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CARACTERIZACIÓN Y PRUEBAS DE PATOGENICIDAD CRUZADA ENTRE AISLAMIENTOS DE Colletotrichum spp. OBTENIDOS DE
FRUTOS DE LULO (Solanum quitoense Lam), TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betacea Sendt), GRANADILLA (Passiflora ligularis Juss), MANGO (Mangifera indica L) Y TALLOS DE MORA (Rubus glaucus
Benth) CON SÍNTOMAS DE ANTRACNOSIS
CAMILO ADOLFO CONTRERAS HERNÁNDEZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Microbiólogo Agrícola y Veterinario
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTA
2006
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
CARACTERIZACIÓN Y PRUEBAS DE PATOGENICIDAD CRUZADA ENTRE AISLAMIENTOS DE Colletotrichum spp. OBTENIDOS DE
FRUTOS DE LULO (Solanum quitoense Lam), TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betacea Sendt), GRANADILLA (Passiflora ligularis Juss), MANGO (Mangifera indica L) Y TALLOS DE MORA (Rubus glaucus
Benth) CON SÍNTOMAS DE ANTRACNOSIS
CAMILO ADOLFO CONTRERAS HERNÁNDEZ
APROBADO
______________________________ Maria Clemencia De La Rotta
Ingeniera Agrónoma M.Sc. Fitopatología Directora
________________________ ________________________
Jimena Sánchez José Salvador Montaña Microbióloga Biólogo
CARACTERIZACIÓN Y PRUEBAS DE PATOGENICIDAD CRUZADA ENTRE AISLAMIENTOS DE Colletotrichum spp. OBTENIDOS DE
FRUTOS DE LULO (Solanum quitoense Lam), TOMATE DE ÁRBOL (Solanum betacea Sendt), GRANADILLA (Passiflora ligularis Juss), MANGO (Mangifera indica L) Y TALLOS DE MORA (Rubus glaucus
Benth) CON SÍNTOMAS DE ANTRACNOSIS
CAMILO ADOLFO CONTRERAS HERNÁNDEZ
APROBADO
______________________ ___________________ ANGELA UMAÑA MUÑOZ LUIS DAVID GÓMEZ Ph.D Biología Microbiólogo Decana Académica Directo de Carrera
v
Agradecimientos
A Dios.
A mi mamá Blanca Cecilia Hernández Sandoval, por brindarme la
oportunidad de estudiar y ser alguien en la vida; a mi padre, Jorge Enrique
Contreras Fino; a mis hermanos Ernesto, Karla, Lucy, Marilyn y a mis
sobrinas Valentina y Juanita por su apoyo moral, compartir conmigo los
buenos y malos momentos y brindarme todo su apoyo.
Un agradecimiento muy especial a mi novia Angie, por su gran colaboración
y por ser una persona tan maravillosa; y a Pilar Rojas Gracia por sus aportes
en la investigación.
María Clemencia de la Rotta, por sus enseñanzas, por ser una gran persona,
por preocuparse en promover la investigación en busca de respuestas y
alternativas que nos permitan vivir un mejor mañana, por orientarme, por su
gran interés y apoyo.
A Sandra Fernanda Cerón Guerrero. Laboratorio de Cuarentena Vegetal,
ICA. por su apoyo.
A Sandra Gómez. Laboratorio Fitopatología. Universidad Nacional.
A Carlos, Jesús, Rubén, Mateo . Universidad Nacional.
vi
RESUMEN
Doce aislamientos de Colletotrichum spp, aislados de frutos de granadilla,
lulo, mango, tomate de árbol y tallos de mora fueron estudiados para
describir aspectos morfológicos, culturales y su potencial de infección
cruzada. Las características evaluadas fueron la morfología y tamaño de las
conidias, el color de la colonia y el crecimiento de las colonias a diferentes
temperaturas. La morfología de las conidias varió significativamente entre los
aislamientos (p<0.05); el tamaño de las conidias no varió en cuanto a
longitud (p<0.05) pero se presentaron diferencias significativas en el ancho (p
>0.05) de las mismas. La tasa de crecimiento óptima para los asilamientos
de frutos de clima frío moderado se presentó a los 20ºC, mientras que para
mango se presentó a los 28ºC.
Las pruebas de sensibilidad al benomyl en dosis de 1g/L y de 1,5 g/L y la
prueba cualitativa de la proteasa fueron realizadas para determinar la
presencia de al menos dos especies causantes de la antracnosis; C.
gloeosporioides y C. acutatum. La patogenicidad de los aislamientos se
evaluó inoculando bloques de agar y suspensiones conidiales ajustadas a
1x105 conidia/ml sobre los frutos y tallos con y sin heridas. Se demostró el
potencial de infección cruzada entre los asilamientos de clima frío moderado
y mango en los tratamientos con heridas y sin heridas.
vii
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 12
2. OBJETIVOS................................................................................................. 14
3. REVISIÓN DE LITERATURA....................................................................... 15
3.1. Granadilla (Passiflora ligularis Juss) ...................................................15
3.1.1. Botánica y descripción de la planta ..............................................15
3.1.2. Condiciones agroecológicas.........................................................16
3.1.3. Plagas .........................................................................................17
3.2. Lulo (Solanum quitoense Lam) ...........................................................17
3.2.1. Botánica y descripción de la planta ..............................................18
3.2.2. Condiciones agroecológicas.........................................................19
3.2.3. Plagas ..........................................................................................19
3.3. Mango (Mangífera indica L.) ...............................................................20
3.3.1. Botánica y descripción de la planta ..............................................20
3.3.2. Condiciones agroecológicas.........................................................22
3.3.3. Plagas ..........................................................................................23
3.4. Mora de castilla (Rubus glaucus Benth) .............................................23
3.4.1. Botánica y descripción de la planta ..............................................24
3.4.2. Condiciones agroecológicas.........................................................25
3.4.3. Plagas ..........................................................................................27
3.5. Tomate de árbol (Solanum betaceum cav Sendt)...............................27
3.5.1. Botánica y descripción de la planta ..............................................28
3.5.2. Condiciones agroecológicas.........................................................30
3.5.3. Plagas ..........................................................................................30
3.6. Agente causal de la antracnosis .........................................................31
3.6.1. Posición taxonómica.....................................................................32
3.6.1.1. Estado anamorfo ...................................................................... 32
viii
3.6.1.2. Estado telomorfo ...................................................................... 32
3.6.2. Generalidades del patógeno ........................................................32
3.6.2.1. Desarrollo de la enfermedad ................................................... 34
3.6.2.1.1 Germinación y formación del apresorio. ................................. 34
3.6.2.1.2. Formas de penetración.......................................................... 36
3.6.2.1.3. Infección y colonización de tejidos vegetales ........................ 37
3.6.2.1.3.1. Patógenos hemibiotróficos .......................................... 38
3.6.2.1.3.2. Patógenos subcuticulares intramurales ...................... 39
3.6.2.1.3.3. Desarrollo y reproducción necrotrófica........................ 40
3.6.2.2. Fuentes de inóculo y dispersión ............................................... 41
3.6.2.3. Infección quiescente y latente ........................................... 43
3.6.2.4. Síntomas y rango de hospederos............................................. 46
3.6.2.5. Consideraciones epidemiológicas ............................................ 49
3.6.2.6. Métodos diagnósticos............................................................... 51
3.6.2.7. Control de la enfermedad ......................................................... 52
4. MATERIALES Y MÉTODOS:....................................................................... 54
4.1 Tipo de estudio......................................................................... 54
4.2 Recolección de muestras......................................................... 55
4.3 Aislamientos............................................................................. 55
4.4. Conservación de los aislamientos........................................... 57
4.5. Caracterización macroscópica ................................................ 57
4.5.1. Color de las colonias............................................................ 58
4.5.2. Tipo de micelio ..................................................................... 58
4.5.3. Crecimiento radial diario en PDA ......................................... 59
4.6. Caracterización microscópica ................................................. 59
4.6.1. Conidias ............................................................................... 60
4.6.1.1. Forma y tamaño de las conidias ...................................... 60
4.7. Sensibilidad al Benomyl ......................................................... 61
4.8. Prueba de la proteasa............................................................. 61
ix
4.9. Pruebas de patogenicidad cruzada......................................... 62
5. RESULTADOS Y DISCUSION .................................................................... 64
