conceptos bÁsicos de inmunologÍa para biotecnÓlogos dario c. ramirez dr en bioquímica &...

CONCEPTOS BÁSICOS DE INMUNOLOGÍA PARA BIOTECNÓLOGOSDario C. Ramirez

Dr en Bioquímica & Magister en Inmunología

Introducción a la Biotecnología - Licenciatura en Biotecnología 2014

Contacto:Laboratorio de Medicina Experimental y Terapéuticas Cátedra de Genética Molecular E-mail: ramirezlabimibiosl@ymail.com / moleculargenetics.unsl@gmail.comFacebook: ramirezlabimibiosl

Overview 1- Breve reseña historica y conceptos de inmunología2- El sistema inmunológico3- Anticuerpos o inmunoglobulinas 4- La respuesta inmunológica 5- Antígenos, hapteno, adyuvantes e inmunogenos 6- Anticuerpos policlonales/monoclonales7- Marcado de anticuerpos 8- Interacción antigeno-anticuerpo 9- Vacunas y Técnicas inmunoquímicas10- Aplicaciones de los inmunoreactivos en biotecnología

Orígenes de la InmunologíaOrígenes de la InmunologíaEl primer acercamiento a la inmunización con criterios racionales fue realizado por el médico inglés Edward Jenner (1749-1823) en la imagen superior, tras su constatación de que las tamberas que habían adquirido la viruela de la vaca o vacuna (una forma benigna de enfermedad que sólo producía pústulas en las manos) no eran atacadas por la grave y deformante viruela humana.En 1796 inoculó a un niño, fluido procedente de las pústulas vacunales de Sarah Nelmes; semanas después el niño fue inyectado con pus de una pústula de un enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la enfermedad.

El primer abordaje se debió a Louis Pasteur (imagen inferior). Estudiando la bacteria responsable del cólera aviar (Pasteurella aviseptica), observó (1880) que la inoculación en gallinas de cultivos viejos y poco virulentos de esa bacteria, las protegía de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados.

CONCEPTO DE INMUNIDAD

INMUNIDAD

Reacción frente a sustancias extrañas, incluido microorganismos y macromoléculas como proteínas y polisacáridos, sin implicar las consecuencias fisiológicas o patológicas de tal reacción.

LA INMUNOLOGÍA es el estudio de la Inmunidad en su sentido amplio y de los acontecimientos celulares y moleculares que se producen después que nuestro organismo se encuentra con microorganismos u otras moléculas extrañas.

El sistema inmunológico

Vías de Ingreso de los

Antígenos

Células del Sistema Inmune

Mecanismos de Defensa Inespecíficos y Específicos

CARACTERISTICAS DE LOS MECANISMOS

INMUNIDAD NATURAL INMUNIDAD ESPECIFICA

Están presentes antes Son inducidos por la ex- de la exposición posición

No aumentan con las Aumentan con cada exposiciones exposición

Son inespecíficos Son exquisitamente específicos

Hay memoria inmunitaria

Amplifica los mecanismos de la inmunidad natural

ANTICUERPOS

Anticuerpos policlonales y monoclonales

La respuesta inmunitaria

humoral está mediada por moléculas de

anticuerpo que secretan las

células plasmáticas

Inmunoglobulina o anticuerpo

Isotipos de inmunoglobulinas

PROPIEDADES DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Estructura y características fisico-químicas

Funciones efectoras

La respuesta inmunológica:

Producción de anticuerpos

CARACTERISTICAS DE LA RESPUESTA INMUNE

1. ESPECIFICIDAD

2. DIVERSIDAD

3. MEMORIA

4. AUTOLIMITACION

5. DISCRIMINACION

6. ESPECIALIZACION

ANTÍGENO Y ADYUVANTE

• Es capaz de despertar una respuesta inmunitaria en un individuo inmunologicamente competente.

