cromatografia generalidades nr

INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA

DIANA PATRICIA CARDONA S.

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

Separación

• Analizar

• Identificar

• Purificar

• Cuantificar Componentes Mezcla

La cromatografía es, esencialmente, un método físico de separación,

en el cual los componentes a separar se distribuyen en dos fases, la

fase estacionaria, de gran área superficial y la fase móvil que se hace

pasar a lo largo de la fase estacionaria.

QUE ES CROMATOGRAFIA?

FASE CLASIFICACION

FASE

ESTACIONARIA

FASE

MOVIL

FASE MOVIL

FUERZAS DE

ATRACCION

L L

Cromatografía Liquida

Reparto

S

L

Adsorción

Reparto

Intercambio iónico

Exclusión Molecular

Afinidad

L G Cromatografía

Gaseosa

Adsorción

S G Exclusión molecular

Especies

orgánicas

enlazadas a una

superficie sólida

Fluido

supercrítico

Cromatografía Fluido

supercrítico

CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

CLASIFICACION DE LA

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

http://www.separationsnow.com/FCKeditor/UserFiles/Image/sepNOW_

advertorials/0601_HPLC_Agilent/0601_hplcad_agilent_fig1.jpg

http://www.charltonsci.co.uk/charlton_

scientific011001.jpg

http://www.waters.com/watersdivision/Conten

tD.asp?watersit=JDRS-5LTGBH&WT.svl=1

Cada compuesto migra a una velocidad que

refleja el tamaño de sus moléculas y su

solubilidad en el solvente

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

CROMATOGRAFIA PAPEL

http://images.bestwebbuys.com/muze/books/96/9781588904096.jpg

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

DETECCION: UV y Reveladores

Fase Normal – F. Estacionaria Polar (Silica gel) – F. Móvil No Polar

Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar (silica

modificada) – F. Móvil Polar

F. E

STA

CIO

NA

RIA

F. M

ÓV

IL

ALTA A

MEDIA

BAJA A

MEDIA

BAJA POLARIDAD

BAJA POLARIDAD

POLARIDAD DE SUSTANCIAS

CROMATOGRAFIA CAPA FINA

TIPOS DE SEPARACION

FASE NORMAL

LA FASE ESTACIONARIA (SILICA) ES MAS POLAR QUE LA FASE MOVIL

LOS COMPONENTES QUE MIGRAN PRIMERO SON LOS MAS APOLARES

LOS COMPONENTES QUE MIGRAN AL FINAL SON LOS DE MAYOR POLARIDAD (MAS POLARES)

PUNTO DE

SIEMBRA

APOLAR

POLAR

SILICA GEL (FASE

ESTACIONARIA POLAR

CROMATOGRAFIA CAPA FINA

TIPOS DE SEPARACION

Glass TLC Plates, Silica gel 60 F254 20x20cm

Aluminium TLC Plates, Silica gel 60 F254 20x20cm

FASE REVERSA

SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LA

FASE ESTACIONARIA PRESENTA UNA

BAJA POLARIDAD; LOGRADO

MEDIANTE UN PROCESO DE

DERIVATIZACION

Sílice derivatizada superficialmente: C8 C18

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

Glass TLC Plates, Silica gel 60 RP-8 F254 20x20cm

Aluminium TLC Plates, Silica gel 60 RP-8 F254 20x20cm

Glass TLC Plates, Silica gel 60 RP-18 F254 20x20cm

Aluminium TLC Plates, Silica gel 60 RP-18 F254 20x20cm

CROMATOGRAFIA CAPA FINA

TIPOS DE SEPARACION

RESUMEN

CARACTERISTICAS FASE NORMAL FASE REVERSA

FASE ESTACIONARIA POL AR (SILICA GEL) APOLAR

FASE MOVIL APOLAR POLAR

PRIMEROS EN MIGRAR APOLARES POLARES

ULTIMOS EN MIGRAR POLARES APOLARES

El tipo de separación se

puede dar por:

Color

Afinidad

Polaridad

Peso molecular (GPC y

GFC)

Ingreso de muestra

Separación, Columna

Colección

de

fracciones

Detección de

Componentes

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

CROMATOGRAFIA DE COLUMNA

http://www.separationsnow.com/FCKeditor/UserFiles/Image/sepNOW_advertorials/060

1_HPLC_Agilent/0601_hplcad_agilent_fig1.jpg

http://www.charltonsci.co.uk/charlton_scientific011001.jpg http://www.waters.com/watersdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS

-5LTGBH&WT.svl=1

http://www.buchi.com/uploads/pics/flash-

chromatography.jpg

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

CROMATOGRAFIA DE COLUMNA

CROMATOGRAFIA FLASH

EXTRACCION FASE SOLIDA

HPLC

Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar

Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar

Par Iónico Cromatográfico P.I.C.

Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica

Permeación por Gel (polímeros) Filtración en gel

F. E

STA

CIO

NA

RIA

F. M

ÓV

IL

ALTA A

MEDIA

BAJA A

MEDIA

BAJA POLARIDAD

BAJA POLARIDAD

POLARIDAD DE SUSTANCIAS

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar

Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar

Par Iónico Cromatográfico P.I.C

Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica

Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)

- Filtración en gel

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

FASE NORMAL

LA FASE ESTACIONARIA(SILICA) ES MAS POLAR QUE LA FASE MOVIL

LOS COMPONENTES QUE ELUYEN PRIMERO SON LOS DE MENOR POLARIDAD

LOS COMPONENTES QUE ELUYEN AL FINAL SON LOS DE MAYOR POLARIDAD

PUNTO DE SIEMBRA

APOLAR

POLAR SILICA GEL (FASE

ESTACIONARIA

POLAR

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

Ingreso de muestra

Separación, Columna

Colección

de

fracciones

1

2

3

1

1 2 3

COMP. APOLAR

COMP. POLAR

FASE

ESTACIONARIA

POLAR

CCF (FASE NORMAL)

LA COLUMNA SE PUEDE CONTAMINAR EN FORMA IRREVERSIBLE CON

PRODUCTOS QUE CONTENGA LA MUESTRA QUE PRESENTEN ALTA

POLARIDAD TALES COMO AZUCARES.