5.1 Descripción macroscópica ....................................................... 64
5.1.1. Características de la colonia. ............................................... 64
5.2. Curva de Crecimiento a 20,25 y 28ºC..................................... 66
5.2.1. Características de las conidias a 20, 25 y 28ºC ................... 69
5.2.1.Tamaño de las conidias ........................................................ 73
5.3. Prueba de Benomyl................................................................. 76
5.4. Prueba de Proteasa ................................................................ 77
5.5 Pruebas de Patogenicidad cruzada ......................................... 79
6. CONCLUSIONES ........................................................................................ 84
7. RECOMENDACIONES................................................................................ 85
8. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................ 86
9. ANEXOS...................................................................................................... 98
x
TABLA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de la enfermedad de la antracnosis causado por Glomerella
cingulata y Colletotrichum o Gloeosporium sp. .............................................36
Figura 2. Estrategias de infección de Colletotrichum acutatum .....................41
Figura 3. Síntomas de antracnosis ................................................................55
Figura 4. Tipo de micelio predominante en los aislamientos .........................64
Figura 5. Color de las colonias ......................................................................65
Figura 6. Variación en el color de las colonias...............................................66
Figura 7. Curva de crecimiento del hongo Colletotrichum spp en frutos de
granadilla, lulo, mango, tomate de árbol y tallos de mora bajo temperaturas
de 20, 25 y 28ºC ............................................................................................68
Fig 8. Forma de las conidias. ........................................................................70
Figura 9. Efecto de la temperatura sobre la forma de las conidias. ..............72
Figura 10. Efecto de la temperatura sobre el tamaño de las conidias ...........75
Figura 11. Prueba de Benomyl ......................................................................77
Figura 12. Halo producido por la prueba positiva de la proteasa. ..................78
Figura 13. Pruebas de patogenicidad cruzada ..............................................82
Figura 14. Pruebas de patogenicidad cruzada en tallos de mora. .................83
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Tamaño de las conidias. ..................................................................73
xi
LISTA ANEXOS
ANEXO 1. Preparación del agar PDA............................................................98
ANEXO 2. Medio para evaluar la reacción de la proteasa.............................99
ANEXO 3. Características morfológicas de los aislamientos.......................100
ANEXO 4. Análisis estadístico para crecimiento radial...............................101
ANEXO 5. Tasa de crecimiento para los diferentes aislamientos bajo 20, 25 y
28ºC.............................................................................................................103
ANEXO 6. Forma de las conidias ................................................................104
ANEXO 7. Estadística para el largo de las conidias ...................................106
ANEXO 8. Estadística para el ancho de las conidias...................................108
ANEXO 9. Tamaño de las conidias en temperaturas de 20, 25 y 28ºC .......110
ANEXO 10. Prueba de Benomyl para diferenciar entre C. acutatum y
C.gloeosporioides ........................................................................................111
ANEXO 11. Prueba de la proteasa en 5 repeticiones ..................................112
ANEXO 12. Pruebas de potencial de patogenicidad cruzada......................113
ANEXO 13. Presencia de síntomas iniciales de antracnosis en los
tratamientos de patogenicidad cruzada. ......................................................114
12
INTRODUCCIÓN
Con el transcurso de los años las frutas tropicales se han convertido en uno
de los productos con una mayor perspectiva comercial en el ámbito
internacional; es por esta razón que los países productores han
incrementado sus niveles de producción y han enfocado líneas de
investigación al conocimiento y mejoramiento de estos cultivos con el fin de
obtener frutos de excelente calidad.
Colombia participa en el mercado internacional de las frutas tropicales con
productos como: el mango, donde se estima un área de cultivo de 12.000
hectáreas en las cuales se producen alrededor de 119.000 Tn/año, los
departamentos de mayor producción son Tolima y Cundinamarca, seguidos
por Antioquia, Bolívar y Magdalena; el tomate de árbol, cuenta una
producción de 112.000 Tn/año en un área de 7.300 ha, distribuidas
principalmente en los departamentos de Antioquia y Cundinamarca; la
producción de granadilla, esta localizada en los departamentos de Antioquia ,
Valle y el área de cultivo alcanza las 21.000 ha. A su vez, la mora y el lulo,
son alternativas de cultivo de gran importancia económica dentro de la
producción agrícola de muchos departamentos del país. El lulo es producido
principalmente en el Huila, seguido por el departamento de Cundinamarca,
se producen alrededor de 40.000 tn/año en un área de 4.790 ha. La zona de
producción de mora es de 8.000 ha con un volumen de 54.000 Toneladas, el
departamento de Cundinamarca produce más de la tercera parte de esta
fruta seguido por los departamentos de Santander y Antioquia. Debido a que
son productos de gran demanda representan grandes extensiones de tierra
cultivada y teniendo en cuenta la biodiversidad y variedad climática del país
existe la posibilidad de extender y aumentar la producción de estas y otras
13
frutas con el fin de ofrecer en el mercado internacional diversidad de
productos con excelente calidad.
La expansión de este tipo de cultivos favorece la aparición de enfermedades
que deterioran la calidad de los frutos y/o disminuyen los rendimientos de los
cultivos. La antracnosis es una de las enfermedades que se presenta en la
fase productiva de la planta y durante la poscosecha, razón por la cual se
considera una de las más importantes en nuestro país ya que en algunas
zonas la enfermedad ha causado pérdidas en la totalidad de los cultivos
cuando no es controlada; la antracnosis es producida por el hongo
Colletotrichum spp, que afecta los frutos y también puede causar lesiones en
otras partes de la planta.
Debido a la importancia económica de la enfermedad para la producción
frutícola en el país y a la reducida disponibilidad de información acerca de la
biología, patogenicidad y epidemiología del agente causal en Colombia, los
estudios de caracterización microbiológica y morfológica a nivel macro y
microscópico, junto con el conocimiento de los procesos de infección cruzada
en frutos de lulo, mango, granadilla, tomate de árbol y tallos de mora,
pueden ser de utilidad en procura de generar alternativas de solución, como
herramientas para formular estrategias de manejo que permitan reducir la
incidencia, la severidad de enfermedad y a su vez mejoren la productividad
de los cultivos junto con la condición social y económica de los productores.
14
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Aislar, caracterizar microbiológicamente y realizar pruebas de patogenicidad
cruzada entre los aislamientos de Colletotrichum spp. obtenidos de frutos de
lulo (Solanum quitoense Lam), tomate de árbol (Solanum betacea Sendt),
granadilla (Passiflora ligularis Juss), y tallos de mora (Rubus glaucus Benth)
con síntomas de antracnosis.
2.2. Objetivos específicos
Aislar el patógeno causante de la antracnosis en frutos de lulo, mango,
granadilla, tomate de árbol, y tallos de mora a partir de tejido de los
mismos que manifiesten síntomas iniciales de la enfermedad.
Caracterizar microbiológicamente los diferentes aislamientos obtenidos a
partir de los frutos de lulo, mango, granadilla, tomate de árbol y tallos de
mora.
Establecer si existe patogenicidad cruzada entre los diferentes
aislamientos de Colletotrichum spp. obtenidos a partir de los frutos de
lulo, granadilla, mango, tomate de árbol, y tallos de mora.
Conocer las diferencias existentes a nivel macro y microscópico entre los
agentes causales de la antracnosis en mora, lulo, mango, granadilla y
tomate de árbol.
15
3. REVISIÓN DE LITERATURA
3.1. Granadilla (Passiflora ligularis Juss)
Las pasifloras son trepadoras perennes, con zarcillos largos y alternos. La
familia Pasiflorácea es nativa de los trópicos y subtrópicos. A ella pertenecen
enredaderas, árboles y arbustos (Heywood y Moore 1987), muchas son
cultivadas por sus frutos comestibles, mientras que otras son usadas como
plantas ornamentales. La familia comprende 18 géneros y 630 especies
(Vanderplank 1996). El género Passiflora ha sido considerado como el más
amplio e importante de esta familia, ya que incluye aproximadamente 465
especies y está subdividido en 24 subgéneros (Vanderplank 1996). Killip
(1938) subdividió el género Passiflora en 22 subgéneros, a partir de su
morfología floral, y realizó la clasificación taxonómica de más de 350
especies americanas dentro del mismo.
