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Determinación de Tetrahidrocannabinol y Cocaína en muestras de sangre seca. Su posible aplicación en el tráfico

rodado

Grupo de investigación

Servicio de Toxicología Forense

Instituto of Ciencias Forenses

Universidad of Santiago de Compostela

Prof. Manuel López-RivadullaCatedrático de Toxicología

MARCO LEGAL

• Artículo 14 Bebidas alcohólicas y drogas • 1. No puede circular por las vías objeto de esta ley el conductor de cualquier vehículo con tasas de alcohol

superiores a las que reglamentariamente se determine.• Tampoco puede hacerlo el conductor de cualquier vehículo con presencia de drogas en el organismo, de

las que se excluyen aquellas sustancias que se utilicen bajo prescripción facultativa y con una finalidadterapéutica, siempre que se esté en condiciones de utilizar el vehículo conforme a la obligación de diligencia,precaución y no distracción establecida en el artículo 10.

• 2. El conductor de un vehículo está obligado a someterse a las pruebas para la detección de alcoholo de la presencia de drogas en el organismo, que se practicarán por los agentes de la autoridadencargados de la vigilancia del tráfico en el ejercicio de las funciones que tienen encomendadas. Igualmentequedan obligados los demás usuarios de la vía cuando se hallen implicados en un accidente de tráfico o hayancometido una infracción conforme a lo tipificado en esta ley.

• 3. Las pruebas para la detección de alcohol consistirán en la verificación del aire espirado mediante dispositivosautorizados, y para la detección de la presencia de drogas en el organismo, en una prueba salivalmediante un dispositivo autorizado y en un posterior análisis de una muestra salival en cantidadsuficiente.

• No obstante, cuando existan razones justificadas que impidan realizar estas pruebas, se podrá ordenar elreconocimiento médico del sujeto o la realización de los análisis clínicos que los facultativos del centro sanitarioal que sea trasladado estimen más adecuados.

• 4. El procedimiento, las condiciones y los términos en que se realizarán las pruebas para la detección de alcoholo de drogas se determinarán reglamentariamente.

• 5. A efectos de contraste, a petición del interesado, se podrán repetir las pruebas para ladetección de alcohol o de drogas, que consistirán preferentemente en análisis de sangre, salvocausas excepcionales debidamente justificadas. Cuando la prueba de contraste arroje un resultado positivo seráabonada por el interesado.

Real Decreto Legislativo 6/2015, de 30 de octubre, por el que se aprueba el texto refundido de la Ley sobre Tráfico, Circulación de Vehículos a Motor y Seguridad Vial

MARCO LEGAL• CONTROLES DE DROGAS ILICITAS EN

SALIVA CON DISPOSITIVOS INDICIARIOSObligación de obtener una segunda muestra desaliva que confirme el resultado del test.

Sanción penal Sanción administrativa

Tolerancia cero“Bajo influencia”

MARCO LEGAL

• POSIBILIDAD DE QUE EL CONDUCTORPUEDA REALIZAR UNA PRUEBA DECONTRASTE EN SANGRE

Vía penal Vía administrativa

Tolerancia cero“Bajo influencia”

�LA INTERPRETACIÓN DE LOS VALORESCUANTITATIVOS EN LA SALIVA ESCOMPLICADA

� Gran variabilidad del “producto” en el mercado

� Gran variabilidad en la respuesta de los consumidores� Consumidores habituales� Consumidores esporádicos

LA TOXICOLOGIA A DIA DE HOYNO TIENE UNA RESPUESTACLARA A ESTE PROBLEMA

�LA INTERPRETACIÓN DE LOS VALORESCUANTITATIVOS EN LA SALIVA ESCOMPLICADA

� Menor importancia en la vía administrativa� Presencia de drogas en el organismo

� Importante en la vía penal� “Bajo Influencia”

PREVALENCIA DEL USO DE DROGAS EN CONDUCTORES

• ESULTADOS PROYECTO DRUID (2008-2010

Estudio de prevalencia en España, Principales Resultados

Porcentaje de casos positivos en sustancias/agrupac iones de sustancias

THC Cocaína Benzodiacepinas Anfetaminas Opiáceos

Medicamentos

(codeína, metadona)

