño racional de enzimasDiseño racional de enzimas
La estereoespecificidad de las enzimas responde al arreglo espacial de los residuos catalíticos en el sitio activo.
El rediseño racional de los sitios activos permitirá, en principio, modular la enantioselectividad de los mismos en aquellos casos donde los sustratos posean esta propiedad.
El diseño racional implica un conocimiento preciso no solo de la secuencia, sino de la estructura tridimensional. Esta necesidad esta dejando de ser limitante, ya que cuenta con la información estructural de alrededor de 2,000 enzimas diferentes, 80% de las cuáles cuenta con una determinación completa del sitio activo.
La estereoespecificidad de las enzimas responde al arreglo espacial de los residuos catalíticos en el sitio activo.
El rediseño racional de los sitios activos permitirá, en principio, modular la enantioselectividad de los mismos en aquellos casos donde los sustratos posean esta propiedad.
El diseño racional implica un conocimiento preciso no solo de la secuencia, sino de la estructura tridimensional. Esta necesidad esta dejando de ser limitante, ya que cuenta con la información estructural de alrededor de 2,000 enzimas diferentes, 80% de las cuáles cuenta con una determinación completa del sitio activo.
Caso exitoso en el diseño racional del cambio de enantioselectividad
Caso exitoso en el diseño racional del cambio de enantioselectividad
Van den Heuvel et al. PNAS, 2000. 97:9455.
La vanillil-alcohol oxidasa (VAO) convierte preferencialmente 4-etilfenoles y 4-propilfenoles a los correspondientes R-1-(4´-hidroxifenil)alcoholes. El reacomodo simétrico de las cadenas laterales Asp170 y Thr457 involucrados en la activaciòn de una molécula de agua involucrada en la conversión del sustrato permitieron un cambio en selectividad hacia la producción del enantiomero S en 80% ee.
La vanillil-alcohol oxidasa (VAO) convierte preferencialmente 4-etilfenoles y 4-propilfenoles a los correspondientes R-1-(4´-hidroxifenil)alcoholes. El reacomodo simétrico de las cadenas laterales Asp170 y Thr457 involucrados en la activaciòn de una molécula de agua involucrada en la conversión del sustrato permitieron un cambio en selectividad hacia la producción del enantiomero S en 80% ee.
Reducción enzimática del impacto ambiental de residuos industriales
Reducción enzimática del impacto ambiental de residuos industriales
Antraceno
Pireno
Fenantreno
Fluoranteno
Benzo(a)pireno Benzo(e)pireno
Benzo(ghi)perileno Nafto(2,3-a)pireno
O
HO
HO
+
OO
N
N
N
NNH
OHHO
HO
HOCH2O P O
O
O O O
N
N
N
NNH
OCH2 OHPO
O
O
Formación del diolepóxidoFormación del diolepóxido
Oxidación de un electrónOxidación de un electrón
Lignino peroxidasa
Manganeso peroxidasa
Lacasa
Citocromo P450
Veratril alcohol oxidasa
Hongos ligninolíticosHongos ligninolíticos
OCH3
OHHO
OLignin
O
OH
OCH3
OHO
HO
O
OH
OH
CH3O
O O
HO
OCH3
OHOH
O
CH3O
OH
OOH
CH3O
O
O
OCH3O
OHLignin
OCH3
O
OHHO
O
CH3O
OHHO
OCH3
O
CHO
HO
Products from oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbonsby lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium in
vitro.________________________________________________________
PAH Products Ref._________________________________________________________
Anthracene 9,10-Anthraquinone 1Acenaphthene 1-Acenaphthenol 1
1-Acenaphthenone 11-Methylanthracene 1-Methyl-9,10-anthraquinone 12-Methylanthracene 2-Methyl-9,10-anthraquinone 19-Methylanthracene 9-Methyl-9,10-anthraquinone 1
9-Methyl-10-anthranone 19,10-Anthraquinone 1
Pyrene 1,8-Pyrenedione 1, 21,6-Pyrenedione 2
Benzo(a)pyrene 1,6-Benzo(a)pyrenedione 33,6-Benzo(a)pyrenedione 36,12-Benzo(a)pyrenedione 3
_________________________________________________________
Products from oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbonsby lignin peroxidase from Phanerochaete chrysosporium in
vitro.________________________________________________________
PAH Products Ref._________________________________________________________
Anthracene 9,10-Anthraquinone 1Acenaphthene 1-Acenaphthenol 1
1-Acenaphthenone 11-Methylanthracene 1-Methyl-9,10-anthraquinone 12-Methylanthracene 2-Methyl-9,10-anthraquinone 19-Methylanthracene 9-Methyl-9,10-anthraquinone 1
9-Methyl-10-anthranone 19,10-Anthraquinone 1
Pyrene 1,8-Pyrenedione 1, 21,6-Pyrenedione 2
Benzo(a)pyrene 1,6-Benzo(a)pyrenedione 33,6-Benzo(a)pyrenedione 36,12-Benzo(a)pyrenedione 3
_________________________________________________________
1. Vazquez-Duhalt et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 459-4662. Hammel et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 16984-169523. Haemmerli et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6900-6903
1. Vazquez-Duhalt et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 459-4662. Hammel et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 16984-169523. Haemmerli et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6900-6903
In vitro PAH oxidation with manganese peroxidase in lipid peroxidation reactions.
