cèl·lules mare sunion

CÈL·LULES MARE I MEDICINA REGENERATIVA

Begoña AranBanc de Línies Cel·lulars

Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona

CÉLULAS MADRE

Se trata de células indiferenciadas que se han localizado en la masa celular interna del blastocisto, en algunos tejidos fetales, en el cordón umbilical y la placenta y en varios tejidos adultos.

Son células pluripotentes (o en algunos casos totipotentes) que dan lugar a células y tejidos especializados.

Su utilidad estriba en la utilización para tratamientos de patologías con pérdida de función celular

células madre adultas

• son células indiferenciadas que se hallan en tejidos adultos diferenciados y que son capaces de renovarse a sí mismas y diferenciarse en todos los tipos celulares del tejido del que provienen.

• algunas pueden ser pluripotentes.

• se encuentran en hígado, médula osea, pancreas, piel, cerebro, sangre…

células madre adultas

su frecuencia es baja, son difíciles de identificar y purificar, su proliferación es limitada y son difíciles de mantener en un estado indiferenciado.

células madre fetales

• se trata de tipos celulares primitivos que se hallan en el feto y que pueden desarrollarse en células madre neuronales, células madre hematopoyéticas (cordón umbilical y placenta), progenitores

de islotes pancreáticos.

células madre embrionarias

son las que derivan de la masa celular interna (MCI) de un blastocisto (día +5/6 de desarrollo,

150 células). Las células de la MCI dan lugar a las 3 líneas del embrión: ectodermo, mesodermo y endodermo. MCI

In vitro

In vivo

HISTORIA

1878 Intentos de Fecundación in Vitro ovocitos de mamífero

1959 1º éxito de Fecundación in Vitro (FIV) (conejo) en USA

1968 1º intento de FIV en humanos

1978 1º nacimiento de FIV en humanos (Edwards y Steptoe-Louise Brown)

1984 Nacimiento España (Victoria Anna)

0

250

500

750

1000

1250

1980 1985 1990 1995 2000 2005

CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad

Autorenovación DiferenciaciónDivisionasimétrica

Modelo de enfermedadesy desarrollo de fármacos

Terapia celular

Estudio del desarrollo y organogénesis

ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM

Alteraciones neurodegenerativas

Accidentes vasculares

Lesiones medulares

Fallo cardíaco

Diabetes mellitus

• Consentimiento informado de las parejas• Aprobación del Comité Ético• Aprobación de la Comisión de Seguimiento y Control de la Donación de Células y Tejidos Humanos del Instituto de Salud Carlos III (Madrid)

Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona CMR[B]

Centros de Reproducción Asistida

Proyecto: Derivación de CME en condiciones libres de xenobiòticos y caracterización in vivo de su pluripotencialidad

Eliminación de la zona pellucida

- 5mg/ml pronasa- Ac. Tyrode’s

Eliminación del trofectodermo medianteinmunocirugía (anticuerpos)

Monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados (CCD1112SkATCC), en placas cubiertas de gelatina (0.1%)Feeders cells

Descongelación embriones

Cultivo hasta blastocisto

D+5/6

Derivación células madre embrionarias

Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados, en placas cubiertas de gelatina (0.1%)

Derivación células madre embrionarias

CULTIVO

KO-DME Medium supplementado con: 2 mmol/l Glutamax

0,05 mmol/l 2-mercaptoethanol 8 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF)

1% non-essential amino acids 20% KO-Serum Replacement 0,5% penicillin-streptomycin

37ºC y 5%CO2

Derivación ES[2]

p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x)

p1 d2 (4x) p1 d6 (4x)p0 d12 (10x)

CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

CULTIVO Bajo condiciones

adecuadas de cultivo (cultivo sobre fibroblastos de ratón - humanos, Matrigel, Fibronectina), las CME mantienen su estado indiferenciado indefinidamente.

CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

DERIVACIÓN Y CULTIVO

• Es imprescindible para poder utilizar las líneas celulares establecidas que los cultivos se lleven a cabo con métodos libres de soporte animal (anticuerpos y complemento inmunocirugia, feeders, suero, etc)

Fosfatasa alcalina

cariotipo

Microsatélites & HLA

Actividad Telomerasa

Immunocitoquimica para marcadores de diferenciación In vitro

Formación de cuerpos embrioideos

Inmunohistoquímica para marcadores de diferenciación In vivo (formación teratomas)

Caracterización

Inmunocitoquimica para marcadores de pluripotencialidad

cariotipo

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro

Embryoid bodies

3 líneas germinales:

- Ectodermo: neuronas

- Endodermo: miocardiocitos

- Mesodermo: tejido glandular

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro

Ectodermo: beta-tubulina

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro

Endodermo: Alfa-feto proteina

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro

Mesodermo: alfa-actinina

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo

Teratomas Ratones SCID de 8 semanas

1millón células

• intramuscular

• subcutáneo

• en algunos órganos

2 meses

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo

Mesodermo (Cartilago) Endodermo (epitelio respiratorio)

Endodermo (epitelio respiratorio)

Mesodermo (Cartilago)

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo

DIFERENCIACIÓN Quedan por establecer los factores genéticos y/o ambientales que controlan el desarrollo de las CME y su importancia durante los distintos estadíos de diferenciación

Diferenciación de las CME

• ADIPOCITOS• ASTROCITOS• CARDIOMIOCITOS• CONDROCITOS• CÉL. HEMATOPOYÉTICAS• CÉL. DENDRÍTICAS• CÉL. ENDOTELIALES• KERATINOCITOS• HEPATOCITOS

• PRECURSORES LINFOCITOS• MASTOCITOS• NEURONAS• OLIGODENDROCITOS• OSTEOBLASTOS• ISLOTES PANCREÁTICOS• MÚSCULO LISO• MÚSCULO ESTRIADO• TROFECTODERMO

*gametos (ratón)

PROBLEMAS TÉCNICOS

• Diferenciación, desdiferenciación y transdiferenciación: control del crecimiento, migración, destino y diferenciación celular para asegurar procesos estables

• Desarrollo tisular inadecuado• Aparición de tumores• Aislamiento y purificación• Rechazo inmunológico• Funcionalidad y viabilidad• Condiciones de cultivo (GMP)

TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO

Como evitarlo?• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM• Inducción de inmunotolerancia: administración previa

de material embrionario o hematológico del donante• CM procedentes de embriones clonados mediante

transferencia nuclear

CLONACIÓN POR TRANSFERENCIA DE NÚCLEO

Producción de un individuo genéticamente idéntico por transferencia del núcleo de una célula somática a un ovocito del cual se ha eliminado el núcleo

Nacimiento del primer mamífero superior a partir de una célula de un individuo adulto

Oveja, macaco, cerdo, vaca, gato, ratón, conejo, mula, ciervo, caballo, cabra, perro

Dolly y su madre portadora

TRANSFERENCIA NUCLEAR                                        

                                                     Nature 385, 810 - 813 (27 February 1997)

Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cellsI. Wilmut, A. E. Schnieke*, J. McWhir, A. J. Kind* & K. H. S. CampbellRoslin Institute (Edinburgh), Roslin, Midlothian EH25 9PS, UK*PPL Therapeutics, Roslin, Midlothian EH25 9PP, UK

CLONACIÓNTRANSFERENCIA DE NUCLEAR (SCNT)

embriónTransferencia a oveja portadora

Dolly

célula de glándula mamária

Transferencia a ovocito enucleado

Transferencia nuclear

• Pluripotentes• Paciente-compatibles (mitocondria?)• No aún en humanos • Problemas éticos

Ovocito MII

Enucleación

Transferencia nuclear y activación

Blastocisto

Derivacion CMEByrne et al., 2007

Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad

Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad

Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad

Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad

Reprogramación de células somáticas (IPS)

• Paciente-compatible• No problemas éticos• Disponible en humanos• Pluripotentes ?• Integración medianter vector

(virus)• Segura? Activación oncogenes,

transmisión línea germinal?)

Fibroblastos

Células ES-like

Takahashi et al., 2007Nakagawa et al., 2007Park et al., 2007

Integración genes (virus)

KeratinocitosDia 0

Pequeña colonia ES-like10 días post-infección

Típica colonia iPS20 días post-infección

Colonias iPSAP positivas

KIPS: Generación a partir de keratinocitos

Aasen, 2008 Nat Biotech.

BANCOS DE IPS

Daley Q. et al. Cell 2008

• Las iPS paciente-específicas podrían representar modelos experimentales para estudiar distintas enfermedades, ensayar tratamientos y posibles terapias génicas.

• Se han generado ya 11 líneas distintas de iPS procedentes de pacientes con enfermedades graves: enfermedades neurodegenerativas, metabólicas, cardiovasculares, diabetes.

Moltes gràcies per la vostra atenció

baran@cmrb.eu