Opiáceos

Ilícitos

Total Total (N=3302)

7,69 3,51 1,60 0,21 0,45 0,41

Sexo Hombre (N=2690)

9,11 4,09 1,64 0,19 0,56 0,00

Mujer (N=612)

1,47 0,98 1,47 0,33 0,00 0,33

Rango edad

18-24 años (N=708)

15,11 3,53 0,28 0,57 0,00 0,00

25-34 años (N=1144)

9,35 4,55 0,70 0,17 0,52 0,26

35-49 años (N=995)

3,62 3,62 2,21 0,00 0,80 0,70

> 50 años (N=414)

0,24 0,72 4,83 0,00 0,00 0,00

MARCO LEGAL

• POSIBILIDAD DE QUE EL CONDUCTORPUEDA REALIZAR UNA PRUEBA DECONTRASTE EN SANGRE

Requiere que la persona que lo solicite acuda a un Centro hospitalario

Problemas:Transcurre un tiempo entre el hecho acaecido y la llegada al hospital

Se producen los fenómenos de biotransformación en el organismo, quecontribuyen a eliminar las sustancias a las que se ha estado expuesto, oconvertirlas en otras.Puede desaparecer la sustancia, o puede transformase en otra

SANGRE¿Por qué se utiliza como muestra biológica?

�La concentración de la sustancia analizada secorrelaciona con el efecto producido

�Corta ventana de detección, informa de consumo reciente

INCONVENIENTES:�Adición de conservantes�Composición compleja�Técnica invasiva

Gotas secas de sangre (DBS)� Muestras de sangre recogidas mediante punción capilar sobre una tarjeta.

VENTAJAS:� Toma de muestras sencilla y no invasiva

� Fácil transporte y almacenamiento

� Mayor estabilidad

� Menor riesgo biológico

� Obtención inmediata

Gotas secas de sangre (DBS)

Aplicaciones de las DBS�Metabolopatías

�Estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos

�Monitorización terapéutica de fármacos

�ANÁLISIS TOXICOLÓGICO�Tratamientos de deshabituación

�Detección de drogas en el trabajo

�Controles en carretera

ObjetivosEl desarrollo y validación de un método analítico para ladeterminación de Δ9-tetrahidrocannabinol (THC),cannabidiol (CBD) y cannabinol (CBN) en gotas secas desangre mediante cromatografía líquida asociada aespectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

El desarrollo y validación de un método analítico para la

determinación de Cocaína y sus metabolitos en gotas

secas de sangre mediante cromatografía líquida asociada

a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Preparación de la muestra

Adición de 50 µl de sangre en DMScard Agilent Bond Elut

Se dejan secar 24h a Tª ambiente (20-25 ºC)

Extracción

Cortamos la gota seca yse añaden:2 mL metanol:NH4OH

(95:5) +

25 μL PI a 0,1 ng/mL

Agitación horizontal durante 30 min a 280 rpm

En corriente de N2

a 35ºC.

75 μL ÁcidoFórmico 0,1%:

Acetonitrilo (90:10)

10 min4500 rpm

EXTRACCIÓN EVAPORACIÓN

RECONSTITUCIÓNCENTRIFUGACIÓN

Recogida del eluyente

CROMATOGRAFÍA

Inyección de 35 µl en el LC-MS/MS

Extracción

Condiciones de la cromatografía líquida

Atlantis T3 3 µm 2,1x50 mm (Waters), 35°C

Tiempo (min)

% Ácido fórmico 0,1% en agua

% ACN Flujo (mL/min)

0.0 90 10 0,3

1.0 90 10 0,3

5.5 40 60 0,3

5.6 10 90 0,3

6.4 10 90 0,3

6.5 90 10 0,3

9.0 90 10 0,3

Condiciones de la espectrometría de masas Quattro Micro™ API ESCI (Waters)

Electrospray en modo positivo (ESI+)