____________________________________________________
Aromatic compound Oxidation rate (nmol/h)____________________________________________________
Fluorene 3.10Benz(a)antrhracene 1.08Benzo(a)pyrene 0.96Anthracene 0.93Dibenz(a,c)anthracene 0.60Benzo(e)pyrene 0.31Diphenylmethane 0.30Benzo(c)phenanthrene 0.21Benzo(b)fluoranthene 0.19Fluoranthene 0.14Phenanthrene 0.06____________________________________________________
In vitro PAH oxidation with manganese peroxidase in lipid peroxidation reactions.
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Aromatic compound Oxidation rate (nmol/h)____________________________________________________
Fluorene 3.10Benz(a)antrhracene 1.08Benzo(a)pyrene 0.96Anthracene 0.93Dibenz(a,c)anthracene 0.60Benzo(e)pyrene 0.31Diphenylmethane 0.30Benzo(c)phenanthrene 0.21Benzo(b)fluoranthene 0.19Fluoranthene 0.14Phenanthrene 0.06____________________________________________________
Bogan et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 2381-2386Bogan et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 2381-2386
Oxidation of aromatic compounds by MnLiP atOxidation of aromatic compounds by MnLiP at
pH 4.0 in the absence of Mn(II).pH 4.0 in the absence of Mn(II).
PAHPAHIonizationIonizationpotentialpotential
(eV)(eV) aa
SpecificSpecificactivityactivity(min(min -1-1))
9-Methylanthracene9-Methylanthracene 7.257.25 52 (52 ( ±± 2.7)2.7) b b1-Methylanthracene1-Methylanthracene NANA cc 22.422.4 ±± (1.7)(1.7)2-Methylanthracene2-Methylanthracene 7.377.37 12.4 (12.4 ( ±± 1.1)1.1)AnthraceneAnthracene 7.417.41 2.5 (2.5 ( ±± 0.01)0.01)Benzo(a)pyreneBenzo(a)pyrene 7.417.41 0.32 (0.32 ( ±± 0.04)0.04)PyrenePyrene 7.427.42 0.008 (0.008 ( ±± 0.01)0.01)Benzo(e)pyreneBenzo(e)pyrene 7.437.43 NRNR ddChryseneChrysene 7.607.60 NRNRCarbazolCarbazol 7.687.68 2.4 (2.4 ( ±± 0.05)0.05)1-Methylphenanthrene1-Methylphenanthrene 7.707.70 NRNRAcenaphtheneAcenaphthene 7.767.76 NRNRPhenanthrenePhenanthrene 7.917.91 NRNRDibenzothiopheneDibenzothiophene 7.937.93 NRNRFluorantheneFluoranthene 7.957.95 NRNRNaphthaleneNaphthalene 8.158.15 NRNR
Kinetic constants of purified cytochrome P448 from Saccharomyces cerevisiea for oxidation of
benzo(a)pyrene._____________________________________________
System kcat (min-1) KM (µM) _____________________________________________
Reconstituted with NADPH 0.017 33Cumene hydroperoxide 0.022 125Hydrogen peroxide in situ 0.034 200
_____________________________________________
Kinetic constants of purified cytochrome P448 from Saccharomyces cerevisiea for oxidation of
benzo(a)pyrene._____________________________________________
System kcat (min-1) KM (µM) _____________________________________________
Reconstituted with NADPH 0.017 33Cumene hydroperoxide 0.022 125Hydrogen peroxide in situ 0.034 200
_____________________________________________
King et al. (1984) Xenobiotica 14: 187-206Azari and Wiseman (1982) Enzyme Microb. Technol. 4: 401-404
Specific activity of yeast cytochrome c on aromatic compounds. _____________________________________________________
Aromatic Specific activitycompound Product (min-1)_____________________________________________________
Dibenzothiophene Dibenzothiophene sulfoxide 3.2 (±0.1)Anthracene 9,10-Anthraquinone 2.1 (±0.1)Pyrene 1,8-Pyrenodione 1.3 (±0.3)Benzothiophene Benzothiophene sulfoxide 1.0 (±0.2)Carbazole Unknown 0.9 (±0.1)Acenaphthene NRChrysene NRFluoranthrene NRFluorene NRPhenanthrene NRTriphenylene NR_____________________________________________________
NR, no reaction detected.
Specific activity of yeast cytochrome c on aromatic compounds. _____________________________________________________
Aromatic Specific activitycompound Product (min-1)_____________________________________________________
Dibenzothiophene Dibenzothiophene sulfoxide 3.2 (±0.1)Anthracene 9,10-Anthraquinone 2.1 (±0.1)Pyrene 1,8-Pyrenodione 1.3 (±0.3)Benzothiophene Benzothiophene sulfoxide 1.0 (±0.2)Carbazole Unknown 0.9 (±0.1)Acenaphthene NRChrysene NRFluoranthrene NRFluorene NRPhenanthrene NRTriphenylene NR_____________________________________________________
NR, no reaction detected.
Torres et al. (1995) Enzyme Microb. Technol. 17: 1014-1020Torres et al. (1995) Enzyme Microb. Technol. 17: 1014-1020
Biocatalytic oxidation of aromatic compounds by hemoglobin and hydrogen peroxide.