ESTE MECANISMO SE UTILIZA CUANDO SE VA A ANALIZAR MUESTRAS

QUE CONTENGAN PRINCIPIOS DE BAJA POLARIDAD

FASE NORMAL

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar

Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar

Par Iónico Cromatográfico P.I.C

Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica

Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)

- Filtración en gel

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

FASE REVERSA

SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LA FASE

ESTACIONARIA PRESENTA UNA BAJA POLARIDAD;

LOGRADO MEDIANTE UN PROCESO DE DERIVATIZACION

Sílice derivatizada superficialmente: C18 C8 C4 FENIL AMINO CIANO

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

FASE REVERSA CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

LA FASE ESTACIONARIA ES MENOS POLAR QUE LA FASE MOVIL

LOS COMPONENTES QUE ELUYEN PRIMERO SON LOS DE MAYOR POLARIDAD

LOS COMPONENTES QUE ELUYEN AL FINAL SON LOS DE MENOR POLARIDAD

APOLAR

POLAR SILICA GEL (FASE

ESTACIONARIA

POLAR

Ingreso de muestra

Separación, Columna

Colección de

fracciones

1

2

3

1

1 2 3

COMP. POLAR

COMP. APOLAR

FASE

ESTACIONARIA

APOLAR

CCF (FASE NORMAL)

PUNTO DE SIEMBRA

POLAR

APOLAR

SILICA GEL RP18 (FASE

ESTACIONARIA APOLAR

1 2 3

CCF (FASE REVERSA)

MUESTRAS CON COMPUESTOS

ACIDOS DEBILES

PRINCIPIO DE LECHATELIER

EFECTO DEL ION COMUN

– PRACTICAMENTE SE ADICIONA ACIDO

ACETICO AL 1% A LA FASE MOVIL

FASE REVERSA

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar

Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar

Par Iónico Cromatográfico P.I.C

Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica

Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)

- Filtración en gel

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

APLICACIÓN: MUESTRAS CON COMPUESTOS

ACIDOS Y BASES DEBILES

FASE REVERSA: MECANISMO DE PAR IONICO

CROMATOGRAFICO (PIC)

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

PIC A: PARA COMPUESTOS DE CARACTERISTICAS

ACIDAS: FOSFATO DE TETRABUTIL AMONIO

• PIC B: PARA COMPUESTOS DE CARACTERISTICAS

BASICAS PIC B5 (ACIDO PENTANO SULFONICO)

PIC B6 (ACIDO HEXANO SULFONICO)

PIC B7 (ACIDO HEPTANO SULFONICO)

PIC B8 (ACIDO OCTANO SULFONICO)

Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar

Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar

Par Iónico Cromatográfico P.I.C

Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica

Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)

- Filtración en gel

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

INTERCAMBIO IONICO

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

ANIONICAS DEBILES

ANIONICAS FUERTES

CATIONICAS DEBILES

CATIONICAS FUERTES

Proceso de separación de moléculas basados en

la diferencia en la carga neta.

Se utiliza para analisis de compuestos que tengan

caracteristicas ionicas (aniones o cationes)

Proteinas con una carga neta positiva serán retenidos en las columnas con un

empaque cargado negativamente (ej. Carboximetilcelulosa), eluyendo los otros

componentes que tienen carga neta negativa.

Proteinas con una carga neta negativa serán retenidos en columnas con un

empaque cargado positivamente (ej: dietilaminoetil-celulosa)

http://www.dbs.umt.edu/courses/fall2006/bioc380/lectures/008/lecture.ht

ml

INTERCAMBIO IONICO

Polos

opuestos

se atraen

Amino Acidos con dos grupos ionizables

http://www.dbs.umt.edu/courses/fall2006/bioc380/lectures/008/lecture.html

http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzpur/ionX.htm

Fase Normal – F. Estacionaria Polar – F. Móvil No Polar

Fase Reversa – F. Estacionaria No Polar – F. Móvil Polar

Par Iónico Cromatográfico P.I.C

Intercambio Iónico – pH – Fuerza Iónica

Exclusión por tamaño: - Permeación por Gel (polímeros)

- Filtración en gel

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

CROMATOGRAFIA COLUMNA

TIPOS DE SEPARACION

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION POR TAMAÑO (SEC)

Es una técnica que permite separar las

moleculas de acuerdo a su tamaño, gracias

al intercambio repetitivo entre las

moleculas del soluto, la fase móvil y la

cantidad remanente de solvente en los

poros del empaque de la columna. Las

moléculas de mayor peso molecular eluyen

primero y las de menor eluiran al final

http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzpur/gelexcl.htm

Cromatografía de Permeación en

Gel (GPC): SEPARACION DE

POLIMEROS ORGANICOS

CLASIFICACION DE LA CROMATOGRAFIA DE

EXCLUSION POR TAMAÑO (SEC)

Cromatografía de Filtración en Gel

(GFC): SEPARACION DE POLIMEROS

SOLUBLES EN AGUA, PROTEINAS,

AZUCARES ENTRE OTROS, SE

DENOMINA CROMATOGRAFIA DE

FILTRACION EN GEL

SEPARACION DE LOS COMPONENTES DE UN POLIMERO