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DiagnDiagnóóstico de stico de
Bacterias fitopatBacterias fitopatóógenasgenas
27 de mayo de 2011
Ing. Agr. María José Montelongo
OBJETIVOS
• Recordar las características de las bacterias fitopatógenas
• Recordar la clasificación de las bacterias
• Reconocer síntomas y signos más comunes de las enfermedades bacterianas
• Conocer el proceso de diagnóstico de una enfermedad bacteriana
Algunos agentes fitopatógenos en una célula vegetal
• Procariotas unicelulares– Cápsula – Pared celular compleja– Membrana citoplasmática– Citoplasma– Material genético nuclear y
extranuclear
• Flageladas• La mayoría Gram-• Variabilidad genética
– transformación, conjugación, transducción y mutación
Bacterias fitopatógenas
Bacterias fitopatógenas
•Se reproducen por fisión binaria•Alta tasa de multiplicación
• La mayoría tienen forma de bacilo (1-2μm x <1μm)• Hay bacterias filamentosas
Bacterias fitopatógenas
Streptomyces spp. causante de la sarna de la papa: filamentosa
Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas y Xanthomonas: bacilos
• Saprófitos facultativos: se multiplican en el huésped, pero pueden sobrevivir en restos y en el suelo. Algunas se consideran habitantes del suelo (Pseudomonas, Agrobacterium, Streptomyces).
• Parásitos obligados: bacterias fastidiosas, limitadas al xilema o floema y Mollicutes(fitoplasmas y espiroplasmas)
Bacterias fitopatógenas
MAYORÍA
Nocardia
Curtobacterium
Clave de identificación de los géneros de bacterias fitopatógenas
(TRIGIANO, R. et al 2008 Plant pathology, concepts and laboratory exercises)
Bacterias Gram positivas
(TRIGIANO, R. et al 2008 Plant pathology, concepts and laboratory exercises)
Bacterias Gram negativas
(TRIGIANO, R. et al 2008 Plant pathology, concepts and laboratory exercises)
Se aceptaba que numerosas enfermedades de plantas que producían amarillamientos eran causadas por virus:
SintomatologíaTransmisión por insectosMultiplicación en plantas e insecto vectorEl agente causal era filtrable y se transmitía por injerto
Mollicutes Fitopatógenos
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
En 1902 se publica el primer En 1902 se publica el primer informe sobre la apariciinforme sobre la aparicióón de un n de un
““amarillamientoamarillamiento”” óó ““YellowYellowDiseaseDisease”” en plantas. Hasta 1967 en plantas. Hasta 1967
se les atribuyse les atribuyóó origen viralorigen viral
En 1967 En 1967 DoiDoi y colaboradores y colaboradores descubren, en cortes descubren, en cortes ultrafinosultrafinos del del floema de plantas con sfloema de plantas con sííntomas, ntomas, partpartíículas similares a los culas similares a los micoplasmas animales micoplasmas animales ((MMicoplasma icoplasma LLikeike OOrganismrganism) y se ) y se los denominlos denominóó MLOMLO
1902 1967
(Dr. Luis(Dr. Luis R. CONCI IFFIVER. CONCI IFFIVE--INTA)INTA)
Dominio: Bacteria
Phylum: Ternicutes
Clase: Mollicutes (Mycoplasmalike organisms (MLO))
Orden I: MycoplasmatalesOrden II: Entomoplasmatales
Familia II: Spiroplasmataceae
Género: Spiroplasma
Familia (s): aún no definida
Género: Candidatus Phytoplasma
Mollicutes Fitopatógenos
• Tamaño pequeño, filtrables por poros de 450nm• Genoma pequeño• Gram (+) • Sin de pared celular, solo membrana plasmática• Son los procariotas más pequeños que pueden autoreplicarse• Parásitos • Resistentes a penicilina (interfiere con la producción de la pared
celular) pero sensibles a tetraciclina y cloranfenicol (interfieren con la síntesis de proteínas)
• Los fitopatógenos son transmitidos por insectos que se alimentan del floema: cicadélidos, delfácidos y psílidos.
• Los mollicutes fitopatógenos: fitoplasmas y espiroplasmas.
