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03/07/2012
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cromatografía
Curso: Química Analítica II
Loreto Ascar
2012
CROMATOGRAFIA
GAS - SOLIDO
CROMATOGRAFIA
GAS - LIQUIDO
GASES FLUIDO
SUPERCRITICO
LSC
BPC - RP BPC - NP
BPC IEC
GPC GFC
SEC
COLUMNA
TLC PC
PLANAR
LIQUIDO
Tipos de cromatografía en columnas
LSC : Cromatografía sólido-líquido o de adsorción
� BPC : Cromatografía de fase enlazada
IEC : Cromatografía de intercambio iónico
� SEC : Cromatografía de exclusión por tamaños
� BPC-RP : Cromatografía de reparto de fase inversa
� BPC-NP : Cromatografía de reparto de fase normal
� GPC : Cromatografía de permeación en gel
� GFC : Cromatografía de filtración en gel
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CLASIFICACIÓN DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Superficie Plana Columna
En papel (PC)Capa Fina (TLC)
Electrocromatografía (EC)
De gasesLíquida
Fluidos supercríticos
De acuerdo al tipo de contacto existente entre las 2 fasesinvolucradas
Cromatografía en papel
Técnica de mediana resolución en el cual una mezcla de solutos sembrada sobre un papelde filtro logra separarse entre si basándose en:
Los diferentes coeficientes de partición de los solutos entre la fase estacionaria (fibra decelulosa del papel) y la fase líquida orgánica móvil, subiendo a través del papel porcapilaridad.
Diferencias en la adsorción del soluto a las fibras de celulosa y disolución en la fase móvil.
Cromatografía en Capa fina (TLC)
Soporte del adsorbente, láminas de:
VidrioPlástico (ej: acetato)Metal (ej: aluminio)
Fases Estacionarias:
Gel de Sílica (Se utiliza en el 80% de las separaciones)Alúmina (Óxido de Aluminio)Celulosa (Nativa o microcristalina)Poliamidas
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Cromatografía en Capa fina (TLC)
Fase Móvil
Ácidos CarboxílicosAlcoholesAminasTiolesAldehidosCetonasEsteresÉteresHidrocarburos no saturadosHidrocarburos Saturados
Polar
Apolar
Cromatografía en Capa fina (TLC)
Fase Móvil
Éter de petróleoToluenoDietil-éter, t-butil-éterDiclorometanoAcetato de etilon-pentano, n-hexanoCiclohexanoTetracloruro de carbonoCloroformoAcetonaIso-propanolEtanolMetanolÁcido acético
El índice de retención Rf (Ratio of Front): Distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación / distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente
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Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Muestras: líquidas (no volátiles) sólidas disueltas en un solvente adecuadotermolábiles
• Fase móvil: líquido
• Fase EstacionariaOrigen: columnas de vidrio
Diámetro: 1 a 5 cmLongitudes: 50 a 500 cmDiámetro partículas: 150 a 200 µmTiempos de análisis largos (varias horas)
Altura de plato teórico (H)
dp: Diámetro de las partículas de relleno, cm
λ : Factor de empaque
Rellenos de 3 a 10 um ���� HPLC
Tipos de cromatografía líquida de alta resolución
• Cromatografía de reparto
• Cromatografía de adsorción o líquido-sólido
• Cromatografía iónica
• Cromatografía de exclusión por tamaños o de geles
Permite la determinación de:
Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos,cabohidratos, fármacos, plaguicidas, antibióticos, esteroides,especies organometálicas y especies inorgánicas
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Instrumentación para HPLC
Instrumentación para HPLC
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Recipientes para la fase móvil
•Filtrar la fase móvil•Desgasificar•Un solo disolvente o una mezcla
Desgasificación de la fase móvil
Bombeo de vacíoDestilaciónReflujoAgitaciónPurga con gas inerte (He)Desgasificador en línea
Características de la Fase móvil
�Componentes de la muestra deben ser solubles en ella
�No degradar ni disolver la fase estacionaria
�Tener baja viscosidad
�Compatible con el detector
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Tipos de elución
Isocrática
Composición de la fase móvil constante en el tiempo
En Gradiente
Composición de fase móvil variable en el tiempo
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Elución Isocrática
(1) Alcohol bencílico(2) Fenol(3) 3´,4´-dimetoxiacetofenona(4) Benzoína(5) Benzoato de etilo(6) Tolueno(7) 2,6 dimetoxitolueno(8) o-metoxibifenilo
A: Tampón acuoso (KH2PO4 25mM a pH 3,5)
B: Acetonitrilo
(1) Alcohol bencílico(2) Fenol(3) 3´,4´-dimetoxiacetofenona(4) Benzoína(5) Benzoato de etilo(6) Tolueno(7) 2,6 dimetoxitolueno(8) o-metoxibifenilo
Elución en Gradiente
Sistemas de Bombeo
• La bomba debe proporcionar un flujo continuo yreproducible en el tiempo
• Debe ser capaz de entregar presiones de trabajoaltas, debido al pequeño tamaño de las partículas derelleno
• Libre de pulsaciones
• Intervalo de caudal 0,1 a 10 mL/min
• Componentes resistentes a la corrosión
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Tipos de bombas
• De desplazamiento
• Neumáticas
• Recíprocas
Bombas Recíprocas
Sistema de inyección de muestra
• Precisión en la medición de la muestra, es un factor limitante en HPLC
• Se debe introducir la muestra como un tampón
• No se debe despresurizar el sistema
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Válvulas Inyectoras, válvulas de loop o bucles
Columnas y Fases Estacionarias
• La columna consiste en un segmento de tubode algún material inerte, de diámetrouniforme y capaz de resistir altas presiones.
