compuestos bioactivos en diferenciación, proliferación y muerte de células madre. josé alberto...

�Compuestos bioactivos en diferenciación, proliferac ión y muerte de células madre

José Alberto Carrodeguas Villar

carrode@unizar.eshttp://bifi.es/

iPS

Patologías que se pueden tratar con células madre

• Enfermedad de Parkinson• Diabetes tipo I• Artritis• Quemaduras• Enfermedades cardiovasculares• Cáncer• Daño en la médula espinal• Enfermedades de la retina

Problemas que puede presentar la terapia con células madre

• Transmisión de virus

• Enfermedades animales

• Crecimiento incontrolado, formación de teratomas

• Crecimiento no dirigido

Diferenciación

Proliferación/muerte

Diferenciación

Proliferación/muerte

Factores que determinan la diferenciación de células madre a tipos celulares concretos

Hipótesis

En colecciones de compuestos químicos (quimiotecas) debe haber moléculas capaces de inducir diferenciación celular específica, muerte o proliferación en células madre

Ensayo

Línea celular de células madre modificada genéticamente para expresar un gen reportero bajo el control de un promotor específico de un tipo celular.

GFP: fluorescencia

Luciferasa: luminiscencia

Línea celular

• Células madre embrionarias de ratón modificadas genéticamente: AMPIGX-7 (CGR8)

• Expresan GFP bajo el control de un promotor específico de cardiomiocitos

• Emiten fluorescencia verde cuando se diferencian a cardiomiocitos

500µm500µm 500µm

1d EBs 2d EBs 3d EBs

5d EBs 7d EBs6d EBs

4d EBs

500µm 500µm 500µm

10d EBs

500µm500µm500µm 500µm

1d EBs 2d EBs 3d EBs

5d EBs 7d EBs6d EBs

4d EBs4d EBs

500µm 500µm 500µm

10d EBs

500µm

Preparación de cuerpos embrioides

Luciferasas secretadas

DIFERENCIACIÓN CLONES METRIDIA LUCIFERASA

0

5000

10000

15000

20000

25000

M1 M2 M3 M4 M5 M6 M14 CGR8 Medio

Clones

2000 células/EB

500 células/EB

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

CGR8 M1 M5 M6 M14

RLU

C-VerapamilForskolinCiclosporina A

Diferenciación

Proliferación/muerte ���������

Ensayo

XTT: proliferación celular (actividad mitocondrial)

Línea celular: CGR8

Contracribado: MEFs

Apoptosis: MEFs DKO Bax/Bak, caspasas, etc.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CPT

Gro

up 1

Gro

up 2

Gro

up 3

Gro

up 4

Gro

up 5

Gro

up 6

Gro

up 7

Gro

up 8

Gro

up 9

Gro

up 1

0Gro

up 1

1Gro

up 1

2Gro

up 1

3Gro

up 1

4Gro

up 1

5Gro

up 1

6Gro

up 1

7Gro

up 1

8Gro

up 1

9Gro

up 2

0Gro

up 2

1Gro

up 2

2Gro

up 2

3Gro

up 2

4Gro

up 2

5Gro

up 2

6Gro

up 2

7Gro

up 2

8Gro

up 2

9Gro

up 3

0Gro

up 3

1Gro

up 3

2Gro

up 3

3Gro

up 3

4Gro

up 3

5Gro

up 3

6Gro

up 3

7Gro

up 3

8Gro

up 3

9Gro

up 4

0

Grupos de 4 compuestos/pocillo

0

20

40

60

80

100

120

140

CPT 26A 26B 26C 26D

Compuestos químicos

ESCs

MEFs

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CPT

Gro

up 1

Gro

up 2

Gro

up 3

Gro

up 4

Gro

up 5

Gro

up 6

Gro

up 7

Gro

up 8

Gro

up 9

Gro

up 1

0Gro

up 1

1Gro

up 1

2Gro

up 1

3Gro

up 1

4Gro

up 1

5Gro

up 1

6Gro

up 1

7Gro

up 1

8Gro

up 1

9Gro

up 2

0Gro

up 2

1Gro

up 2

2Gro

up 2

3Gro

up 2

4Gro

up 2

5Gro

up 2

6Gro

up 2

7Gro

up 2

8Gro

up 2

9Gro

up 3

0Gro

up 3

1Gro

up 3

2Gro

up 3

3Gro

up 3

4Gro

up 3

5Gro

up 3

6Gro

up 3

7Gro

up 3

8Gro

up 3

9Gro

up 4

0

Grupos de 4 compuestos/pocillo

0

20

40

60

80

100

120

140

CPT 26D 199A 223A

Compuestos Químicos

ESCs

MEFs

BrdU ELISA

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Cont

rol D

MSO CPT

P4F2P4

A3

P4E3P4

D5

P4D6

P4H8

P5B2P5

C2P5

B3P5

B5P5

C5P5

A6P5

B6P5

C6

P5E7

P5F8

P5FG

8

Back

grou

nd

Blan

k

Compuestos Químicos

ESCs

MEFs

XTT

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Cont

rol D

MSO CPT

P4F2

P4A3

P4E3

P4D5

P4D6

P4H8

P5B2

P5C2

P5B3

P5B5

P5C5

P5A6

P5B6

P5C6

P5E7

P5F8

P5FG

8

Compuestos Químicos

ESCs

MEFs

Viabilidad celular

Diferenciación celular

Muerte celular

Proliferación celular

Actividad mitocondrial

Efecto en diferenciación EB

Mecanismos moleculares

hES y iPS

Mecanimos moleculares

Mecanismos moleculares

En marcha

En marcha

En marcha

Ensayos muerte iPS. Colaboración con Xavier Doss (NY)

Ensayos en ratones Estudio en teratomas. Colaboración con Eduardo Romanos.

Luciferasa. Colaboración con Agapios Sachinidis (Colonia)

Planes

Celia ConesaVerónica TomeyJavier Sancho

Agapios Sachinidis. Universidad de Colonia

Michael Xavier Doss. Masonic Medical Research Laboratory, NY

Programa Aragonés de Medicina Regenerativa (PAMER)