3.1.1. Botánica y descripción de la planta
Su posición taxonómica es:
Reino: Vegetal
División: Angiosperma
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Dilleniidae
Orden: Malpighiales
Familia: Passifloraceae
Género: Passiflora
Especie: P. ligularis
16
La planta es enredadera de ramas largas, hojas acorazonadas, raíz radiada
con nudos cada 12 a 15 cm, con tallos redondos. En cada nudo se
encuentran dos estipulas y dos yemas florales, un zarcillo, una yema
vegetativa y una hoja acorazonada grande. La base del pecíolo de la hoja
esta provista de 4 a 6 glándulas alargadas llamadas lígulas. Las hojas de 8-
14 cm. de largo presentan lámina acorazonada, con el margen liso, es de
color verde a azulado. El pecíolo tiene tres aristas, pedúnculo solitario en las
axilas de 1.5-3.0 cm. de largo, tres brácteas verdosas, tubo del cáliz
brevemente acampanado; sépalos aovado-oblongos de 2.5 a 3.5 cm de largo
y de 1 a 1.5 cm de ancho, agudos. La flor mide de 6 a 8 cm. tiene forma de
campana verdosa exterior y blanca en su interior formada por dos series de 5
sépalos cada una. Los pétalos son tubulares, 1 a 3 cm de largo y 8 a 10 mm
de ancho de color blanco y lila, forman una corola de dos series con 43
pétalos al exterior y al interior. El fruto es una baya grande, ovoide de 6 a 12
cm de diámetro; con cáscara dura, amarilla con lenticelas en forma de
puntos blancos, pulpa gruesa, esponjosa, jugosa, dulce, de color blanco. En
el interior de la fruta las semillas se agrupan en tres placentas longitudinales
situadas en las paredes de la fruta. Las semillas son planas elípticas, negras,
rodeadas de un arilo transparente que es la parte comestible. Este arilo se
compone de un parénquima que contiene azúcares y principios ácidos que
determinan un sabor muy agradable (Avilan et al, 1988). La granadilla es
consumida principalmente como fruta fresca.
3.1.2. Condiciones agroecológicas
Se desarrolla muy bien en un clima cálido y húmedo con temperaturas entre
los 12 y 20ºC, precipitaciones de 1.500 a 2.000 mm, humedad relativa del 70
al 85%, condiciones que se presentan en las zonas comprendidas entre los
1500-1900 m.s.n.m. En relación a suelos, le favorecen aquellos de textura
17
media con buen drenaje, ya que no soporta los encharcamientos, la fertilidad
requerida puede ser de mediana a alta, y el pH de 5.5-7.7 (Avilan et al,
1988).
3.1.3. Plagas
Entre las principales plagas se han reportado el chinche de hoja (Leptoglosus
zonatus) y gusano defoliador (Dione juno juno). En las enfermedades
fungosas se ha reportado a Alternaria spp., que ataca directamente al fruto,
causando manchas circulares necróticas que penetran al fruto causando su
pudrición; Cladosporium herbarum , Fusarium oxysporum y la antracnosis
que es altamente limitante, producida por el hongo Colletotrichum spp, el cual
se caracteriza por atacar hojas, ramas y frutos, produciendo lesiones o
manchas de coloración oscura, las cuales gradualmente se van tornando
negruzcas y aumentan de tamaño hasta destruirlo completamente. La
severidad de la enfermedad se ve favorecido por condiciones climáticas
relacionadas con alta humedad relativa y bajas temperaturas (Ríos & Torres,
1976).
3.2. Lulo (Solanum quitoense Lam)
El lulo no tiene un origen definido y exacto, sin embargo, los autores
coinciden en señalar al Ecuador y al sur de Colombia, como las zonas en
donde probablemente se origino. Es una planta típica del trópico de
fotoperíodo corto, por esto su cultivo se acostumbra en lugares frescos y
sombreados, aunque también puede cultivarse en lugares sin la última
aracterística, en estos casos el clima de la zona debe ser
predominantemente nublado durante todo el año.
18
3.2.1. Botánica y descripción de la planta
Su posición taxonómica:
Reino: Vegetal
Subreino: Espermatophyta.
Division: Angiosperma.
Subdivisión: Dicotiledónea.
Clase: Simpetala.
Subclase: Pentaciclica.
Orden: Tubiflorales.
Género: Solanum
Especie : S. quitoense Lam
La naranjilla se utiliza principalmente por el jugo, que se emplea en la
preparación de refrescos y licores, a los que da un sabor ácido y un aroma
muy agradable. La naranjilla es un arbusto de 1 a 2 m. de alto, los tallos
cilíndricos, duros y muy ramificados, lisos o espinudos, cubiertos como el
resto de la planta de una pubescencia blanca y harinosa. Este indumento
está constituido por dos tipos de pelos; los más frecuentes son blancos y en
forma de estrella. Los segundos aparentemente simples, pues tienen solo
ramificaciones muy cortas en la base, están llenos de un líquido morado que
da un tiente característico a las hojas nuevas. En las hojas desarrolladas
estos pelos morados solo se hallan en los bordes y nervios del lado inferior
de la hoja. Las hojas oblongadas a ovadas, muy grandes, miden de 30 a 40
cm. de largo por 20 a 35 cm. de ancho; tienen el borde marcadamente
sinuoso, con lobos triangulares cortos. Las flores nacen en las axilas
terminales, solas o en grupos de 2 a 6; sus pedúnculos son cortos y
gruesos. El cáliz, que es permanente, es de forma estrellada, muy
pubescente en el lado externo. La corola blanca, mide hasta 4 cm. de
19
diámetro y está dividida en 5 lobos triangulares. El centro de la flor lo ocupan
los estambres y el pistilo; los primeros tienen anteras erectas y amarillas, por
entre las que sobresale el estilo (Mejía & Betancur, 1994).
El fruto de S. quitoense tiene por forma un lejano parecido con la naranja. Es
una baya globosa, de 3 a 5 cm de diámetro, amarilla en la madurez, cubierta
de una pubescencia blancuzca que se remueve fácilmente. La cáscara es
dura y las 4 ó 5 celdas están rellenas de una sustancia mucilaginosa, verde
amarillenta, de típico sabor acido entre la que se hallan numerosas semillas.
El fruto no se come en fresco, sino que se prepara en jugo o en pasta (León,
1968).
3.2.2. Condiciones agroecológicas
El lulo crece mejor en terrenos con pendientes moderadas o fuertes. La
altitud más adecuada para el cultivo se encuentra entre los 1700 a 2200
metros sobre el nivel del mar y a una temperatura que oscila de los 16 a
22°C; si la temperatura supera los 29°C la productividad disminuye, el lulo no
soporta bajas temperaturas, como las que se presentan en zonas donde
ocurren heladas y granizadas. El tipo de suelo preferiblemente debe ser rico
en materia orgánica, de textura liviana, profundos, medianamente ácidos (pH
5-5.8), también se puede cultivar en suelos francos, franco-arenosos o franco
arcillosos con buen drenaje. La precipitación debe encontrarse entre los
1500-2500 mm (Pardo, 1990).
3.2.3. Plagas
Dentro de las plagas que afectan la calidad de los frutos se encuentran
Anastrepha spp cuya larva se desarrolla dentro de los frutos, siendo los más
20
atacados, los frutos "pintones" o en proceso de madurez y sobremaduros.
