clase de replicacion de adn (1)

Replicación del ADN

El significado genético de la replicación es el de conservar la información genética. La estructura del ADN en doble hélice permite comprender como dicha molécula puede dar lugar a copias sin perder su conformación

Replicación del ADN

La estructura del DNA es una doble hélice, formada por cadenas orientadas en direcciones opuestas (antiparalelas). La estructura se mantiene gracias a enlaces de hidrógeno entre las bases nitrogenadas que se encuentran orientadas hacia el interior de las cadenas

Es esencial a la relación íntima entre estructura molecular y función genética del ADN, y por tanto el concepto de molde.

La complementariedad de las bases nitrogenadas permite que la secuencia de una cadena sencilla de DNA actúe como un molde para la formación de una copia complementaria de ADN (replicación) o de mARN (transcripción)

Posibles modelos de replicación

Replicación del ADN•Semiconservativa: una cadena sirve de molde para una nueva cadena

• El experimento de M. Meselson y F. Stahl (1958) demuestra que la replicación es semiconservativa

• En gradiente de cloruro de cesio

Mathew Meselson Frank Stahl

La enzima que lleva a cabo la replicación del ADN es la ADN polimerasa, esta enzima tiene unos requerimientos específicos para trabajar, que le imponen restricciones:

1. Sólo añade nucleótidos en la dirección 5’ 3’. 2. Necesita para poder empezar a copiar y unir nucleótidos un molde de ADN. 3. Necesita un pequeño trocito de ARN al cual unir los nucleótidos, ya que ella no puede empezar a unir los nucleótidos sin tener una pequeña cadena ya formada. 4. Utiliza nucleótidos trifosfato.

Las polimerasas conocidas añaden nucleótidos solamente en la dirección 5’ 3’

•Enzimas que sintetizan (replican) el ADN• E. coli

• DNA polimerasa I (rellena huecos y repara)• DNA polimerasa II y III (función principal en la

síntesis)• Añade bases en ambas cadenas en la

dirección 5’ 3’• Requiere un 3’ OH final

Dadas las necesidades de esta enzima y sabiendo que la molécula de ADN está formada por dos hebras antiparalelas, se plantea un problema en la cadena de ADN que va en la dirección 5’ 3’, porque aquí la enzima estaría trabajando en la dirección contraria, y sin embargo, se observa que las dos hebras se van replicando.

La solución al dilema la dio el descubrimiento, en 1968, por Okazaki de unos fragmentos constituidos por unos 50 nucleótidos de ARN y entre 1.000 y 2.000 nucleótidos de ADN, denominados fragmentos de Okazaki. Así se podía explicar como se copia esta cadena, siendo de forma discontinua en la dirección 5’ 3’ y la otra cadena de forma continua. También quedaba solucionado el problema de que la enzima necesitara una cadena de ARN a la cual unir los nucleótidos

El cebador es más proclive al error, por lo que debería eliminarse y el RNA puede detectarse y

eliminarse fácilmente por la DNApol I

¿Por qué el cebador es RNA?

Proceso de la replicación

- Existe una secuencia de nucleótidos en el ADN llamada origen de replicación que actúa como señal de iniciación.

- Las cadenas de ADN están unidas por puentes de hidrógeno, que debemos romper para facilitar la separación de las cadenas para ser copiadas, esta separación la lleva a cabo las enzimas helicasas.

- Como el desenrollamiento de la doble hélice da lugar a superenrollamientos en el resto de la molécula, capaces de detener el proceso, se hace preciso la presencia de las enzimas topoisomerasas que eliminen las tensiones en la fibra.

- A continuación, para evitar que las dos hebras vuelvan a reunirse y formar los puentes de hidrógeno se colocan unas proteínas llamadas SSB (Single-Strand DNA Binding proteins), que estabilizan las cadenas sencillas.

El proceso es bidireccional, es decir, hay una helicasa trabajando en un sentido y otra trabajando en sentido opuesto. Se forman pues las llamadas burbujas u ojos de replicación.

Como ninguna ADN-polimerasa puede actuar sin cebador, interviene primero una ARN polimerasa (primasa) que si lo puede hacer, sintetiza un corto fragmento de ARN de unos 10 nucleótidos denominado primer que actúa como cebador

Después interviene la ADN polimerasa III, que a partir de este cebador comienza a sintetizar en dirección 5’ 3’ una hebra de ADN partir de nucleótidos trifosfato. La energía necesaria para el proceso es aportada por los propios nucleótidos que pierden dos de sus fósforos. Esta nueva hebra se sintetiza en el sentido que se abre la horquilla de replicación, es de crecimiento continuo y se denomina hebra conductora.

Sobre la otra hebra (hebra discontinua o retardada) la ARN polimerasa sintetiza unos 40 nucleótidos de ARN en un punto que dista unos 1.000 nucleótidos de la señal de iniciación. A partir de ellos la ADN polimerasa III sintetiza unos 1.000 nucleótidos de ADN, formándose un fragmento de Okazaki. Este proceso se va repitiendo a medida que se van separando las dos hebras patrón.