• El antígeno puede ser el propio agente (bacterias o virus), fragmentos de él (flagelos, fimbrias), o proteínas y polisacáridos de su superficie.

• Los adyuvantes son sustancias o preparados químicos que, incorporados al antígeno o inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se logra una economía de antígeno y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos específicos.

HAPTENOS

Moléculas incapaces de inducir una respuesta inmune por sí solas , no obstante si se asocia con otra molécula llamada portadora (carrier) logran inducir la producción de anticuerpos.

Suelen ser moléculas proteicas de bajo peso molecular o moléculas químicas no proteicas.

La respuesta inmunitaria puede llevar a la producción simultánea de anticuerpos contra el hapteno y contra el carrier.

HAPTENO + CARRIER = INMUNOGENO

CARACTERISTICAS ASOCIADAS CON LA INMUNOGENICIDAD Y CANTIDAD DE

INMUNOGENO

La producción de una adecuada respuesta inmune requiere una determinada concentración del antígeno: muy pequeñas cantidades o grandes cantidades pueden alterar la respuesta inmune:

• Pequeñas cantidades inoculadas repetidamente pueden inducir tolerancia.

• Grandes cantidades de antígeno pueden dar lugar a parálisis inmunológica.

Inmunoglobulina = anticuerpo

Inmunoglobulina

No todos los anticuerpos son Gammaglobulinas

Producción de anticuerpos policlonales

Modelos animales para la producción de anticuerpos

Anticuerpos Monoclonales

Anticuerpos idénticos que se unen con un EPITOPE específico y son producidos por un tipo de linfocito B híbrido inmortal con capacidad ilimitada de producción.

Importante avance para inmunología.

Anticuerpos monoclonales

Anticuerpos monoclonales

Anticuerpos idénticos que se unen con un antígeno específico y son producidos por un tipo de linfocito B híbrido inmortal con capacidad ilimitada de producción.

Ventajas sobre Anticuerpos Policlonales

1. Mayor homogeneidad.2. Reproductibilidad de sus efectos, como

consecuencia de su homogeneidad.3. Mayor capacidad potencial de

seleccionar los mejores anticuerpos en afinidad, tipo de reconocimiento.

Anticuerpos policlonales vs anticuerpos monoclonales

Monoclonal• Mouse or rabbit hybridoma• Tends to be ‘cleaner’• Very consistent batch-to-batch• More likely to get false negative

results

Polyclonal• Many different species • Tends to have more non-specific

reactivity• Can have very different

avidity/affinity batch-to-batch• More likely to have success in an

unknown application

Inmunoreactivos derivados de los anticuerpos

http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_monoclonal_antibodies

Identificación de Marcadores Fenotípicos Distintivos de Tipos Celulares Concretos.

Inmunodiagnóstico (Inmunoanálisis). Diagnóstico y Monitoreo (vitaminas, drogas, hormonas,

citocinas, enfermedades, marcadores tumorales, enzimas).

Tratamiento (Artritis Reumatoide, Leucemias de Linf. B, Cáncer de Mama, de Cólon).

Análisis Funcional de Moléculas de Superficie y Secretadas.

Catálisis Biosensores (moléculas orgánicas e inorgánicas).

Aplicaciones biotecnológicas de los anticuerpos monoclonales

INTERACCION ANTIGENO - ANTICUERPO

Especificidad y reversibilidad

Los antígenos (EPITOPES) pueden unirse a cavidades, hendiduras o

superficies extendidas en el sitio de unión de las moléculas de anticuerpo

(PARATOPE)

FUERZAS NO COVALENTES QUE MANTIENE UNIDO EL ANTIGENO AL ANTICUERPO

Antígenos vs epitopes

AFINIDAD

Fuerza de unión entre una zona de fijación de un anticuerpo y un

epítopo de un antígeno.Factores de Interacción

Reversible Kd Normal

10-7 y 10-11 MFuerzas electrostáticasPuentes de HFuerzas de van der WaalsInteracciones Hidrófobas

Kd = concentración de Ag. Necesaria para ocupar sitios

de unión de ½ de anticuerpos en solución.