___________________________________________________ Reacted
Compound substrate (%) Product___________________________________________________
9-Hexylanthracene 100 9,10-AnthraquinoneAnthracene 91 (± 4) 9,10-AnthraquinoneCarbazole 84 (±28) UnknownPyrene 85 (±10) 1,8-PyrenodioneDibenzothiophene 74 (± 1) Dibenzothiophene
sulfoxideFluorene 49 (±30) 9-FluorenoneAcenaphthene NRChrysene NRDibenzofuran NRFluoranthene NRPhenanthrene NR___________________________________________________
Biocatalytic oxidation of aromatic compounds by hemoglobin and hydrogen peroxide.
___________________________________________________ Reacted
Compound substrate (%) Product___________________________________________________
9-Hexylanthracene 100 9,10-AnthraquinoneAnthracene 91 (± 4) 9,10-AnthraquinoneCarbazole 84 (±28) UnknownPyrene 85 (±10) 1,8-PyrenodioneDibenzothiophene 74 (± 1) Dibenzothiophene
sulfoxideFluorene 49 (±30) 9-FluorenoneAcenaphthene NRChrysene NRDibenzofuran NRFluoranthene NRPhenanthrene NR___________________________________________________
Ortiz-Leon et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 215: 968-973Ortiz-Leon et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 215: 968-973
Benzo(a)pirenodiona
282.1
254.1
226.1
224.1113.1
0
20
40
60
80
100
120
20 67 108 152 193 233 274
m/z
Abu
ndan
cia
rela
tiva O
O
1,8-Pirenodiona
88.1
150.1
176.1
204.1
232.1
0
20
40
60
80
100
120
26 63 94 125 155 183 213 245 284
m/z
Ab
un
dan
cia
rela
tiva
O O
O
O
OO
O
O
Lignino peroxidasaManganeso peroxidasaHemoglobinaCitocromo c
Lignino peroxidasaManganeso peroxidasaHemoglobinaCitocromo c
H2O2H2O2
Oxidación biocatalítica de hidrocarburos aromáticos policiclicos
por hemoproteínas
Oxidación biocatalítica de hidrocarburos aromáticos policiclicos
por hemoproteínas
Minimum mutagenic concentration of polycyclic aromatic hydrocarbons and their respective quinones.
Compound MMC (ng/ml)
Cyclopenta(cd)pyrene 1.8Cyclopenta(cd)pyrenedione 2600
Phenanthrene -Phenanthrenedione -
Benzo(a)anthracene 570Benzo(a)anthraquinone -
Chrysene 750Chrysene quinone -
Benzo(a)pyrene 141,6- Benzo(a)pyrenedione -3,6- Benzo(a)pyrenedione -4,5- Benzo(a)pyrenedione -
Minimum mutagenic concentration of polycyclic aromatic hydrocarbons and their respective quinones.
Compound MMC (ng/ml)
Cyclopenta(cd)pyrene 1.8Cyclopenta(cd)pyrenedione 2600
Phenanthrene -Phenanthrenedione -
Benzo(a)anthracene 570Benzo(a)anthraquinone -
Chrysene 750Chrysene quinone -
Benzo(a)pyrene 141,6- Benzo(a)pyrenedione -3,6- Benzo(a)pyrenedione -4,5- Benzo(a)pyrenedione -
Durant et al. 1996 Mutation Res. 371:123-157Durant et al. 1996 Mutation Res. 371:123-157
Horse heart cytochrome c
Modificación química
Herraminta para mejorar el rango de sustratos y la termoestabilidad
Modificación química
Herraminta para mejorar el rango de sustratos y la termoestabilidad
PEG
PEGPEG
PEG
PEG
PEG
PEG PEG
PEGPEG
Specific activity on polycyclic aromatic hydrocarbon oxidation with modified and unmodified cytochrome c.
__________________________________________________________________________
Specific activity (min-1) ___________________________________________________________
Aromaticcompound Cyt Cyt-Met PEG-Cyt PEG-Cyt-Met Cyt-TMS PEG-Cyt-TMS__________________________________________________________________________
Pyrene 0.51 0.26 2.78 0.97 0.69 1.21Anthrecene 0.33 0.35 6.62 3.09 0.72 4.47Benzo(a)pyrene 0.22 0.09 5.15 0.39 1.40 0.26Fluoranthene NR NR ND 0.65 ND 1.16Fluorene NR NR NR 0.22 NR NRPhenanthrene NR NR NR 0.17 NR NR__________________________________________________________________________
ND. Not determinedNR. No reaction detected
Tinoco and Vazquez-Duhalt (1998) Enzyme Microb. Technol. 22: 8-12
Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbon by unmodified- and methylated poly(ethylene)glycol-modified-cytochrome c.
