concentración de la enzima concentración del...

VARIABLES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE

UNA REACIÓN ENZIMÁTICA

t

s

p[ ]

Concepto de velocidad inicial

d[ ]

dtv = , t -> 0

VARIABLES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE

UNA REACIÓN ENZIMÁTICA

• Concentración de la enzima

• Concentración del sustrato

• pH

• Temperatura

• Efectores (Activadores e Inhibidores)

Efecto de la concentración de enzima: relación lineal

v

[E]

. . . . . . . . .. .

S

E

ES

P

EP

Ciclo catalítico

de una enzima

Una cinética lineal implica

un proceso regenerativo,

cíclico

v

[s]

Efecto de la concentración de substrato

..

.. . . . .

E + S ES E + Pk+1

k-1

k+2

Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hay un número limitado de sitios en la enzima

para fijar substrato; una vez que están ocupados

todos, por mucho que aumente la concentración

de substrato, la velocidad permanecerá constante

tendiendo a un valor asintótico

CINETICA ENZIMATICA

CINETICA ENZIMATICA

• La cinética enzimática estudia la velocidad de

las reacciones catalizadas por enzimas.

Estos estudios proporcionan información directa

acerca del mecanismo de la reacción catalítica y

de la específisidad del enzima.

• La velocidad de una reacción catalizada por un

enzima puede medirse con relativa facilidad, ya

que en muchos casos no es necesario

purificar o aislar el enzima.

CINETICA ENZIMATICA

• La medida se realiza siempre en las

condiciones óptimas de pH, temperatura,

presencia de cofactores, etc, y se utilizan

concentraciones saturantes de sustrato.

• En estas condiciones, la velocidad de reacción

observada es la velocidad máxima (Vmax). La

velocidad puede determinarse bien midiendo la

aparición de los productos o la desaparición de

los reactivos.

CINETICA ENZIMATICA

• En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que:

• v1 = k1 [E] [S]

• v2 = k2 [ES]

• v3 = k3 [ES]

CINETICA ENZIMATICA

• Se puede distinguir entre enzima libre (E)

y enzima unido al sustrato (ES), de

forma que la concentración total de

enzima, [ET], (que es constante a lo largo

de la reacción) es:

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que:

v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario,

según el cual la concentración del complejo ES es pequeña y

constante a lo largo de la reacción

CINETICA ENZIMATICA

Por lo tanto, la velocidad de formación del

complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su

disociación (v2+ v3):

v1 = v2 + v3

Además, como [ES] es constante, la velocidad

de formación de los productos es constante:

v = v3 = k3 [ES] = constante.

Como v1=v2+v3, podemos decir que:

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

CINETICA ENZIMATICA

Despejando [ES], queda que:

[ES] = [ET] [S] / Km + [S]

siendo Km = (k2 + k3)/ k1, en donde la expresión (k2 + k3)/ k1 se ha sustituído por Km, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la Km es un parámetro cinético importante.

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Por lo tanto, en el estado estacionario, la

velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] = k3[ET] [S]/ Km + [S]

Para cualquier reacción enzimática, [ET],

k3 y Km son constantes. Vamos a

considerar dos casos extremos:

CINETICA ENZIMATICA

• A concentraciones de sustrato pequeñas

([S] << Km) v = (k3 [ET]/KM) [S].

Como los términos entre paréntesis son

constantes, pueden englobarse en una nueva

constante, kobs, de forma que la expresión

queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la

reacción es un proceso cinético de primer

orden.

CINETICA ENZIMATICA

• A concentraciones de sustrato elevadas

([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax).

Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuentra unido al sustrato.

CINETICA ENZIMATICA

• Si introducimos el parámetro Vmax en la

ecuación general de la velocidad.

Obtenemos la expresión más conocida

de la ecuación de Michaelis-Menten:

V = Vmax [S] / Km + [S]

CINETICA ENZIMATICA

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide .

En la cinética sigmoide, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la Km) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

Razones por la cual la Km es un parámetro

cinético importante

• Km es la concentración de sustrato para la cual

la velocidad de reacción es la mitad de la

velocidad máxima. En efecto, si Km = [S], la

ecuación de Michaelis-Menten se reduce a:

v = Vmax/2.