Esta larva consume el tejido carnoso del fruto causando, con sus
excrementos, acompañada de una descomposición interna lenta y continua;
como consecuencia del ataque los frutos jóvenes se caen, sin embargo los
frutos bien desarrollados permanecen en la planta donde se maduran
prematuramente y se descomponen. Hasta hoy, otra plaga similar, Ceratitis
capitata conocida como mosca del mediterráneo no se ha reportado en
Caldas. Otra de las plagas es Neuleucinodes elegantalis. Dentro de las
enfermedades fungosas se encuentra la antracnosis la cual produce lesiones
tanto en el tallo como en los frutos. La enfermedad es endémica al cultivo en
las zonas productoras de los departamentos de Caldas, Cauca, Antioquia,
Boyacá, Cundinamarca, Huila, Tolima y Valle del Cauca (Tamayo et al.,
2003; López, 1980)
3.3. Mango (Mangífera indica L.)
El mango es un árbol frutal que esta muy diseminado por todo el mundo y su
fruta, según muchos autores se consume en los países de la zona tropical.
Es originario de la India, donde se cultiva hace 4000 años. Colombia posee
grandes extensiones de tierra ecológicamente aptas para su cultivo,
principalmente la Costa Atlántica y regiones más cálidas del interior del país
como los Valles de los departamentos del Tolima, Huila y los Llanos
Orientales.
3.3.1. Botánica y descripción de la planta
Su posición taxonómica:
Reino: Vegetal
Clase: Dicotiledóneas
21
Subclase: Rosidae
Orden: Sapindales
Suborden: Anacardiineae
Familia: Anacardiaceae
Género: Mangifera
Especie: M. indica L
Los árboles de mango llegan a alcanzar un gran porte; se conocen
ejemplares de más de 40 metros de altura. Su forma depende del tipo de
propagación; árboles de semilla son erectos y altos; los injertados más bajos
y de ramificación escasa y abierta. El mango es una de las especies
tropicales que alcanza un mayor desarrollo radical. Las raíces principales
penetran hasta 6 a 8 metros, mientras que las superficiales se extienden en
un radio hasta de 10 m. del tronco. Esta distribución le permite resistir las
condiciones de baja humedad. El tronco principal es cilíndrico o irregular con
la corteza grisácea, rica en canales de resina. En esta especie hay uno o
varios períodos al año de desarrollo de ramillas nuevas, con hojas que al
principio son verdes o rosadas según el cultivar. El primer brote en la
mayoría de las variedades, sale de aquellas ramillas formadas el año anterior
que no florecieron. Estos primeros brotes, si el árbol no tiene frutos crecen y
se alargan y de ellos salen las inflorescencias que se abrirán en la estación
siguiente, por lo común un año después de iniciado su desarrollo. Después
pueden presentarse uno o más períodos de brotación sin que las ramillas
brotadas lleguen a dar flores. Es de estos brotes sin embargo, de donde
saldrán las ramillas floríferas. El factor que determina que una brotación
llegue a formar flores, es la presencia de frutos. Cuando hay cosecha
abundante el árbol agota sus reservas, de modo que en ese año el número
de brotes nuevos se reduce al mínimo. De esto resulta que un año de altas
cosechas es seguido por 1 ó 2 de bajo rendimiento.
22
Los pecíolos hinchados en la base, tienen un canal en lado superior y miden
de 5 a 25 mm. de largo. La lámina es por lo general oblongada o
lanceolada, con la base y el ápice agudos, rara vez elípticos. Su tamaño
varía de 5 a 35 cm. de largo por 2 a 10 cm. de ancho. Los bordes por lo
común son ondulados; el nervio central y los 15 a 30 nervios laterales son
muy prominentes. La cara superior es dura y brillante, de color verde oscuro,
mientras que la inferior es amarillo verdosa. Las hojas del mango contienen
canales de resina que se hallan en el floema de las venas. La inflorescencia
es una panícula que brota al final de una ramilla. Las flores tienen un
pedúnculo muy corto: El cáliz se forma de 5 sépalos libres, verdosos,
pubescentes en la cara externa de 2 a 4 mm. de largo y de 1 a 2 mm. de
ancho. Los pétalos, también libres y caedizos miden de 3 a 6 mm. de largo
por 1 a 2 mm. de ancho y tienen el ápice agudo y curvo.
El fruto es una drupa aplanada, cuya forma, tamaño y color varían mucho
según las variedades. La base en ciertos cultivares tiene un lado comprimido;
el cuerpo del fruto es desigual de perfil, con el lado dorsal convexo y el
ventral con una concavidad hacia el ápice, en la que se halla una
prominencia cónica o “pico”. El tono básico del fruto es amarillo en la fruta
madura, uniforme o con áreas rojas o verdes. El color uniforme es
interrumpido por círculos pequeños más claros llamados glándulas. La pulpa
del fruto es amarilla o naranja y jugosa, con fibrosidades, salvo en las
variedades mejoradas (León, 1968).
3.3.2. Condiciones agroecológicas
En la Costa Atlántica, los suelos cultivados con mango son franco-arcillosos,
arcillosos y arcillosos-limosos, profundos con un pH de 6.0 a 6.5 y fertilidad
que va de mediana a alta. Por otro lado, los suelos del Huila y Tolima,
23
sembrados con esta fruta, son arenosos, tienen un pH que oscila entre 6.5 y
7.2 y su fertilidad es medianamente alta. En la Costa Atlántica cuya altura va
de 0 a 30 m.s.n.m, goza de una temperatura media de 28ºC, una humedad
relativa de 78% y ciclos de lluvia de 1200 y 1400 mm anuales. En el Huila y
en el Valle del Tolima, regiones ubicadas entre los 380 y 600 m.s.n.m. la
temperatura media es de 28ºC y la humedad relativa de 68%; el promedio de
lluvias fluctúa en 1000 y 1300 mm anuales. En los Llanos Orientales, los
suelos aunque arcillosos, funcionan como arenosos por sus excelentes
condiciones físicas que los hacen muy permeables y son además profundos,
con un pH que oscila entre 3.8 y 4.5 y la fertilidad baja. La temperatura
promedio es de 26ºC, con precipitaciones entre 2000 y 2500 mm (Cartagena,
2001).
3.3.3. Plagas
Dentro de las plagas que afectan las plantaciones de mango se encuentra la
mosca de las frutas Anastrepha spp, el falso piojo blanco Aulacaspis
tubercularis, la escama articulada Selenaspidus articulatus. Dentro de las
enfermedades fungosas se encuentra la antracnosis, ocasionada por
C.gloeosporioides; Oidium mangiferae y Diplodia theobromae que ocasiona
secamiento descendente y pudrición del fruto ( Ríos &Torres,1976;
Cartagena, 2001).
3.4. Mora de castilla (Rubus glaucus Benth)
El género Rubus se encuentra distribuido en la mayor parte del mundo. La
mora de castilla tiene como centro de origen las zonas altas tropicales de
América principalmente en Ecuador, Colombia, Panamá, Salvador,
24
Honduras, Guatemala, México e inclusive los Estados Unidos. En Colombia
se cultiva principalmente en la zona andina y las estribaciones de la
Cordillera Occidental, Departamentos de Nariño, Cauca, Huila, Tolima, Valle,
Caldas, Quindío, Risaralda, Antioquia, Cundinamarca, Santanderes y
algunos sectores del Meta, se calcula un área aproximada a las 4.500
hectáreas para 1996, con un rendimiento nacional que oscila entre las 8 y 10
toneladas por hectárea. El nombre de mora de castilla se originó en la época
de la colonia, donde las familias nobles que se daban el lujo de consumir
frutas, entre ellas la mora creían que procedían de Castilla España
(ERAZO,1998). Fue descubierta por Hartw y descrita por Benth, llamada
rubus, en latín rojo y glaucus, que en latín significa blanquecina, debido al
color del envés de sus hojas (ACERO, 1989).
3.4.1. Botánica y descripción de la planta
Su posición taxonómica es
Reino: Vegetal
Clase: Angiospermae
Subclase: Dicotyledónea
Orden: Rosae
Familia: Rosaceae
Genero: Rubus
Especie: R.glaucus
La mora es una planta perenne, de porte arbustivo, semi erecta, tallos
bienales, espinudos, cubiertos de un polvo blancuzco, rastreros o semi
erguidos, forman macollas, lampiños, con aguijones que se extienden hasta
los pecíolos y la nervadura central del envés de las hojas; emite
constantemente brotes básales de longitud variable y que se pueden
25
ramificar. Hojas alternas con tres folíolos oval - lanceolados de 5 a 9 cm. de
largo, dos básales y uno terminal, bordes aserrados, de color verde en el haz
y blanquecino en el envés. Las ramas florecen en racimos terminales que
caducan una vez ocurrida la fructificación, algunas ramas se hacen
procumbentes cayendo al suelo y produciendo enraizamiento de los ápices.