_______________________________________________________________
Specific activity (min-1) ________________________________________
Aromatic compound Unmodified PEG-Cyt-Met_______________________________________________________________
7,12-Dimethylbenzanthracene 24.59 (±1.52) 80.33 (±3.83)1,2:3,4-Dibenzanthracene NR 16.60 (±2.24)Azulene 2.26 (±0.29) 14.32 (±0.57)3-Methylcholanthrene 1.88 (±0.07) 10.96 (±0.54)7-Methylbenzo(a)pyrene NR 7.56 (±0.42)1,2:5,6-Dibenzanthracene NR 5.70 (±0.31)Triphenylene NR 5.27 (±1.05)Dibenzothiophene 0.67 (±0.06) 4.73 (±0.05)Anthracene 0.33 (±0.06) 3.09 (±0.32)Thianthrene 0.49 (±0.06) 1.41 (±0.08)Pyrene 0.51 (±0.05) 0.97 (±0.03)Fluoranthene NR 0.65 (±0.09)Acenaphthene NR 0.40 (±0.01)Benzo(a)pyrene 0.22 (±0.02) 0.39 (±0.06)Fluorene NR 0.22 (±0.01)Phenanthrene NR 0.17 (±0.02)Chrysene NR NR9,10-Dimethylanthracene NR NRNaphthalene NR NRBiphenyl NR NR_______________________________________________________________
NR. No reaction detected
Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbon by unmodified- and methylated poly(ethylene)glycol-modified-cytochrome c.
_______________________________________________________________
Specific activity (min-1) ________________________________________
Aromatic compound Unmodified PEG-Cyt-Met_______________________________________________________________
7,12-Dimethylbenzanthracene 24.59 (±1.52) 80.33 (±3.83)1,2:3,4-Dibenzanthracene NR 16.60 (±2.24)Azulene 2.26 (±0.29) 14.32 (±0.57)3-Methylcholanthrene 1.88 (±0.07) 10.96 (±0.54)7-Methylbenzo(a)pyrene NR 7.56 (±0.42)1,2:5,6-Dibenzanthracene NR 5.70 (±0.31)Triphenylene NR 5.27 (±1.05)Dibenzothiophene 0.67 (±0.06) 4.73 (±0.05)Anthracene 0.33 (±0.06) 3.09 (±0.32)Thianthrene 0.49 (±0.06) 1.41 (±0.08)Pyrene 0.51 (±0.05) 0.97 (±0.03)Fluoranthene NR 0.65 (±0.09)Acenaphthene NR 0.40 (±0.01)Benzo(a)pyrene 0.22 (±0.02) 0.39 (±0.06)Fluorene NR 0.22 (±0.01)Phenanthrene NR 0.17 (±0.02)Chrysene NR NR9,10-Dimethylanthracene NR NRNaphthalene NR NRBiphenyl NR NR_______________________________________________________________
NR. No reaction detected
Tinoco and Vazquez-Duhalt (1998) Enzyme Microb. Technol. 22: 8-12
Native Cyt
PEG-Cyt-Met
Low spin spectrum(g = 3.05, 2.25, 1.25)Low spin spectrum(g = 3.05, 2.25, 1.25)
High spin species(g = 6.06, 2.00)
and low spin heme(g = 4.3)
High spin species(g = 6.06, 2.00)
and low spin heme(g = 4.3)
PEG-Cyt-Met
Cyt c
Methionine ligand is replaced by waterMethionine ligand is replaced by water
Busi et al. (2000) J. Mol. Cat. B: Enzymatic 9: 39-48
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7
Time (h)
Re
sid
ual
act
ivity
(%
) cyt-peg w/subst.
cyt-peg wo/subst.
cyt-wt w/subst.
cyt-wt wo/subst.
Thermal stability of horse heart cytochrome at 80ºCThermal stability of horse heart cytochrome at 80ºC
cyt-wt
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
anci
a
30°C, t=0
80°C, t=0
80°C, 7 hr
80°C, t=7hr, - 30°C
cyt-peg
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
200 250 300 350 400 450 500 550 600
Longitud de onda (nm)
Ab
sorb
anci
a
30°C,t=0
80°C,t=0
80°C,t=7 hr
80°C,t=7 hr -30°C
Active site thermostability of cytochrome cActive site thermostability of cytochrome c
Abs
orba
nce
Abs
orba
nce
Wavelength (nm)
Gracia-Arellano et al. 2002 Bioconjugate Chem. (In press)
Circular dichroism of unmodified and modified cytochrome c during incubation at 80ºC
Circular dichroism of unmodified and modified cytochrome c during incubation at 80ºC
-1.5E+04
-1.0E+04
-5.0E+03
0.0E+00
5.0E+03
1.0E+04
1.5E+04
2.0E+04
190 200 210 220 230 240 250 260
Longitud de onda (nm)
MR
W ((g
ra
do
s*c
m2 )
/dm
ol)