A continuación interviene la ADN polimerasa I, que, primero, gracias a su función exonucleasa, retira los segmentos de ARN, y que luego, gracias a su función polimerasa, rellena los huecos con nucelótidos de ADN

Finalmente la ADN ligasa unirá los dos extremos, tanto en la cadena continua como los sucesivos fragmentos de Okazaki que se van formando en la cadena discontinua.

Cuando se observa como se produce la replicación se ve que la cadena continua va más rápida que la discontinua, esto es debido a que cada vez que se forma un fragmento de Okazaki hay que realizar todo este proceso como si se comenzara la síntesis de nuevo, formando el primer y el resto de pasos, sin embargo, en la continua solo se realizará una vez.

Replicación del ADN

• Eucariotas • 5 polimerasas

• y principal en replicación• , y exonucleasas

• Corrección de pruebas: actividad 3’ 5’ exonucleotídica. Sustituye bases mal emparejadas (10-5) por correctas (10-7); mecanismos de reparación adicionales la reducen hasta 10-10

Es similar a la de los procariontes, es decir, semiconservativa y bidireccional. Existe una hebra conductora que sintetiza de manera continua y la retardada de forma discontinua con fragmentos de Okazaki.

Sin embargo, la replicación en eucariotas presenta ciertas peculiaridades:

El ADN de los eucariontes está fuertemente asociado a los octámeros de histonas, en forma de nucleosomas, por lo que además de replicarse el ADN, deben duplicarse también las histonas. Al parecer, tanto los nuevos nucleosomas como los antiguos se reparten de manera aleatoria entre las dos nuevas hebras hijas: en la retardada y en la conductora.

La longitud del ADN de un cromosoma eucariótico es mucho mayor que el ADN bacteriano, de ahí que no haya un único origen de replicación. Para que el proceso sea más rápido, existen numerosas burbujas de replicación a lo largo de cada cromosoma.

No funcionaría la corrección de errores por falta de un trifosfato que suministre la energía de enlace covalente azúcar-fosfato.

¿Por qué no hay una enzima que polimerice en la dirección 3´-> 5?

Por tanto la adición de nucleótidos siempre es en dirección

5’3’

P P P P PP P

PP

P

OH

PP

P

PP

P

PP OH

PP

OHPP

PP+ H2O

PP

OHPP

P P P PPP

P P

OH

PP

P

PP

PPP

P

OH

P

PP

5’ 3’

Que pasaría?

Si la adición de nucleótidos fuera en el sentido de 3’5’

(hipotética)

PP+ H2O

P PP

PP

OH

PPP

PP

P

PPPPPPP

OH

PP

POH P P

P

OH

P P

PP

OH

PP PP

PPPPPPPP

PPPP

OH

PPPP

3’ 5’

Corrección de errores

OH

P

OH

5’ 3’

PP

P P

PP

P

PP

P

PP

P P P P P

PP

OHPP

PP+ H2O

PP

P P

OH

PP

P

PP

PPP

P P P P P

OH

P

PP

P

Adición 5’3

OH

P

OH

3’ 5’

PP

PP

PPP

PP

P

PP

PPPPP

POH P P

P

Adición 3’5’(hipotética)

Replicación del DNA (2)

•Replicación: continua (cadena adelantada, cebador sólo inicio) y discontinua (cadena retrasada)

• Discontinua• Cebador (pequeño RNA 2-60 nucleótidos añadido

por enzima primasa o RNA pol que provee 3’ OH. • Fragmento de Okazaki por DNA pol III (1500 bp en

procariotas y 150 en eucariotas)• Pol I elimina cebador 3’ -> 5’ y llena huecos (gap)• Ligación (DNA ligasa, enlace fosfodiéster)

El replisoma: complejo enzimático de la replicación que coordina la síntesis de las dos cadenas, maquinaria molecular•Dímero de la DNA pol III (núcleos catalíticos)•Primosoma: formado por dos enzimas•Primasa •Helicasa (desenrolla el DNA)•Proteína de unión a cadena sencilla, ssb (Unión Y, estabiliza el DNA de cadena sencilla)•Topoisomerasas tipo I (rotura una cadena) y II (rotura de dos cadenas) junto a DNA ligasa -> Relajación del superenrollamiento

Replicación del DNA (3)

El replisoma: una maquinaria de replicación extraordinaria

Topoisomerasas

•Origen de replicación: • Secuencia reconocida (Ori C en E. coli) por proteínas

iniciadoras. Varios orígenes en eucariotas• La replicación es bidireccional

Replicación del DNA (4)

Horquilla replicación

En el DNA nuclear de eucariotas hay muchos orígenes de replicación (~500 en levaduras y 60000 en mamíferos). Cada unidad de replicación

es un replicón. La replicación es bidireccional

En el DNA nuclear de eucariotas hay muchos orígenes de replicación (~500 en levaduras y 60000 en mamíferos). Cada unidad de replicación

es un replicón. La replicación es bidireccional