Clase Mollicutes
Habitan y se multiplican en insectosFrecuentes en la superficie en plantas
y flores.
Habitantes del floema y diversos órganos de insectos
Identificación por serología y PCRIdentificación por PCR, amplificación del rRNA RFLP y/o análisis secuencial del DNA
Cultivables in vitroNo se han podido cultivar in vitro
Morfolología helicoidal, filamentos ramificados o no, y/o formas de cocos.
PleomórficosESPIROPLASMASFITOPLASMAS
S. citri
Organismo vivo autoreplicante más pequeño que se conoce.
Vasos floemáticosdonde se observan fitoplasmas
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
Filodia
Virescencia
Esterilidad
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
Deformación y disminución del tamaño foliar
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
Longitud anormal de entrenudos
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
Proliferación de yemas axilares(escoba de bruja)
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
Amarillamientos y “dieback”
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
Vinca
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
Duraznero
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
(IFFIVE(IFFIVE--INTA)INTA)
Xylella fastidiosa• Gram-negativa• Limitada al xilema• Transmitida por cicadélidos• Más de 150 especies hospederas• En viña: Enfermedad de Pierce• En citrus: Clorosis Variegada de los
Citrus (CVC)
HUANGLONGBING (“Citrus greening”)• Candidatus Liberibacter spp.• Gram negativa• Limitada al floema• No cultivable in vitro• Transmitida por psílidos• Capaz de multiplicarse en los
vectores
Pasos a seguir:
1) Observación del problema2) Formular una hipótesis que explique lo
observado3) Probar la hipótesis4) Aceptar o revisar la hipótesis
DIAGNÓSTICO Síntomas de enfermedades bacterianas
• Manchas foliares• Manchas en frutos• Cancros• Marchitez• Hiperplasia• Podredumbre• Costras• Necrosis
Agallas o tumores
Síntomas de enfermedades bacterianas
Agrobacterium tumesfasciens
Psudomonas savastanoipv.savastanoi
Síntomas de enfermedades bacterianas
Agallas o tumores
Lesiones en frutos
Síntomas de enfermedades bacterianas
Xanthomonas arboricola pv. pruni
Lesiones en frutos
Síntomas de enfermedades bacterianas
Pseudomonas syringae pv. papulans
Xanthomonas axonopodispv. citri
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
Síntomas de enfermedades bacterianas
Lesiones en frutos Lesiones en frutos
Síntomas de enfermedades bacterianas
Xanthomonas campestris pv. cucurbitae
Costras
Síntomas de enfermedades bacterianas
Podredumbres blandas
Síntomas de enfermedades bacterianas
Podredumbres blandas
Síntomas de enfermedades bacterianas
Podredumbres blandas
Síntomas de enfermedades bacterianas
Afecciones vasculares
Síntomas de enfermedades bacterianas
Marchitez
Síntomas de enfermedades bacterianas
Síntomas de enfermedades bacterianas
Manchas foliares
Síntomas de enfermedades bacterianas
Manchas angulares, acuosas
Síntomas de enfermedades bacterianas
Manchas foliares
Pantoea stewartii
Síntomas de enfermedades bacterianas
Cribado
Defoliación
Síntomas de enfermedades bacterianas
Cancros
Síntomas de enfermedades bacterianas
PASOS DEL DIAGNOSTICO
Observación del problema
Aceptación o replanteo de hipótesis
Planteo de
hipótesis
Prueba de hipótesis
• Observación de síntomas y signos• Aislamiento en medios de cultivo• Prueba de hipersensibilidad en no huésped• Pruebas de patogenicidad• Prueba de Gram• Características culturales• Pruebas bioquímicas y fisiológicas• Pruebas serológicos (ELISA)• Técnicas moleculares
Diagnóstico de enfermedades bacterianas
La bibliografía indica que podría ser una bacteria!!
Zooglea: Aspecto mucilaginoso, constituido de masa bacteriana y restos del vegetal.