30ºC
80ºC
80ºC 7h
80ºC 24h
30ºC (80ºC 24h)
-1.5E+04
-1.0E+04
-5.0E+03
0.0E+00
5.0E+03
1.0E+04
1.5E+04
2.0E+04
190 200 210 220 230 240 250 260
Longitud de onda (nm)
MR
W ((g
ra
do
s*c
m2 )
/dm
ol)
30ºC
80ºC
80ºC 7h
80ºC 24h
30ºC (80ºC 24h)
Cyt-WtCyt-Wt Cyt-Peg(5000)Cyt-Peg(5000)
Gracia-Arellano et al. 2002 Bioconjugate Chem. (In press)
Plaguicidas, un problema ambientalPlaguicidas, un problema ambiental
2.5 millones de toneladas usadas anualmente en 19905 millones de intoxicados anuales45,000 muertes anualmente1% de los fallecimientos en los países desarrollados (80% del consumo)20% de los intoxicados mueren en los países subdesarrollados
Terbufos
Phosmet Azinphos methyl
ParathionDEF
N
NN
OC
NC
O
O
P
SCH3O
CH3O
CH2P
SCH3O
CH3O
S CH2
P
SCH3CH2O
CH3CH2OS CH2 S C(CH3)3
OP
SCH3O
CH3O
NO2P
S
S
OS
P
SCH3O
CH3OS C
COOCH2CH3
H
COOCH2CH3
Malathion
Plaguicidas organofosforadosPlaguicidas organofosforados
Fungi Metabolism (%)
B. adusta 4312 49.0 ± 4.2
B. adusta 7308 49.0 ± 5.5
B. adusta 8258 78.3 ± 3.6
G. applanatum 8168 ND
P. ostreatus 7964 44.5 ± 4.1
P. ostreatus 7980 44.5 ± 4.7
P. ostreatus 798 18.4 ± 4.0
P. ostreatus 7989 96.9 ± 2.9
P. ostreatus 7972 32.3 ± 3.1
P. ostreatus 7992 26.0 ± 2.5
P. ostreatus IE8 48.5 ± 2.3
P .chrysosporium FC-322 10.5 ± 3.0
P .chrysosporium 3641 55.0 ± 2.1
P. chrysosporium 3642 28.6 ± 2.5
P. chrysosporium ATCC 24725 30.0 ± 2.0
S. pulverulentem 4521 7.7 ± 3.2
C. gallica 8260 28.5 ± 2.5
Parathion degradation by 18 strains of white rot
fungi after 96 hrs culture Parathion degradation by 18 strains of white rot
fungi after 96 hrs culture
Specific depletion rates of five organophosphorus pesticides by three ligninolytic fungi strains
Specific depletion rates of five organophosphorus pesticides by three ligninolytic fungi strains
Depletion rate (mmol g dry wt-1 hr-1)
Fungi Parathion Azinphos-methyl Phosmet Terbufos Tribufos
B. adusta 8258 217 ± 10 223 ± 8 220 ± 2 23 ± 9 84 ±8
P. ostreatus 7989 169 ± 4 106 ± 6 103 ± 4 59 ± 5 25 ± 2
P. chrysosporium 3641 145 ± 6 203 ± 8 45 ± 3 17 ± 7 25 ± 2
Specific activity (mol min-1mg protein-1)
Fungi Enzyme Ligninolytic Non ligninolytic Medium a Medium b
B. adusta 8258 Laccase 7 Nd
Mn-peroxidase 35 12 Lignin peroxidase 112 23
P. ostreatus 7989 Laccase 250 6
Mn-peroxidase 100 Nd Lignin peroxidase Nd Nd
P. chrysosporium 3641 Laccase Nd Nd
Mn-peroxidase 30 3 Lignin peroxidase 4 Nd
Activities of ligninolytic enzyme in the extracellular concentratefrom liquid cultures of three different white rot fungi.
Activities of ligninolytic enzyme in the extracellular concentratefrom liquid cultures of three different white rot fungi.
Nd. Not detected
Phosmet
Product
Product
Product
Microsomal oxidation of Phosmet by succesive additions od NADPH
Microsomal oxidation of Phosmet by succesive additions od NADPH
Organophosphorus pesticide transformation with microsmal
perparation from Pleurotus ostreatus
Organophosphorus pesticide transformation with microsmal
perparation from Pleurotus ostreatus
Pesticide Specific rate (mmol mg prot-1 hr-1)
Phosmet 10.0 ± 2
Azinphos-methyl 2.2 ± 0.7
Terbufos 5.7 ± 0.95
Pesticide Specific rate (mmol mg prot-1 hr-1)
Phosmet 10.0 ± 2
Azinphos-methyl 2.2 ± 0.7
Terbufos 5.7 ± 0.95
0
20
40
60
80
100
0 0,1 1 5
Inhibitor concentration (mM)
Spe
cific
met
abol
ism
rat
e (µ
mol
/g d
ry w
t/h)
Miconazole
1-aminobenzotreazole
Metyrapone
Effect of cytochrome P450 inhibitors on the degradation of phosmet pesticide by microsomal fraction from P.
ostreatus 7989.
Effect of cytochrome P450 inhibitors on the degradation of phosmet pesticide by microsomal fraction from P.
ostreatus 7989.