• Existen de vidrio de paredes resistentes y deacero inoxidable (mas utilizado)
• Existen de diferentes tamaños y rellenos
• Existen columnas analíticas y preparativas
Columnas para HPLC
Diámetro interno: 4 a 10 mm
Longitudes: 10 a 30 cm
Diámetro partículas: 5 a 10 µm
40000 a 60000 platos/metro
Actualmente se están elaborando columnas maspequeñas , de hasta 7,5cm de largo y con rellenosmenores a 2 µm, logrando obtener del orden de100000 platos /metro
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Precolumnas o columnas de resguardo
• Son de relleno similar al de la columna analítica
• Tamaño de partícula mayor, para evitar caídas de presión
Tipos de relleno
�Pelicular, bolas de vidrio o polímeroEn la superficie de las bolas se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina, resina sintética (poliestireno-divinilbenceno) o de una resina de intercambio iónico. Estos rellenos se suelen utilizar en las precolumnas
�Partícula porosa, micropartículas porosas con diámetros de 3 a 10 µmSobre las partículas también se deposita una capa delgada de sílice, alúmina, resina sintética (poliestireno-divinilbenceno) o de una resina de intercambio iónico, siendo la sílice la mas común en HPLC
Detectores
• Adecuada sensibilidad
• Estabilidad y Reproducibilidad
• Respuesta lineal en un rango amplio
• Tiempo de respuesta corto
• Fiabilidad y manejo sencillo
• Respuesta semejante para todos los solutos e idealmente selectiva
• No destructivo
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Detectores
• Basados en propiedad del soluto
– Absorbancia UV
– Fluorescencia
– Corriente límite
• Basados en propiedad de la disolución (fase móvil)
– Índice de refracción
– Constante dieléctrica
– Densidad
Detectores de Absorbancia
A = log P0 / P = abC
0P
PT =
P
PA 0log=
TA log−=
�Filtros, aisla una línea intensa por medio de filtros: 254, 250, 313,334 y 365 nm
�Monocromadores, se puede hacer un barrido de longitudes de onda (detectores de arreglo de diodos)
Detectores de AbsorbanciaExisten los de Filtros y los Monocromadores
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Esquema de una celda de flujo en forma de Z
DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN
Un detector de índice de refracción (IR) es eldetector de uso más universal.
El índice de refracción de un compuesto es funciónde su densidad molecular.
Una variación de la densidad se traduce en uncambio en el índice de refracción.Un refractómetro es sensible a:
- Cambios en la concentración de la muestra odel disolvente- Cambios de presión y temperatura.
Detectores de Fluorescencia
Estado SingleteFundamental
Estado SingleteExcitado
Estado TripleteExcitado
F = K C solo cuando εεεεbc ≤≤≤≤ 10-2
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Detectores Electroquímicos
�Se basan en la oxidación o reducción de loscompuestos eluídos frente a un electrodo
�Alta sensibilidad, sencillez, selectividad yextensa aplicabilidad
Grupos funcionales orgánicos detectables potencialm ente por medidas amperométricas
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Detectores de conductividad
Se mide continuamente la conductividad específicadel eluyente, por lo tanto la presencia de muestraprovoca un cambio en la conductividad de la fasemóvil.
Con este detector sólo se puede trabajar ensistema isocrático.
Una de las desventajas de este detector es lainestabilidad de la celda.
DETECTORES APLICACIÓN
Absorbancia Cromóforos, compuestos que absorben luz
Fluorescencia Fluoróforos, selectivo
Electroquímico Selectivo para compuestos electroactivos
Índice de Refracción Universal, mide cambios en el IR
Conductividad Específico para todos los iones
DETECTORES HPLC LÍMITES DE DETECCIÓN
Absorbancia 10 pg
Fluorescencia 10 fg
Electroquímico 100 pg
Índice de Refracción 1 ng
conductividad 100 Pg - 1 ng
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