Las flores son hermafroditas y actinomorfas de corola blanca, de 2 a 2.5 cm.
de diámetro, cáliz con cinco sépalos verdes agudos y persistentes, corola
con cinco pétalos blancos, rojos o lila, caedizos, periantio inserto en un
receptáculo o hipantio, con estambres en su base y cárpelos de 1 a 150 y
ovario supero; la flor terminal de la inflorescencia es generalmente de mayor
tamaño, la que se fecunda primero y desarrolla fruto más temprano. Los
frutos esféricos o elipsoidales, miden de 1 a 2.5 cm. de longitud; son de color
rojo oscuro en la madurez, con sabor ácido y aromáticos. Las semillas son
pequeñas y suaves de forma ligeramente cuneiforme, superficie reticulada y
tamaño variable, en general mide 5 milímetros de largo y 2 de ancho; su
germinación es lenta debido a la dureza e impermeabilidad del endocarpo.
Este es posiblemente el mejor de los Rubus de los trópicos americanos; de
esta especie se conocen varios cultivares. El fruto es agregado, constituido
por un conjunto de drupas suculentas (multidrupas) con una semilla en su
interior; pueden ser circulares, cónicos o elípticos, su tamaño puede ser
grande, mediano o pequeño, maduración dispareja debido a la posición en el
racimo, presentan fructificación continua aunque se observan picos de
producción a intervalos de 5 a 6 meses (Zapata, 2003)
3.4.2. Condiciones agroecológicas
El mejor desarrollo de la planta se presenta entre 1.800 y 2.400 metros de
altura sobre el nivel del mar. Después de los 2400 metros los rendimientos
son menores y disminuyen la calidad y tamaño de los frutos. Por debajo de
1800 metros se presenta también disminución severa del rendimiento por
26
problemas de plagas y enfermedades, principalmente. El cultivo posee un
mejor desarrollo con humedades relativas entre 70 y 80%, y Temperaturas
promedio entre los 15 y 19 °C, la humedad es un factor que se encuentra
ligado directamente al ataque por hongos cuando la humedad es superior a
80%. (Zapata, 2003).
Las regiones que tienen precipitaciones (lluvias) entre 1500 y 2500
milímetros son las ideales para el cultivo de la mora, esta precipitación debe
ser bien distribuida. Los periodos de menor lluvia coinciden con las épocas
de producción y los de exceso de lluvia propician al ataque de hongos que
afectan la producción. (Landazuri, 2000).
El suelo ideal para el cultivo de la mora es el de textura franca rico en materia
orgánica, que puede retener humedad, pero que no se encharque. La mora
crece en suelos ácidos (pH ácido), pero se desarrolla mejor en suelos
neutros de pH cercano al valor 7; la planta requiere suelos profundos, y es
exigente en nitrógeno, fósforo, potasio, calcio y magnesio. (Landazuri, 2000).
Una de las enfermedades mas limitantes dentro de este cultivo, es la
antracnosis, enfermedad causada por Colletotrichum sp. En las plantas
afectadas se observan manchas oscuras en ramas y tallos, que en su interior
se tornan de color café claro o café rojizo, Luego se produce el secamiento y
la muerte de la rama. La enfermedad puede atacar botones florales, brotes
tiernos, pedúnculos y frutos que se deshidratan y pudren. La importancia de
esta patogeno, radica en que no importa el grado de desarrollo en que se
encuentre la planta, de igual manera es susceptible al ataque del hongo.
(Cedeño et al, 1992).
27
3.4.3. Plagas
Dentro de la plagas se encuentran áfidos o pulgones Aphis sp , los cuales
chupan gran cantidad de savia y transmiten virus , debilitan las plantas y
propician la deformación de los frutos. La arañita roja Tetranychus sp, que
ataca el follaje y se localizan en el envés de la hoja, Anastrepha sp.,el
barrenador del tallo Epialus sp. Dentro de la enfermedades fungosas se
encuentra la pudrición del fruto causada por Botrytis cinerea; la muerte
descendente causada por C. gloeosporioides Penz y la marchitez por
Verticillium sp. (Tamayo, 2001)
3.5. Tomate de árbol (Solanum betaceum cav Sendt)
El tomate de árbol S. betaceum es una planta de tipo arbustivo originaria de
los bosques andinos de América, propia de clima templado, se encuentra
aun de forma silvestre en los bosques de varios países de Sudamérica, entre
otros: Colombia, Perú, Ecuador y Bolivia. Aunque el origen del tomate de
árbol es aún muy controvertido. Según Kramer y Zoom (1988), el tomate de
árbol era el único producido en las montañas de Java. También se cree que
la planta es originaria de Colombia, pero hay quienes consideran que su
origen es peruano y que se encuentra en forma silvestre en zonas de clima
frío moderado en la cordillera de los Andes y Brasil (Girard & Lobo, 1977).
En Colombia se cultiva en zonas de clima frío moderado principalmente en
los departamentos de Cundinamarca, Valle del Cauca, Caldas, Tolima,
Antioquia, Santander y Huila, en los cuales la producción es considerable
aunque no a gran escala (Federación Nacional de Cafeteros 1998). Hoy en
día esta fruta se produce con éxito en países como Nueva Zelandia,
28
Australia, Estados Unidos y otros países europeos donde es conocida como
"Tamarillo", Colombia se destaca en la producción y comercialización de
semillas y en el desarrollo de tecnologías para el cultivo de la fruta que han
sido introducidas a Europa y Norte América. Igualmente, existen importantes
perspectivas para la comercialización de la fruta con países como Japón y
Brasil (Lebn 1996).
3.5.1. Botánica y descripción de la planta
El tomate de árbol es un arbusto que alcanza una altura de 2 a 3 metros. Su
posición taxonómica es la siguiente:
Reino: Vegetal
División: Angiosperma
Clase: Dicotyledónea
Orden: Tulifloras
Familia: Solanaceae
Genero: Solanum
Especie: S. betacea (Cav) Sendt.
Esta solanácea arbórea tiene un tallo semileñoso, poco ramificado, que crece
simpodialmente por yemas axilares, formando un tronco en zigzag; en la
parte más jóven alcanza buen desarrollo bajo condiciones favorables,
encontrándose plantas hasta de 5 metros de altura. Se propaga por semillas
o estacas de raíz; cuando la reproducción se hace por semilla, las raíces son
profundas y ramificadas, cuando se propaga por estaca, las raíces son
superficiales y bastante ramificadas. Al inicio el tallo es suculento, tomando
luego una consistencia leñosa, que se ramifica naturalmente entre los 8 y 10
meses de edad, a una altura que puede estar entre 1.80 y 2.40 metros,
29
formando ángulo de 90º o más entre el tronco y las ramas; las ramas
continúan ramificándose en forma casi plagiotrópica al suelo (León, 1968).
.
Las primeras hojas son de gran tamaño, de 15 a 30 cm y pueden alcanzar
hasta 60 cm de largo por unos 30 ó 40 cm de ancho, acorazonadas, enteras,
de consistencia cariácea, y verde brillante muy atractivo. Las hojas nuevas
son de color marrón, las cuales van distribuidas en forma de espiral, poseen
un pecíolo redondo y fuerte de 6 a 10 cm de largo que une la lámina con el
tallo; sus hojas son de larga duración, sobre todo cuando la planta no ha
empezado a producir, se ha visto que prevalecen aún después de las
cosechas, según el manejo que se la haya dado al cultivo ( Bernal y Lobo
1988).