3-M ethy len-4-ke tobenzotriazine
P
CH3O
CH3O
S
S
CH2 N
O
NN
P
CH3O
CH3O
S
O
CH2 N
O
NN
PCH3O
CH3O
S
S
CH2
N
O
NN
CH2
+
+
P
CH3O
CH3O
S
S
CH2 NC
O
C
O
P
S
S
CH3CH2O
CH3CH2O
CH2 S C(CH3)3
P
CH3O
CH3O
O
CH
OH
C Cl
Cl
Cl
NC
O
C
O
H
P
CH3O
CH3O
S
S C
COOCH2CH3
H
C
O
OH
+ PCH3O
CH3O
S
S
CH2
P
SCH3CH2O
CH3CH2O
SH + S C(CH3)3CH3
P
CH3O
CH3O
O
C
O
C
Cl
Cl
H
P hosm et
M ala th ion
T erbufos
T rich lorfon
N
O
NN
H
4-K etobenzotriazine
Az inphos-m e thyl oxon O ,O ,S - T rim ethyl d ithiophosphate
P htha lim ide
2,2-D ich loro-1-ke tone e thyl,
phosphoric ac id d im ethyl ester
B u tanedioic ac id ,
[(d im ethoxyphosphinoth ioyl)]-4-e thy l ester
O ,O ,S - Trim ethy l dithiophosphate
3,3-D im ethy l-2-th iabutaneD iethy l phosphorod ith io ic ac id
H
COOCH2CH3
COOCH2CH3
CS
S
CH3O
CH3O
P
A zinphos-m ethy l
Productos de la degradación enzimática de plaguicidas organofosforados con
citocromo P450 de Bjerkandera adusta
Productos de la degradación enzimática de plaguicidas organofosforados con
citocromo P450 de Bjerkandera adusta
Impacto Ambiental de los colorantes IndustrialesImpacto Ambiental de los colorantes Industriales
700,000 Toneladas por año son producidas en todo el mundo (Zollinger, 1987)
125 Toneladas por día son dispersadas en el ambiente por medio de las aguas residuales (Vaidya et al. 1982)
Los cuerpos de agua receptores se colorean aún con bajas concentraciones de colorante (Pagga et al. 1986)
Suelos y vegetación, incluyendo zonas agrícolas son afectados (Nelson et al., 1980)
700,000 Toneladas por año son producidas en todo el mundo (Zollinger, 1987)
125 Toneladas por día son dispersadas en el ambiente por medio de las aguas residuales (Vaidya et al. 1982)
Los cuerpos de agua receptores se colorean aún con bajas concentraciones de colorante (Pagga et al. 1986)
Suelos y vegetación, incluyendo zonas agrícolas son afectados (Nelson et al., 1980)
Clasificación de los colorantes.Clasificación de los colorantes.
NH 4
+
N
HN NH
NO
O
O
O -
O O
N
H H
Murexida. Polimetino del grupo de oxonoles.
HOOC
COOCH 3
Bixin. Derivado de - caroteno.
N
N
CN
O2NO C H3
NHCOCH3
N (C2H 5) 2
CN
Compuestos azo.Compuestos azo.
Polimetinos y polienos.Polimetinos y polienos.
Di- y triarilmetanos.Di- y triarilmetanos.+
N N (CH )
C
(H C )3 2 3 2
Verde de malaquita (C. I. Verde básico 4)
+
2( H 3C )2
N N (C H 3 )
C
N H2
Auramina O (C. I. Amarillo básico 2)
Heterocíclicos nitrados y azufrados.Heterocíclicos nitrados y azufrados.
NH NH NO 2
O2N
H O 2 S
Amarillo Amido E (C. I. Anaranjado ácido 3)
H O3SS
H 3CO N
N
NH O
CH 3
C6H 5
N
Anaranjado Brillante Dicolita 3G (C. I. Anaranjado azufre condensado 2)
Anulenos.Anulenos.
N N
NN
M
M = Zn , Cu , Fe
Estructura general de un tetra aza anuleno.
M = Z n, C u, Fe
N N
NN
N
N
N NM
Estructura general de un octa aza anuleno.
Antraquinonas.Antraquinonas.O
N
N
O
O
O
H
H
Primer colorante “a la cuba” basado en antraquinona
Indantrona.
N
H
O
N
H
O
Colorante natural.
Indigo.
C. gallica P. chrysosporium P. ostratus T. versicolor
C. gallica P. chrysosporium P. ostratus T. versicolor
t = 0
t = 1 semana
Metabolic de Metabolic decolorizationcolorization Enzymatic decolorization Enzymatic decolorization
DyeDyeP. chrysosporiumP. chrysosporium P. ostreatusP. ostreatus P. ostreatusP. ostreatus T. hispidaT. hispida
(ATCC-24725) (ATCC-24725) (IE8) (IE8) (IE8) (IE8) (8260) (8260)
BASFBASFAcid black 194Acid black 194 ++ ++ ++ ++Acid blue 185Acid blue 185 -- ++ ++ ++Direct black 22Direct black 22 NANA NANA -- ++Disperse blue 56Disperse blue 56 ++ ++ -- ++Disperse blue 79Disperse blue 79 NANA NANA -- ++Disperse orange 30Disperse orange 30 -- -- -- --Disperse yellow 54Disperse yellow 54 -- ++ -- --Disperse red 161Disperse red 161 -- -- -- --Reactive blue 19Reactive blue 19 -- ++ -- ++Reactive blue 198Reactive blue 198 -- ++ ++ ++Reactive red 141Reactive red 141 -- -- -- --Reactive red 180Reactive red 180 -- -- -- --Reactive yellow 84Reactive yellow 84 -- -- -- --Sulfur black 1Sulfur black 1 ++ ++ -- ++Vat blue 6Vat blue 6 ++ ++ -- --Vat red 10Vat red 10 -- ++ -- --Vat yellow 46Vat yellow 46 -- ++ -- --
COLORFANCOLORFANOrisol black 2VOrisol black 2V NANAaa NANA -- ++Orisol blue BHOrisol blue BH ++ ++ ++ ++Orisol orange SOrisol orange S -- -- -- --Orisol scarlet 4BSOrisol scarlet 4BS -- -- -- --Orisol turquoise JLOrisol turquoise JL -- ++ ++ ++Orisol yellow 4JLZOrisol yellow 4JLZ -- -- -- --
aa Not assayed Not assayed
Reyes et al. 1999 Current Microbiol. 38: 27-32Reyes et al. 1999 Current Microbiol. 38: 27-32
Dye decolorization in vivo by fungal cultures on agar medium and in vitro by crude extracts from fungal cultures grown on oat grains
Dye decolorization in vivo by fungal cultures on agar medium and in vitro by crude extracts from fungal cultures grown on oat grains
Enzymatic activities of crude extracts from solid cultures of different fungi grown on oat grains.
