determinación de parámetros cinéticos de catalizadores de...

Determinación de parámetros cinéticos de catalizadores de

enzimáticos

Pedro Valencia, Diego GajardoUSM 2017

Catálisis enzimática

S PVentajas:- Alta velocidad de reacción.- Elevada selectividad.

Desventajas:- Alto costo.- Termolábiles.

Catálisis enzimática

Ecuación de Michaelis-Menten

SKSV

vm

max

E + S ES E + P

Catálisis enzimática

Ecuación de Michaelis-Menten: Estimación de Vmax y Km

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

v 0 (m

M/m

in)

S0 (mM)

-10 0 10 20 30 400

10

20

301/

v 0 (m

in/m

M)

1/S0 (1/mM)

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

1

2

3

4

5

6

S 0/v0 (

min

)

S0 (mM)

= 0.135

= 0.212 /

= 0.117

= 0.196 /

= 0.143

= 0.214 /

Método de la Mediana

Direct linear plot

S0 v087.2 0.496743.0 0.484021.3 0.471210.6 0.43315.31 0.32732.12 0.17041.06 0.1008

=−

−=

−

−

=+

12

( − 1)Combinaciones =

-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

V

K

Direct linear plot

1.17323214 0.497154321.55242023 0.505542741.97004431 0.506122161.80875079 0.507002832.29376356 0.509765513.02952282 0.513956472.03347225 0.516184613.11071007 0.518959964.36923548 0.521587614.42849888 0.521925184.53613598 0.535002634.57003129 0.535384114.72923077 0.550523083.64366397 0.551805375.07590048 0.58348945.16347933 0.585426835.09616727 0.64132176.12694382 0.683437686.64745763 0.704705086.76670296 0.744275158.3660666 0.84284233

VK

K V

Inhibición Acompetitiva por Sustrato

E + S ES E + P+S

ESS

=+ +

Direct linear plot aplicado a Modelo Inhibición por Sustrato

Direct linear plot aplicado a Modelo Inhibición por Sustrato

=+ +

1 − −

1 − −

1 − −

=

− −1

=

Direct linear plot aplicado a Modelo Inhibición por Sustrato

S0(mM)

v0(mM/min)

0.025 0.0360.050 0.0520.100 0.0950.250 0.1340.500 0.1681.00 0.18710 0.19250 0.186

100 0.175200 0.163300 0.146400 0.139600 0.115

286 combinaciones

Método\Parámetro V K KS

MMC 0.201 0.118 821Mediana 0.198 0.119 837 (782)

1 − −

1 − −

1 − −

=

16

( − 1)( − 2)Combinaciones =

Direct linear plot

Problema 1. Determinación de constantes cinéticas (Vmax, Km, Ki, Ki’)

E + S ES E + P+I

ESI

+I

EI

=1 + +

=1 + + 1 + ′

′

=+ 1 + ′

Inhibición Competitiva Inhibición Acompetitiva Inhibición Mixta

Direct linear plot aplicado a modelos de inhibición por producto

donde = −=+ +

− +

= −v S

Direct linear plot aplicado a modelos de inhibición por producto

Resolver el siguiente sistema de ecuaciones:

− +

= −v S = 1, 2, 3

Actividades

1. Implementar algoritmo computacional para métodos mínimos cuadrados y DLP.2. Diseñar datos simulados.3. Validar método con datos simulados.

Direct linear plot aplicado a modelos de inhibición por producto

Objetivo

Validar estadísticamente el uso del método DLP aplicado al modelo de inhibición por producto

Problema 1. Determinación de constantes cinéticas ( , Km, Kp)

Catálisis Heterogénea

¿Por qué inmovilizar?

ReutilizaciónReutilización

Inmovilización de enzimas

EstabilizaciónEstabilización

Catálisis enzimática heterogénea

vdtdS

vrS

rrSD

tS

e

2

2

2

Determinación parámetros cinéticos

Enzima soluble

Enzima inmovilizada0 1 2 3 4

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Con

vers

ion

t (min)

Catálisis enzimática heterogénea

Problema 2. Determinación del coeficiente de difusión efectiva (Def)

vrS

rrSD

tS

e

2

2

2

Catálisis enzimática heterogénea

Problema 2. Determinación del coeficiente de difusión efectiva (Def)

Catálisis enzimática heterogénea

Problema 2. Determinación del coeficiente de difusión efectiva (Def)

C = 0 C = Ct C = C

C

t2

2eD t

Rtc c c e

Estimación de parámetros

Problema 2. Determinación del coeficiente de difusión efectiva (Def)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Cre

l

t (min)

= 4.77 10 /

Actividades

1. Deducir la ecuación de difusión para partículas esféricas en medio líquido.2. Implementar algoritmo de estimación del coeficiente de difusión.3. Validar método con datos simulados.

Estimación del coeficiente de difusión efectiva

Objetivo

Estimar el coeficiente de difusión efectiva en catalizadores de enzima inmovilizada utilizandola ecuación de difusión sin aproximación analítica

Catálisis enzimática heterogénea

Problema 3. Determinación de constantes cinéticas intrínsecas.

vrS

rrSD

tS

e

2

2

2

SKSV

rS

rrSD

tS

me

max

2

2 2

0 2 4 6 8 100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

v0

S0

E soluble C150R30 C400R30 C650R30 C150R72 C400R72 C650R72

Catalizador Km (mM)

E Soluble 0.23

C150R30 0.73

C400R30 1.70

C650R30 2.09

C150R72 1.04

C400R72 3.52

C650R72 4.55

Catálisis enzimática heterogénea

Problema 3. Determinación de constantes cinéticas intrínsecas.

Sm

e

KSSK

SVrS

rrSD

tS

2max

2

2 2

Estimación de constantes cinéticas

Problema 3. Determinación de constantes cinéticas intrínsecas (Vmax, Km, Ks)

Modelo para inhibición acompetitiva por sustrato

Determinación numérica de parámetros cinéticos de catalizadores usando un modelo de inhibición por sustrato

Modelo de inhibición por sustrato

Problemática: Determinar los parámetros cinéticos V, K y Ks, a partir de mediciones de la concentración de sustrato S en un intervalo de tiempo [0,T].

Determinación numérica de parámetros cinéticos de catalizadores usando un modelo de inhibición por sustrato

Metodología

1. Plantear el problema usando el siguiente enfoque:

Determinación numérica de parámetros cinéticos de catalizadores usando un modelo de inhibición por sustrato

Metodología

2. Aplicar el método del gradiente para el resolver el problema del inciso 1:

Para calcular usar el Método adjunto, el cual consiste en expresar en términos de la solución de la ecuación diferencial del inciso 1 y una función que resuelve un sistema denominado Sistema Adjunto.

Determinación numérica de parámetros cinéticos de catalizadores usando un modelo de inhibición por sustrato

Algoritmo

1. Parámetros iniciales .2. Dado el vector de parámetros , resolver el sistemas directo y

adjunto.3. Obtener la derivada del funcional, i.e., .4. Evaluar la proyección:

5. Parar cuando o .

Determinación numérica de parámetros cinéticos de catalizadores usando un modelo de inhibición por sustrato

Objetivo

Implementar algoritmo computacional usando la Metodología descrita para la determinación de los parámetros cinéticos , y .

Actividades

1. Implementar algoritmo computacional usando la metodología descrita.2. Estudiar la sensibilidad del sistema al error de estimación de los parámetros.3. Comparar resultados con mínimos cuadrados.