Las inflorescencias aparecen como cimas curvas en las axilas de las hojas
superiores. Las flores son de pétalos blancos, tienen pedúnculos cortos y
finos; el cáliz, es verde-morado se forma de una base en forma de campana
y 5 dientes agudos. La corola de 5 pétalos largos y rosados, unidos por la
base, mide 12 a 16 mm. de diámetro. Las anteras y el pistilo, ocupan el
centro de la flor. Las anteras son biloculares y de color amarillo; el ovario es
de color crema, con forma de globo ovoide y con estilo robusto; el estigma
presenta tonalidades amarillas unidas (León, 1968).
Los frutos tienen forma ovalada y alargada, pasando por diferentes
tonalidades desde rosado pálido hasta purpúreo dependiendo de su etapa de
desarrollo; están suspendidos en pedúnculos largos, alcanzan a medir unos
10 cm de largo y 5cm de ancho; su pulpa es de color crema amarilla,
anaranjada o roja oscura, con un olor agradable y bastante jugosa. Las
semillas son pequeñas, semiplanas y de color blanco o crema. La cáscara
lisa y dura, de sabor amargo, se remueve al cocinar la fruta. Los frutos se
comen crudos y se preparan en dulces o conservas. El tomate de árbol tiene
30
cualidades físicas, nutritivas y organolépticas (Alto contenido de proteína y
vitamina A, calcio, fibra y azucares, entre otros) comparables a las mejores
frutas que actualmente se consumen y tienen un gran potencial exportador.
Pese a sus características sobresalientes no se le da la importancia que
merece dentro de la alimentación humana (Feicán et. al. 1999).
3.5.2. Condiciones agroecológicas
Crece en zonas con altitudes que varían de 1600 a 2400 metros sobre el
nivel del mar. Es una planta de climas templados y fríos. Su temperatura esta
entre 13° a 24° C siendo la óptima entre 16° y 19° C, pero puede resistir
temperaturas hasta de 0°C sin sufrir daños graves. No tolera vientos fuertes,
ya que se produce la caída de las flores, rotura de las ramas y destrucción de
las hojas.No necesita gran humedad atmosférica, razón por la cual, se cultiva
frecuentemente en zonas altas de clima seco (Feicán et. al. 1999). La
precipitación oscila entre los 1500-1600 mm anuales bien distribuidos. El
exceso de agua puede causar pudrición radical si los suelos tienen mal
drenaje. La falta de agua afecta el desarrollo y crecimiento del tomate de
árbol e influye sobre la formación del fruto. Este cultivo requiere suelos
sueltos, profundos, con un buen contenido de materia orgánica y bien
drenados. Preferiblemente deben ser suelos francos o franco-arenosos
(Tamayo, 1984; Bernal & Lobo, 1988)
3.5.3. Plagas
Dentro de los principales microorganismos reportados como agentes
causales de enfermedad en el tomate de árbol son: Colletotrichum sp.,
Phytophthora sp., Alternaria sp., Sclerotinia sp., Botrytis sp., Oidium sp.,
31
Pseudomonas solanacearum, Cercospora sp, Phoma sp; además de varias
plagas, virus y nematodos ya reportados. Una de las enfermedades mas
limitantes es la Antracnosis producida por Colletotrichum gloeosporioides y
recientemente se ha encontado C.acutatum, en la cual el hongo, ataca
hojas y frutos. En el follaje se presentan manchas de color oscuro, en los
frutos, se producen lesiones que afectan a la epidermis. Esta enfermedad
toma gran importancia al presentarse cuando las plantas se encuentran en
pleno desarrollo vegetativo, la humedad ambiental alcanza un 95% y la
temperatura es superior a 17 'C. Además cabe mencionar que esta
enfermedad produce perdidas de hasta el 90% (Parra, 1991; Tamayo, 2001)
3.6. Agente causal de la antracnosis
Una de los problemas de precosecha y poscosecha más limitantes en los
cultivos de frutas tropicales como el mango, el lulo, la mora, granadilla,
tomate de árbol es la antracnosis, que de acuerdo con los registros
bibliográficos es ocasionada por el hongo Colletotrichum spp, estado
anamorfo de Glomerella spp, estado telomorfo. El género Colletotrichum fue
establecido por Corda (1831), como un hongo que se caracteriza por
presentar conidias hialinas, curvadas y fusiformes y un acérvulo setoso. El
género Colletotrichum presenta un número diverso de especies que incluyen
los patógenos y los saprofitos. Las especies de este género son
consideradas como las más exitosas dentro de los hongos patógenos de
plantas y se presentan tanto en zonas templadas como tropicales. Este
patógeno puede afectar gran parte de los tejidos, órganos de la planta en
desarrollo, y frutos. Su capacidad para causar infecciones latentes o
quiescentes lo ubican dentro de los patógenos de poscosecha más
importantes (Jeffries et al.,1990).
32
3.6.1. Posición taxonómica
3.6.1.1. Estado anamorfo
REINO Fungi
SUBDIVISION Deuteromycotina
CLASE Deuteromycetes
ORDEN Melanconiales
GENERO Colletotrichum
3.6.1.2. Estado telomorfo
REINO Fungi
SUBDIVISION Acomycotina
CLASE Pyrenomycetos
ORDEN Sphaeriales
GENERO Glomerella
3.6.2. Generalidades del patógeno
Colletotrichum presenta un micelio enramado inmerso, septado que toma
coloración hialina hasta castaño pálido. Acérvulos, separados o confluentes
en forma de disco o de cojín, ceroso, subepidermal, epidermal y subcuticular
típicamente con setas o espinas negras en los bordes o entre los
conidióforos, formado de pseudoparénquima con paredes delgadas o
gruesas; conidióforos simples, elongados; conidias hialinas, ovoides u
oblongadas (Barnett 1960, Holliday 1995).
33
Las setas presentes o ausentes, originadas irregularmente desde el
pseudoparénquima, más o menos fuertes, no ramificadas, con un ápice
agudo u obtuso, suaves y con una pared gruesa septada en algunos casos.
Los conidióforos septados, ramificados sobre la base de color castaño claro o
hialina, formados de la parte superior de las células del pseudoparénquima
son simples, cortos, erectos. Las conidias también son hialinas, aseptadas
de forma cilíndrica, fusiforme, de una sola célula, que durante la germinación
se torna de color castaño pálido, se septan y forman el apresorio. A menudo
las esporas son tan numerosas que pueden formar masas brillantes de color
rosado (Blanchard, 1992; Holliday 1995).
Las formas de Colletotrichum tiene diferentes modelos de comportamiento en
la naturaleza, variando de saprofito a cepas parasíticas especializadas con
un estrecho rango de hospederos. Los conidios son producidos en masas
mucilaginosas, a menudo rosadas, bastante conspicuas y típicamente
hundidas, con un contorno irregular en las lesiones necróticas (denominada
antracnosis) sobre frutos, hojas y tejidos.
Algunas lesiones sobre frutos en desarrollo llegan a presentarse en relieve;
como chancros, costras, cicatrices, o con forma de verruga en apariencia.
Algunas especies causan infecciones latentes sobre los frutos, que se
desarrollan en lesiones de antracnosis durante la fase de maduración. Dichas
lesiones, estudiadas en C. musae; surgen de una penetración directa de la
cutícula desde el apresorio característico del género. Pero algunas lesiones
surgen sin la presencia de un estado latente, cuando la infección toma lugar
a través de una herida en el tejido del hospedero. La muerte descendente de
las ramas es frecuentemente causada, pero una infección en la raíz es
menos común. Las especies, generalmente sobreviven por largos periodos
de tiempo sobre los desechos vegetales o sobre o dentro del suelo. El
patógeno más común en los trópicos es Colletotrichum gloeosporioides (=G.
34
cingulata) especie en la cual se han descrito algunas diferencias junto con
otras especies de Colletotrichum (Holliday 1995).
3.6.2.1. Desarrollo de la enfermedad
3.6.2.1.1 Germinación y formación del apresorio.
El proceso de infección de Colletotrichum spp involucra una secuencia
común de eventos (Dodd et al, 1989). En la mayoría de los casos el inoculo
llega a los hospederos por medio del agua o dispersión de los conidios los
cuales se adhieren a la cutícula de la planta, germinan en un periodo entre
las siguientes 12-24 h; se produce el tubo germinal, el cual crece usualmente
una distancia corta (10-20 µm), antes de formar el apresorio terminal, que
penetra la cutícula directamente. Las dos fuentes de inoculo son los conidios
producidos en acérvulos, y las ascosporas, producidos y liberados de los
peritecios. Las especies de Colletotrichum utilizan dos fuentes principales
de infección: colonización intracelular o la colonización intramural
subcuticular (Figura 1).