• El valor de Km da idea de la afinidad del enzima

por el sustrato: A menor Km, mayor afinidad del

enzima por el sustrato, y a mayor Km, menor

afinidad.

Razones que hacen de la Km un parámetro

cinético importante

• La Km del sustrato natural es menor

que la de los sustratos análogos. Si dos

sustratos del mismo enzima tienen distinta

Km, el que presente mayor Km tiene

menor afinidad por el enzima, y la

reacción transcurre siempre a menor

velocidad que con el sustrato de menor

Km, salvo a concentraciones saturantes

de sustrato, donde la v = Vmax.

Razones por la cual la Km es un parámetro

cinético importante

• Los valores de Km de muchos enzimas

son próximos a los de la concentración

fisiológica de sus sustratos, de forma

que pequeñas variaciones en la [S]

pueden suponer grandes cambios en la

velocidad de toda una ruta metabólica.

CALCULO DE LA Km Y DE LA Vmax DE UNA

ENZIMA

• La representación gráfica de la ecuación

de Michaelis-Menten (v frente a [S]) es

una hipérbola. La Vmax corresponde al

valor máximo al que tiende la curva

experimental, y la Km corresponde a la

concentración de sustrato a la cual la

velocidad de la reacción es la mitad de la

Vmax.

CALCULO DE LA Km Y DE LA Vmax DE UNA

ENZIMA

CALCULO DE LA Km Y DE LA Vmax DE UNA

ENZIMA

• Para determinar gráficamente los valores de Km y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk. Es una recta en la cual:

• La pendiente es Km/Vmax

• La abscisa en el origen (1/v = 0) es -1/Km

• La ordenada en el origen (1/[S] = 0) es 1/Vmax

• De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de Km y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

CALCULO DE LA Km Y DE LA Vmax DE UNA

ENZIMA

ACTIVIDAD ENZIMATICA

• Se define la unidad de actividad enzimática

(U) como la cantidad de enzima que cataliza la

conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto.

La actividad específica es el número de

unidades de enzima por miligramo de proteína

(U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).

• Recientemente, el Sistema Internacional de

unidades (SI) ha definido la unidad de actividad

enzimática como la cantidad de enzima que

transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta

unidad se llama katal (kat).

ACTIVIDAD ENZIMATICA

• Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x106 U. Esta unidad es muy grande, de formaque se utilizan frecuentemente los submúltiploscomo el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal(nkat, 10-9 kat).

• Cuando se conoce el peso molecular del enzimapuro y el número de centros activos pormolécula de enzima, las medidas de actividadenzimática permiten calcular el número derecambio del enzima, o sea, el número dereacciones elementales que realiza un enzimapor cada centro activo y por unidad de tiempo.

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables(carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH;imidazol, etc.) en las cadenas laterales de susaminoácidos. Según el pH del medio, estosgrupos pueden tener carga eléctrica positiva,negativa o neutra. Como la conformación de lasproteínas depende, en parte, de sus cargaseléctricas, habrá un pH en el cual laconformación será la más adecuada para laactividad catalítica. Este es el llamado pHóptimo.

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA

• La mayoría de los enzimas son muy sensibles alos cambios de pH. Desviaciones de pocasdécimas por encima o por debajo del pH óptimopueden afectar drásticamente su actividad. Así,la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, laureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene apH 10. Como ligeros cambios del pH puedenprovocar la desnaturalización de la proteína, losseres vivos han desarrollado sistemas más omenos complejos para mantener estable el pHintracelular: Los amortiguadores fisiológicos.

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA

ACTIVIDAD ENZIMATICA

En general, los aumentos de temperatura

aceleran las reacciones químicas: por

cada 10ºC de incremento, la velocidad de

reacción se duplica. Las reacciones

catalizadas por enzimas siguen esta ley

general. Sin embargo, al ser proteínas, a

partir de cierta temperatura, se empiezan

a desnaturalizar por el calor

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA

ACTIVIDAD ENZIMATICA

• La temperatura a la cual la actividad

catalítica es máxima se llama

temperatura óptima. Por encima de esta

temperatura, el aumento de velocidad de

la reacción debido a la temperatura es

contrarrestado por la pérdida de actividad

catalítica debida a la desnaturalización

térmica, y la actividad enzimática decrece

rápidamente hasta anularse.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA

ACTIVIDAD ENZIMATICA