__________________________________________________________________________
Volumetric activity (U/l) a
__________________________________________________________________
Strains Laccase Mn-peroxidase VAO __________________________________________________________________________
B. adusta (4312) b nd c nd 54 - 160B. adusta (7308) 5 - 7 66 - 70 ndB. adusta (8258) 6 - 18 126 - 22 ndP.ostreatus (7964) 83 - 181 59 - 75 ndP.ostreatus (7972) 151 - 223 21 - 81 ndP.ostreatus (7980) 109 - 421 47 - 61 24 - 97P.ostreatus (7988) 235 - 588 77 - 157 ndP.ostreatus (7989) 287 - 427 97 - 108 41 - 42P. ostreatus (7992) 134 - 215 78 - 253 ndP. ostreatus (IE8) 403 - 1272 49 - 67 ndP. chrysosporium (3541) nd nd ndP. chrysosporium (3642) nd nd ndP. chrysosporium (ATCC-24725) nd nd ndS. pulverulentem (4521) nd nd ndT. hispida (8260) 1184 - 1766 78 - 99 ndT. versicolor (8272) 86 - 1042 39 - 96 nd_________________________________________________________________________
Enzymatic activities of crude extracts from solid cultures of different fungi grown on oat grains.
__________________________________________________________________________
Volumetric activity (U/l) a
__________________________________________________________________
Strains Laccase Mn-peroxidase VAO __________________________________________________________________________
B. adusta (4312) b nd c nd 54 - 160B. adusta (7308) 5 - 7 66 - 70 ndB. adusta (8258) 6 - 18 126 - 22 ndP.ostreatus (7964) 83 - 181 59 - 75 ndP.ostreatus (7972) 151 - 223 21 - 81 ndP.ostreatus (7980) 109 - 421 47 - 61 24 - 97P.ostreatus (7988) 235 - 588 77 - 157 ndP.ostreatus (7989) 287 - 427 97 - 108 41 - 42P. ostreatus (7992) 134 - 215 78 - 253 ndP. ostreatus (IE8) 403 - 1272 49 - 67 ndP. chrysosporium (3541) nd nd ndP. chrysosporium (3642) nd nd ndP. chrysosporium (ATCC-24725) nd nd ndS. pulverulentem (4521) nd nd ndT. hispida (8260) 1184 - 1766 78 - 99 ndT. versicolor (8272) 86 - 1042 39 - 96 nd_________________________________________________________________________
Reyes et al. 1999 Current Microbiol. 38: 27-32
Dye decolorization by crude extracts from solid cultures of differents fungi grown on oat grains._________________________________________________________________________________________
Decolorization activitya (A min-1 l-1)_____________________________________________________________
Strains Reactive Acid Acid Orisol Orisol blue 198 blue 185 black 194 blue turquoise
________________________________________________________________________________________
B. adusta (4312)b ndc nd nd nd ndB. adusta (7308) 940 - 1800 520 - 667 nd nd 133 - 180B. adusta (8258) nd nd nd nd ndP. ostreatus (7964) 1300 - 2220 440 - 580 nd nd 560 - 1040P. ostreatus (7972) 1040 - 3320 140 - 460 0 - 160 0 -180 400 - 480P. ostreatus (7980) 8080 - 8420 1440 0 - 100 0 - 400 2040 - 3000P. ostreatus (7988) 4180 -10160 1580 - 3500 0 - 360 180 - 600 1800 - 6060P. ostreatus (7989) 3860 - 6660 880 - 1960 0 - 460 160 - 320 1060 - 2580P. ostreatus (7992) 1580 - 1820 60 - 600 0 - 40 0 - 260 0 - 780P. ostreatus (IE8) 1060 - 9500 1160 - 2500 130 - 500 650 - 900 1200 - 2300P. chrysosporium (3541) nd nd nd nd ndP. chrysosporium (3642) nd nd nd nd ndP. chrysosporium (ATCC-24725) nd nd nd nd ndS. pulverulentem (452 nd nd nd nd ndT. hispida (8260) 14020 - 21700 2640 - 12840 420 - 740 240 - 780 2840 - 3720T. versicolor (8272) 3480 - 14540 400 - 1220 0 - 840 360 - 840 480 - 900_________________________________________________________________________________________
Dye decolorization by crude extracts from solid cultures of differents fungi grown on oat grains._________________________________________________________________________________________
Decolorization activitya (A min-1 l-1)_____________________________________________________________
Strains Reactive Acid Acid Orisol Orisol blue 198 blue 185 black 194 blue turquoise