Después de la deposición en la superficie de las plantas, las conidias y las
ascosporas germinaran experimentando una diferenciación compleja que
requiere de síntesis de proteínas para formar apresorios, los cuales son
esenciales para la infección. Durante la germinación una septa es producida
por la mayoría de las especies de Colletotrichum. Los apresorios a menudo
son sésiles, pero pueden formar diferentes tubos germinativos y algunas
veces son producidos en la punta del micelio ramificado. Los apresorios
pueden formarse rápidamente en ausencia del hospedero, por ejemplo
cuando la conidia germina en una superficie dura como una lámina de vidrio
o una membrana de nitrocelulosa (Bailey 1992).
35
La formación del apresorio es un prerrequisito para la penetración directa de
la superficie del hospedero; el apresorio juega un papel importante para que
el patógeno pueda sobrevivir. La germinación de las conidias, formación del
apresorio, y la formación de hifas infectivas son tres procesos
independientes que interactúan como estimuladores o inhibidores presentes
en exudados vegetales. Los apresorios pueden ser globosos, subglobosos
con o sin lóbulos, y pueden diferir en el tamaño, como por ejemplo, el
apresorio globoso de C. lindemithianum tiene un diámetro de 5 a 7 µm,
mientras el de C. graminicola tiene de 10 a 12 µm; los apresorios de C.
gloeosporioides miden entre 6-20 µm x 4-12 µm y los apresorios de C.
acutatum miden entre 8.5-10 µm x 4.5-6 µm; pero tienen muchas
características en común, como las paredes, las cuales tienen dos o tres
capas compuestas de distintos carbohidratos y melanina. La melanina
requiere síntesis de proteínas y es la encargada de darle al apresorio su
típica apariencia oscura; esta puede proteger al apresorio de la irradiación,
pero especialmente está involucrada en los procesos de penetración (Bailey
1992).
A diferencia de la poca información que existe sobre la adhesión de las
conidias a la superficie de las plantas se ha demostrado la adhesión de los
apresorios a las plantas y otras superficies. La adhesión de los apresorios, no
solo garantiza que el patógeno permanezca en contacto con el hospedero el
tiempo que sea necesario para que ocurra la penetración enzimática o
mecánica. La formación del apresorio está acompañada por la secreción de
material mucilaginosos a su alrededor, que junto con la matriz de esporas
están comprometidos en la protección del apresorio, especialmente durante
la adhesión a la superficie de la planta (Bailey 1992).
36
Figura 1. Ciclo de la enfermedad de la antracnosis causado por Glomerella cingulata y Colletotrichum o Gloeosporium sp. Tomado de Agrios 2002.
3.6.2.1.2. Formas de penetración
Dentro de las formas de penetración de las especies de Colletotrichum a la
superficie de las plantas tenemos: a través de aberturas naturales como los
estomas, lenticelas; a través de heridas y penetración directa de la barrera
cuticular, siendo esta la forma más común. La infección a través de heridas
no es común, debido a que las heridas no facilitan la infección. La mayoría de
las enfermedades de las frutas tropicales se presentan después de un
periodo de latencia. Después de una penetración exitosa de las especies de
Colletotrichum sobre la superficie de los frutos, el crecimiento del hongo se
restringe en la capa epidérmica. Solo después de la maduración de los
frutos, los cuales producen tejidos que promueven la reactivación del
patógeno el microorganismo es capaz de producir la enfermedad.
37
3.6.2.1.3. Infección y colonización de tejidos vegetales
Cuando las lesiones de Colletotrichum son examinadas con microscopia
electrónica, las hifas se encuentran a través de los tejidos, donde las células
están muertas y a menudo descoloridas, presentándose la degradación de la
pared celular del hospedero. Las hifas pueden presentarse por dentro de las
células, dentro de la pared celular y en espacios intercelulares, la gran
cantidad de patógeno y de tejido destruido es evidencia de la gran eficacia
de este microorganismo. Pese a su naturaleza destructiva, su éxito como
patógeno es casi exclusivamente determinado por las formas en las cuales
inicia la infección y coloniza los tejidos vegetales. Muchas especies de
Colletotrichum presentan un proceso infectivo de dos fases; involucrando una
fase asintomática inicial, durante la cual el patógeno se establece en los
tejidos del hospedero, seguido por una fase destructiva visible. Durante la
fase asintomática, algunos de estos patógenos invaden las células sin
matarlas, es sobre esta base que muchas especies de Colletotrichum han
sido consideradas como hemibiotróficas. Este hongo es conocido como un
“patógeno intracelular hemibiotrófico”, donde se hace énfasis no solo en su
naturaleza biotrófica sino en su capacidad para penetrar la pared celular y
crecer dentro de la lumena. Para otras especies de Colletotrichum la
penetración de la cutícula es seguida por un crecimiento bajo la cutícula,
donde, a diferencia de otros patógenos subcuticulares, como Venturia
inaequalis, disuelve extensamente la matriz pectica de la pared de las células
epidermales (Bailey 1992). Algunas especies como C. acutatum como se
puede observar en la figura 2 pueden presentar varias estrategias de
infección como el crecimiento biotrófico; el desarrollo necrotrófico intramural y
subcuticular y un desarrollo intra e intercelular y hemibiotrófico subcuticular
(Adaskaveg et al., 2005).
38
3.6.2.1.3.1. Patógenos hemibiotróficos
El inicio de la fase biotrófica en especies hemibiotróficas de Colletotrichum
es seguida de una fase necrotrófica, la cual inicia con la aparición de una hifa
secundaria. Esta hifa se ramifica a través del tejido hospedero de forma inter
e intracelularmente. En este estado algunas especies como C.
lindemuthianum, las células hospederas son muertas rápidamente en el
avance de la infección y las paredes celulares son degradadas por enzimas
fúngicas despolimerizadoras. Durante la fase biotrófica de interacción, se
diferencia entre la producción de un micelio inicial “primario” y la transición a
un “micelio secundario”, las hifas de penetración aumentan, se hinchan para
formar vesículas de infección; la membrana plasmática vegetal se invagina
alrededor de la vesícula infectiva. Los protoplastos permanecen vivos
durante el estado biotrófico de interacción. Las hifas primarias colonizan
progresivamente nuevas células epidermales y mesófilas, llegando a
constreñirlas con su paso a través de las células. La matriz interfacial que
separa la membrana plasmática de la planta de la pared celular fúngica se
mantiene y nuevamente infecta las células que permanecen viables por algún
tiempo (Adaskaveg et al., 2005; Whatton et al.,2004 ).
Aproximadamente 48 horas después de la penetración inicial, la hifa
necrotrófica se forma, dicha hifa no esta rodeada por una capa matricial. En
células que contienen hifas primarias y secundarias la membrana plasmática
y la matriz alrededor de la hifa primaria se desintegran. La hifa secundaria
secreta enzimas que degradan la pared celular en su avance, se dispersan y
se expanden rápidamente generando lesiones necróticas. Los procesos
hemibiotróficos son estrategias empleadas por muchas especies de
Colletotrichum, por ejemplo se ha reportado infección vesicular dentro de
tejidos de pepino infectados con C. lagenarium, y se ha hecho énfasis en la
39
invaginación de la membrana plasmática de células de mandarina alrededor
de la hifa de infección de C. gloeosporioides (Mendgen, K. & Hahn, M. 2002).