Parámetro Valor

Voltaje del capilar 5,00 kV

Temperatura de la fuente

150ºC

Temperatura del gas de desolvatación

400ºC

Flujo del gas de desolvatación

800 L/h

Flujo del gas del cono 60 L/h

Límite de cuantificación (LOQ)

Concentración más baja del analito que se puedecuantificar con adecuada impresión (%CV≤20%) yexactitud (80-120%), y con relación S/N≥10

• Se estudiaron 5 replicados al valor mas bajo de larecta

1 ng/ml

Cocaína

Aplicación a casos reales

Se analizaron 7 muestras reales, previamentepositivas a cocaína y metabolitos

Cocaína (ng/mL) BE(ng/mL) Cocaetileno(ng/mL)

Casos Sangre total DBSSangre total

DBS Sangre total DBS

1 0 0 231,5 195,4 - 0

2 32,6 40,3 959,3 1103,1 - 43,5

3 2,3 0 402 441,96 - 0

4 0 0 159 200,4 - 0

5 0 0 1073,6 1120,2 - 0

6 0 0 13,4 16,2 - 0

7 0 0 97,9 105,7 - 0

R² = 0,9926

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 200 400 600 800 1000 1200

DB

S (

ng

/ml)

Sangre total (ng/ml)

Relación concentración BE

Límite de cuantificación (LOQ)

Concentración más baja del analito que se puedecuantificar con adecuada impresión (%CV≤20%) yexactitud (80-120%), y con relación S/N≥10

• Se estudiaron 5 replicados al valor mas bajo de larecta

50 ng/ml

THC

Aplicación a casos reales

�El método se aplicó a 9 muestras reales positivas

recogidas entre 2013 y 2015.

Resultado:� No se obtuvo ningún resultado positivo

en ninguna de las muestras reales

analizadas.

Muestra Sangre total (ng/ml)

1 1,2

2 2,8

3 1,1

4 2,7

5 1

6 1

7 2,8

8 10,2

9 15,7

Conclusiones

�Se ha desarrollado un método analítico para la determinacióncocaína y dos de sus metabolitos en muestras de sangreobtenidas por DBS y posterior análisis mediante cromatografíalíquida acoplada a espectrometría de masas.

�Siguiendo los criterios establecidos, el método ha sidosatisfactoriamente validado, demostrando ser un método sensible(LOQ = 1ng/mL) y específico.,

�Su utilidad en los casos reales también fue demostrada, pueslasconcentraciones encontradas mediante las DBS fueron muysimilares a las determinadas empleando métodos rutinariosparael análisis de muestras biológicas de sangre total.

�El método analítico propuesto para la determinación de cocaínay metabolitos mediante DBS ofrece una alternativa claramenteaceptable y con unos resultados prometedores.

Conclusiones

�Se ha desarrollado un método analítico para ladeterminación TETRAHIDROCANNABINOL , CBNYCBD, en muestras de sangre obtenidas por DBS y posterioranálisis mediante cromatografía líquida acoplada aespectrometría de masas.

�Siguiendo los criterios establecidos, el método ha sidosatisfactoriamente validado, demostrando ser un métodoespecífico pero poco sensible (LOQ= 50ng/mL)

�Por esta razón no hemos podido comprobar su efectividad,aunque con nuevos equipos más sensibles podría lograrse.

PREVISONES DE FUTURO

� IMPLEMENTAR MARCO JURIDICO QUE PERMITA LAOBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE SANGRE SECA.

�La voluntariedad del solicitante�La rapidez en su obtención que evite la desaparición de la droga.

� SUGERIR, CON CRITERIOS TOXICOLOGICOS LOS VALORESDE UNOS NIVELES EN SANGRE, QUE ESTEN CLARAMENTERELACIONADOS CON LA “INFLUENCIA” (VÍA PENAL).

� MANTENER EL CRITERIO DE TOLERANCIA CERO PARA LAVIA ADMINISTRATIVA, HOMOGENEIZANDO LOS VALORES DECUTOFF DE LOS DISPOSITIVOS SALIVARES UTILIZADOS.

¡Gracias por su atención!

manuel.lopez-rivadulla@usc.es