AVIDEZ

Fuerza de unión entre anticuerpo con todos los

epítopos disponibles.Zona de Equivalencia Zonas de

Exceso

Incremento de concentración de Ag. o de Ac. en medio de

forma que aquellos en estado libre desplacen a los unidos.

Concentración a la cual Ag. y Ac. forman inmunocomplejos con puentes entrecruzados de manera que se encuentren acopladas en grandes masas.

Muchas funciones efectoras ocurren de forma óptima cuando >2 Ac. se encuentran cerca y unidos a Ag.

polivalente.

ESPECIFICIDAD

Capacidad de reconocer Ag. al distinguir con precisión un solo

epítopo específico del Ag.Reconocimiento Reacción

Cruzada

Reacción que se establece entre un epítopo y el Ac. específico para otro Ag. estructuralmente relacionado.

Distinción entre 2 epítopos lineales que difieren sólo en la sustitución de un AA con poco efecto en estructura 2ria.

Permite que los Ac. generados no reaccionen normalmente con

moléculas del propio organismo o Ag. de otro origen.

Enfermedades Autoinmunes

DIVERSIDAD

Presencia de gran número de Ac. que se unen a diferentes Ag.

Repertorio de Ac. Mecanismos Genéticos

Recombinación aleatoria de ADN Genes funcionales Regiones V de cadenas

Adición aleatoria de nucleótidos Recombinación V

Totalidad de Ac. con diferentes especificidades que posee un individuo.

Variaciones estructurales se concentran en regiones

hipervariables de las cadenas, determinando especificidad.

USO DE LOS INMUNOREACTIVOS

•VACUNAS

•TECNICAS INMUNOQUIMICAS

VACUNAS

Inmunización mediante las VacunasLa Inmunización es la técnica de medicina preventiva cuyo objetivo consiste en procurar resistencia inmune frente a un organismo infeccioso. Con este fin, se inocula al individuo una forma del organismo patógeno que no tiene capacidad de producir la enfermedad, pero si de inducir la formación de anticuerpos. Este proceso se denomina también vacunación debido a que la primera técnica de inmunización consistió en la administración del virus de la viruela vacuna para lograr la inmunidad frente a la viruela.El preparado inmunizante se introduce en el organismo a través de la piel (inoculación), salvo algunas excepciones, como la vacuna oral de la polio tipo Sabin. La duración del efecto protector es muy variable, desde seis meses en el caso de la peste hasta diez años para la fiebre amarilla.Las vacunas son la forma más eficaz de protección frente a los agentes patógenos contra los que los antibióticos no son eficaces, por ejemplo los virus. En los países occidentales se administran ciertas vacunas de acuerdo a un calendario oficial de vacunación. Las vacunas se preparan con microorganismos muertos por la exposición al calor o a agentes químicos (como la primera vacuna de la polio desarrollada por Jonas Salk, en la imagen superior, o la vacuna de la fiebre tifoidea); con un toxoide, forma inactivada de la toxina producida por el microorganismo (vacunas del tétanos y la difteria) o con un virus “vivo” atenuado, es decir, un virus debilitado en el laboratorio de manera que no produzca la enfermedad (como la vacuna de la polio desarrollada por Albert Sabin (en la imagen inferior), o las vacunas del sarampión y la fiebre amarilla).

Las VacunasUna Vacuna es un preparado de antígenos procedentes de microorganismos patógenos, cuya finalidad es la creación de anticuerpos que reconozcan y ataquen a la infección y, por lo tanto, produzcan la inmunidad del organismo inoculado.La vacuna suele consistir en dosis muy pequeñas del propio agente (forma inactiva o atenuada) que origina la enfermedad, por lo que provoca la creación de anticuerpos que permanecen en el organismo y lo protegen en el caso de futuros contagios. La técnica de administración depende del tipo de vacuna; la más común es la inoculación, pero en algunos casos es la ingestión o el spray nasal.