Signo de bacterias
Microcorrida: para hojas
Técnicas para ver el signo de bacterias
Test de flujo: para tallos
Técnicas para ver el signo de bacterias
• Observación de síntomas y signos• Aislamiento en medios de cultivo• Prueba de hipersensibilidad en no huésped• Pruebas de patogenicidad• Prueba de Gram• Características culturales• Pruebas bioquímicas y fisiológicas• Pruebas serológicos (ELISA)• Técnicas moleculares
Diagnóstico de enfermedades bacterianas
Aislamiento
Podemos utilizar el material observado en la microcorridao test de flujo
Aislamiento
Indirecto
Cultivo trampa
Aislamiento Aislamiento
• Observación de síntomas y signos• Aislamiento en medios de cultivo• Prueba de hipersensibilidad en no huésped• Pruebas de patogenicidad• Prueba de Gram• Características culturales• Pruebas bioquímicas y fisiológicas• Pruebas serológicos (ELISA)• Técnicas moleculares
Diagnóstico de enfermedades bacterianas
Diagnóstico de enfermedades bacterianas
1. Se realiza una inoculación masiva en el mesófilode una hoja de una planta NO HUESPED
2. Se observa la ocurrencia (o no) de reacción de hipersensibilidad
Hipersensibilidad en no huésped
La aparición de una reacción de hipersensibilidad indica que la bacteria inoculada es patógena.
Hipersensibilidad en no huésped
Prueba de patogenicidad
Inoculación mediante aspersión
Prueba de patogenicidad
Inoculación mediante infiltración
• Patógenos vasculares: inoculación al tallo– axila - pinchar a través
de gota– inyección al tallo
Prueba de patogenicidad
• Observación de síntomas y signos• Aislamiento en medios de cultivo• Prueba de hipersensibilidad en no huésped• Pruebas de patogenicidad• Prueba de Gram• Características culturales• Pruebas bioquímicas y fisiológicas• Pruebas serológicos (ELISA)• Técnicas moleculares
Diagnóstico de enfermedades bacterianas
Taxonomía
– Morfológicas, – Culturales (forma, bordes,
color de las colonias)– Fisiológicas– Bioquímicas– Patológicas (capacidad
para atacar a determinado huésped)
Características taxonómicas
Morfología de colonia en medio sólido
Forma
Elevación
Borde
Morfología de colonia en medio sólido
Pared celular Prueba de gram indirecta
GRAM (+) GRAM (-)
GRAM (-)– Erwinia – Pseudomonas– Xanthomonas– Xylella– Agrobacterium
GRAM (+)– Clavibacter– Curtobacterium– Streptomyces
Principales géneros de Bacterias fitopatógenas
PseudomonasAgrobacteriumBurkholderiaRalstoniaErwinia
Coloración de la colonia en medio YDC
AmarillaCrema
XanthomonasErwinia
Reacción de oxidación/fermentación o de Hugh & Leifson
La mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen metabolismo oxidativo
Características fisiológicas
• Metabolismo oxidativo– Pseudomonas– Xanthomonas– Xylella– Agrobacterium– Clavibacter
• Metabolismo fermentativo– Erwinia
Reacción de o/f
Producción de pigmentos fluorescentes
Pseudomonas fluorescens se caracteriza por producir pigmentos fluorescentes (izq)
Características fisiológicas
• Observación de síntomas y signos• Aislamiento en medios de cultivo• Prueba de hipersensibilidad en no huésped• Pruebas de patogenicidad• Prueba de Gram• Características culturales• Pruebas bioquímicas y fisiológicas• Pruebas serológicos (ELISA)• Técnicas moleculares
Diagnóstico de enfermedades bacterianas
• Serología: ELISA
Otras Técnicas
• Técnicas moleculares– PCR– PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)
– Real time PCR– Secuenciación
Otras Técnicas
Técnicas moleculares
PCR
PCR-RFLP
Técnicas moleculares
Real time PCR
Técnicas moleculares
Secuenciación
Diagnóstico de enfermedades bacterianas
• AGRIOS, G. 2005. Plant pathology. 5nd. ed. London, Elsevier Academic Press. 922 p.
• KADO, C. 2010.Plant bacteriology. Minessota, APS Press. 336 p.
• TRIGIANO, R.; WINDHAM, M.; WINDHAM, A. 2008. Plant pathology, concepts and laboratory exercises. 2nd. ed. Florida, RC Press. 558 p.
Bibliografía consultada
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