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B. adusta (4312)b ndc nd nd nd ndB. adusta (7308) 940 - 1800 520 - 667 nd nd 133 - 180B. adusta (8258) nd nd nd nd ndP. ostreatus (7964) 1300 - 2220 440 - 580 nd nd 560 - 1040P. ostreatus (7972) 1040 - 3320 140 - 460 0 - 160 0 -180 400 - 480P. ostreatus (7980) 8080 - 8420 1440 0 - 100 0 - 400 2040 - 3000P. ostreatus (7988) 4180 -10160 1580 - 3500 0 - 360 180 - 600 1800 - 6060P. ostreatus (7989) 3860 - 6660 880 - 1960 0 - 460 160 - 320 1060 - 2580P. ostreatus (7992) 1580 - 1820 60 - 600 0 - 40 0 - 260 0 - 780P. ostreatus (IE8) 1060 - 9500 1160 - 2500 130 - 500 650 - 900 1200 - 2300P. chrysosporium (3541) nd nd nd nd ndP. chrysosporium (3642) nd nd nd nd ndP. chrysosporium (ATCC-24725) nd nd nd nd ndS. pulverulentem (452 nd nd nd nd ndT. hispida (8260) 14020 - 21700 2640 - 12840 420 - 740 240 - 780 2840 - 3720T. versicolor (8272) 3480 - 14540 400 - 1220 0 - 840 360 - 840 480 - 900_________________________________________________________________________________________
Reyes et al. 1999 Current Microbiol. 38: 27-32
0
40
80
120
160
200
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Actividad laccasa (U/mg)
A
min
-1 mg-1
)
Actividad decolorativa Azul E-3R vs. actividad laccasa.Actividad decolorativa Azul E-3R vs. actividad laccasa.
Laccase I and laccase II separation from a strong anion exchanger column
Laccase I and laccase II separation from a strong anion exchanger column
Purificación laccasa de T. hispida (SDS-PAGE 10%).
E. 2a. cromatografía en DEAE-celulosa.
C. 1a. cromatografía de DEAE-celulosa.
D. Permeación en gel. Sephadex G-100.
A. Extracto crudo.
B. Extracto crudo concentrado.
F. Marcadores de peso molecular.
A B C D E F
Laccasa
116 00097 00084 00068 00055 000
45 000
36 000
29 000
24 000
20 000
PM (Da)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
(nm)
Ab
sorb
an
ce
0 min
2 min
4 min
Decolorization of Reactive blue 198 by purified laccase from C. gallica
Decolorization of Reactive blue 198 by purified laccase from C. gallica
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
350 450 550 650 750
(nm)
Ab
sorb
an
ce
Without laccaseUnder N2
Air
Decolorization of Reactive blue 198 by laccase in the presence and in tha absence of oxygen
Decolorization of Reactive blue 198 by laccase in the presence and in tha absence of oxygen
(nm)
Ab
sorb
an
cia
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
350 450 550 650 750
0 min
5 min
Decoloración del azul recativo 19 con lacasa de C. gallica
Decoloración del azul recativo 19 con lacasa de C. gallica
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600 800 1000
Tiempo (min)
Lacasa
control
% c
olo
r
Decoloración del azul reactivo 198 en una columna con lacasa
inmovilizada
Decoloración del azul reactivo 198 en una columna con lacasa
inmovilizada
Reyes et al. 1999 Biotechnol. Lett. 21: 875-880
0
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600 800 1000 1200
Time (min)
Laccase
Control
% c
olo
r
Reyes et al. 1999 Biotechnol. Lett. 21: 875-880
Decolorization of a real industrial effluent by immobilized laccase
Decolorization of a real industrial effluent by immobilized laccase
N
S
N
CH2CH3
HO3S S
N
N
CH2CH3
SO3H
N
N
N
OH
ABTS HBT
O2
H2O
Laccase (Cu+)
Laccase (Cu++)
Mediator(Ox)
Mediator(Red)
Substrate
Product
Free Radical MediatorsFree Radical Mediators
Bourbonnais and Paice (1992) Appl. Environ. Biotechnol. 36: 823-827
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
1 mM HBT
1 mM ABTS
1 mM ABTS + 1 mM HBT
Pickard et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 3805-3809
Anthracene oxidation by purified laccase
from Coriolopsis gallica
Anthracene oxidation by purified laccase
from Coriolopsis gallica
Time (h)
Ant
hrac
ene
(% r
emai
ning
)
“Hasta hoy, el hombre se ha enfrentado con la naturaleza;
a partir de ahora lo hará contra su propia naturaleza”.
“Hasta hoy, el hombre se ha enfrentado con la naturaleza;
a partir de ahora lo hará contra su propia naturaleza”.
Dennis Gabor, fisico húngaro (1900-1979)
Premio Nobel 1971 por su investigación y desarrollo de la holografía.
Dennis Gabor, fisico húngaro (1900-1979)
Premio Nobel 1971 por su investigación y desarrollo de la holografía.
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