Los Sueros

La inmunidad artificial pasiva se adquiere cuando al sujeto se le administra directamente anticuerpos específicos para un patógeno determinado. Los anticuerpos producen inmunidad rápidamente (unas pocas horas), pero su efecto no es de larga duración (sólo unos meses), debido a que no se activa la memoria inmunológica. Estos anticuerpos reciben el nombre de suero o antídoto. Este tipo de sueros se utilizan para inmunizar contra el tétanos, la difteria, la hepatitis (A y B), etc..

TIPOS TRADICIONALES DE VACUNAS Inactivadas: microorganismos

dañinos que han sido tratados con productos químicos o calor y han perdido su peligro. Ejemplos de este tipo son: la gripe, cólera, peste bubónica y la hepatitis A. La mayoría de estas vacunas suelen ser incompletas o de duración limitada, por lo que es necesaria más de una toma.

Vivas atenuadas: microorganismos que han sido cultivados expresamente bajo condiciones en las cuales pierden sus propiedades nocivas. Suelen provocar una respuesta inmunológica más duradera, y son las más usuales en los adultos. Por ejemplo: la fiebre amarilla, sarampión o rubéola (también llamada sarampión alemán) y paperas.

Toxoides: son componentes tóxicos inactivados procedentes de microorganismos, en casos donde esos componentes son los que de verdad provocan la enfermedad, en lugar del propio microorganismo. En este grupo se pueden encontrar el tétanos y la difteria.

Subunitarias: introduce un microorganismo atenuado o inactivo, dentro del sistema inmunitario, para crear una respuesta inmunitaria. Un ejemplo característico es la vacuna subunitaria contra la hepatitis B, que está compuesta solamente por la superficie del virus (superficie formada por proteínas).

NUEVOS TIPOS DE VACUNAS

Conjugadas: ciertas bacterias tienen capas externas de polisacáridos que son mínimamente inmunitarios. Poniendo en contacto estas capas externas con proteínas, el sistema inmunitario puede ser capaz de reconocer el polisacárido como si fuera un antígeno (un antígeno puede ser una proteína o un polisacárido).

Vector recombinante: combinando la fisiología (cuerpo) de un microorganismo dado y el ADN (contenido) de otro distinto, la inmunidad puede ser creada contra enfermedades que tengan complicados procesos de infección.

Vacuna de ADN: vacuna de desarrollo reciente, es creada a partir del ADN de un agente infeccioso. Funciona al insertar ADN de bacterias o virus dentro de células humanas o animales. Algunas células del sistema inmunitario reconocen la proteína surgida del ADN extraño y atacan tanto a la propia proteína como a las células afectadas.

TECNICAS INMUNOQUIMICAS

Marcado de anticuerpos o sus fragmentos con fines diagnósticos

o terapéuticos

Los inmunoensayos mas corrientes

• ELISA• Western blot• Immunoprecipitation• Inmunopurificación• Citometria de Flujo • Immunohistochemistry• …….

Inmunoprecipitación

Inmunopurificación

Citometría de flujo

Western blot, western blotting o inmunoblotting

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Slides by Mathias Bader and Simon Loew

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

55

ELISA detects substances with antigenic properties (mainly proteins)

Based on enzymatic color-reaction

Basic principle of ELISA

Enzyme is used to detect the binding of Antibody - Antigen

Enzyme converts colorless substrate into colored product, indicating the presence of Antibody - Antigen complex

ELISA can be used to detect either presence of Antigens or Antibodies

Direct and Indirect ELISA

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Direct ELISA Indirect ELISA

Slides by Mathias Bader and Simon Loew

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Direct ELISA

Slides by Mathias Bader and Simon Loew

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Antibody is adsorbed onto microtiter plate

Add serum to test for antigen

Specific antigen binds if contained

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Remove test fluid and unbound antigen

Binding of antigen is strong enough to withstand rinsing

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Remove test fluid and unbound antigen

Binding of antigen is strong enough to withstand rinsing

62

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E

E

E

E

E

E

Add enzyme labeled antibody

E E

Labeled antibody binds to antigens

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EE

EE

E

E

Wash sample to remove unbound antibodies

E

E

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EE

E

Wash sample to remove unbound antibodies

E

E

E

E

E

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EE

Wash sample to remove unbound antibodies

E

Slides by Mathias Bader and Simon Loew

67

Add substrate

EEE

Measure color change

Positive Negativ

Slides by Mathias Bader and Simon Loew

Direct and Indirect ELISA

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Direct ELISA Indirect ELISA

Slides by Mathias Bader and Simon Loew

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Indirect ELISA Antigen is adsorbed onto microtiter plate

Add serum to test for antibody

Slides by Mathias Bader and Simon Loew

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Antigen is adsorbed onto microtiter plate

Add serum to test for antibody

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Antigen is adsorbed onto microtiter plate

Add serum to test for antibody

Wash sample

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Antigen is adsorbed onto microtiter plate

Add serum to test for antibody

Wash sample

73

74

E

E

E

E

E

E

E

E

Add secondary antibody

Primary antibody binds to secondary anitbody

75

EEE

E

E

E

E

E

Add secondary antibody

Wash unbound antibodies

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EEE

E

E

E

E

E

Add secondary antibody

Wash unbound antibodies

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EEE

Add secondary antibody

Wash unbound antibodies

78

EEE

Positive Negativo

Add substrate

Measure color change

Direct vs. Indirect ELISA

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Quick methodology – only one AB

Advantages of Indirect ELISA:Immunoreactivity of primary

antibody is not affected by labeling

Cross-reactivity of second AB eliminated

Wide variety of secondary antibodies available on the marketSignal amplification (several epitopes)

EEE

Advantages of Direct ELISA:

EEE

Immobilized Antigen vs. Sandwich

80

Mainly used for antigen detection

Mainly used for antibody detection

ImmobilizedAntigen:

SandwichELISA:

EEE

EEE

Inmunocito/histoquímica

Immunohistochemistry (IHC) combines histological, immunological and biochemical techniques for the identification of specific tissue components by means of a specific antigen/antibody reaction tagged with a visible label. IHC makes it possible to visualize the distribution and localization of specific cellular components within a cell or tissue.

What cellular antigens can we target?

• Cytoplasmic• Nuclear• Cell membrane• Lipids• Proteins

Examine cytoskeletal structure

Rol del biotecnólogo en el desarrollo de inmunoreactivos y

vacunas

Protein

Protein

Protein

Protein Cell Tissue Whole animal

• Heterogeneous Immunoassays

• Mass spectrometry (MS)• Molecular magnetic

resonance imaging (mRMRI)

Stress Reactive chemical species

Detection of nitrone adducts

Immuno-spin trapping

A

B

A

B

Immuno-specific molecular probe

Array de proteínas

Immunoassays in Agricultural and Biotechnology. John Willey & Sons. 2011. http://www.amazon.com/Immunoassays-Agricultural-Biotechnology-Guomin-Shan/dp/047028952X/ref=sr_1_5?s=books&ie=UTF8&qid=1368731369&sr=1-5&keywords=immunoassay#reader_047028952X The Immunoassay Handbook, Fourth Edition: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques

Bibliografía básica

• Tijssen, P. Practice and Theory of Immunoassays. Vol 15. In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier. USA 1985. 549 Pags. ISBN 0-444-80634-2.

• Abbas, Abul K. Inmunología Celular Y Molecular. Elsevier España. 5ª edición. España 2004. 563 págs. ISBN 9781416023890