3.6.2.1.3.2. Patógenos subcuticulares intramurales
Durante el estado inicial de la infección, otras especies de Colletotrichum
crecen exclusivamente bajo la cutícula y dentro de la pared periclinal de las
células epidérmicas, como es el caso de C. circinas en cebolla y C. capsici
en algodón. En este tipo de infección, después de la germinación de las
esporas se forma el apresorio melanizado, desde el cual se desarrolla la hifa
de penetración. La cutícula del hospedero es penetrada y las hifas del hongo
se diseminan subcuticularmente dentro de las paredes de las células
epidérmicas del hospedero, causando la disolución de la estructura de la
pared, seguido por la muerte celular. Durante los últimos estados de
infección, las hifas penetran células epidérmicas y mesófilas causando la
posteriormente la muerte a las células hospederas (Whatton et al.,2004)..
Durante las primeras 24 horas después de la penetración no hay evidencia
visible de la infección, algo que, como en el estado inicial de la infección
hemibiotrófica ocurre con ausencia de síntomas. Después del crecimiento
hifal dentro de la pared anticlinal de la capa de las células epidérmicas y
dentro de las paredes de las células corticales, se produce una red
intramural a través del tejido de hifas, en los dos días siguientes. Algunas
especies de Colletotrichum pueden emplear los dos tipos de estrategias
infectivas, como por ejemplo la infección producida por C. gloeosporioides en
Stylosanthes spp (Whatton et al.,2004; Mendgen et al., 2002).
Hay pocos estudios sobre la colonización de tejidos hospederos por C.
acutatum. Estos estudios indican que la estrategia de infección adoptada por
40
C. acutatum depende del hospedero a ser colonizado. Sobre los estolones y
hojas de fresa, C. acutatum actúa como subcuticular, intramural necrótrofo
sin un estado biótrofo detectable, mientras en arándano y almendro, el hongo
adopta ambas formas de infección. Este hongo puede cambiar la forma de
infección cuando coloniza diferentes tejidos hospederos sobre cultivos. Por
ejemplo, se observa un comportamiento diferente cuando infecta pétalos y
tejidos de las hojas. En arándano, C. acutatum presenta una forma
infecciosa como un hemibiótrofo intracelular cuando infecta frutos maduros
de cultivos susceptibles. Sin embargo, cuando infecta frutos de cultivos
resistentes de arándano, conocidos como “Elliott” se observa que actúa
como subcuticular, necrotrófico intramural. Además, en cultivos susceptibles,
el modo de colonización hemibiotrófico del tejido del fruto conduce a la
formación de un acérvulo pulvinado por 108 horas posteriores a la
inoculación. En cultivos resistentes de la variedad “Elliott” presenta un modo
de crecimiento subcuticular, intramural necrotrófico, el acérvulo no se
presenta hasta 192 horas despues de la inoculación y entonces aparece muy
pequeño y no contiene muchas conidias (Whatton et al.,2004).
3.6.2.1.3.3. Desarrollo y reproducción necrotrófica
Cuando los tejidos de la planta son colonizados exitosamente por
Colletotrichum, por medio de infección hemibiotrófica y/o intramural, el
patógeno crece activando una comportamiento necrotrófico clásico. La fase
necrotrófica es responsable de los síntomas de la antracnosis y añublos que
son enfermedades típicas causadas por especies de Colletotrichum. Durante
este estado el patógeno crece extensamente a través del tejido hospedero,
dentro de las células, en las paredes, a través de las paredes y en espacios
intercelulares (Mendgen et al., 2002).
41
Pese a la dispersión y la destrucción de los tejidos, otro aspecto importante y
raramente conocido de la fase de crecimiento necrotrófica es que las
cutículas de los frutos afectados permanece intacta, sugiriendo que las
cutinasas están involucradas en la penetración inicial de la superficie de la
planta, entonces la subsecuente síntesis y/o actividad de estas enzimas debe
ser inhibido. Una cutícula intacta puede tener varias funciones. Esta puede
actuar para mantener el patógeno dentro del tejido infectado, pero es de
mayor importancia, el papel aún no definido en la reproducción de
Colletotrichum. La producción tanto del acérvulo como del peritecio sobre la
superficie de la planta requiere una cutícula intacta (Mendgen et al., 2002).
Figura 2. Estrategias de infección de Colletotrichum acutatum. A, crecimiento biotrófico. B, desarrollo necrotrófico intramural, subcuticular. C, Interacción hemibiotrófica D, Desarrollo intra e intercelular y hemibiotrófico subcuticular. Cn = conidia; Gt = tubo germinal; Ap = appresorio; Iv = vesícula infección; Ph = hifa primaria; Sh = hifa secundaria; Sc = conidia secundaria. Las células muertas se representan con líneas diagonales. Ilustraciones de J. E. Adaskaveg, 2005.
3.6.2.2. Fuentes de inóculo y dispersión
Las mayores fuentes de inóculo son las conidias en acérvulos y las
ascosporas liberadas del peritecio, que cuando jóvenes, se encuentran
dentro de un material húmedo mucilaginoso conocido matriz de esporas, la
cual es una mezcla compleja, que comprende principalmente polisacáridos y
42
glucoproteínas con varios componentes menores que incluyen varias
enzimas (Bailey 1992). La matriz cumple funciones importantes, algunos
estudios han mostrado que pueden inhibir la germinación de esporas, para
asegurar la distribución del inoculo (Louis y Cooke 1985). Hay evidencia que
la matriz mantiene la viabilidad de las esporas bajo condiciones de baja
humedad dentro de los acérvulos secos o dentro de la masa de esporas
seca, además protege las esporas de temperaturas extremas, la luz
ultravioleta y de los metabolitos tóxicos de las plantas. Esto es de particular
significancia ecológica en clima tropical donde las conidias son distribuidas
sobre la superficie de los frutos tropicales en el campo y están expuestos a
fluctuaciones diurnas marcadas de humedad relativa. (Nicholson y Morales,
1980). (Bailey 1992).
Las conidias producidas en acérvulos se dispersan por el salpique de las
lluvias, lo cual indica que hay separación y transporte del patógeno por el
impacto de las gotas, siendo estos dos aspectos esenciales para los
procesos físicos en el ciclo de la enfermedad; por lo tanto la lluvia y la
intensidad de ella, juegan un papel importante en la dispersión de esporas y
posiblemente tenga el mismo efecto en todas las especies de Colletotrichum
(Bailey 1992). Además de este factor de dispersión, también pueden hacerlo
los insectos de los órdenes Díptera, Coleóptera y Homóptera ya que
transportan las esporas adheridas a su cuerpo a partir de los frutos que se
encuentran en el árbol o el suelo. Una vez transportadas las conidias, el éxito
de la patogénesis depende de la unión del propágalo, a la superficie de la
planta.
43
3.6.2.3. Infección quiescente y latente
La infección quiescente en el contexto de enfermedades poscosecha
involucra la inhibición del desarrollo del patógeno a través de condiciones
fisiológicas impuestas por el hospedero hasta que se lleva a cabo el estado
de maduración. Una vez el hongo penetra la capa exterior de la fruta, este
permanece allí en estado de dormancia o “quiescencia” hasta que ocurren
cambios en la superficie del fruto los cuales proporcionan las condiciones
adecuadas para la permitir una infección. Los cambios bioquímicos que se
presentan durante la maduración del fruto, se piensa que son los que
permiten el curso de la infección. En aguacate, los cambios en los
compuestos antifúngicos llamados “dienes”, son importantes en la regulación
de la quiescencia en la antracnosis (Prusky, 1996). En frutas inmaduras los
niveles de dienes disminuyen, permitiendo que el hongo reactive su
crecimiento. Según Swimburne (1983), un organismo se puede tornar
quiescente en cualquiera de las siguientes etapas de su vida: en
germinación, elongación del tubo germinativo, formación del apresorio,
penetración y colonización. Las esporas de Colletotrichum germinan al
producir un melanizado, con una gruesa pared resistente del apresorio el
cual es firmemente anclado al hospedero. Un punto de infección se
desarrolla al penetrar la cutícula del huésped y la pared celular con la
asistencia de enzimas cutinasas y celulolíticas. La fase inicial de la
colonización del huésped es biotrófica y sólo después de un largo tiempo la
típica lesión de antracnosis se desarrolla. Esta fase latente puede ser tan
corta y presentarse en pocos días como ocurre en la mayoría de
enfermedades de floración, dos o tres semanas, o varios meses después,
cuando la infección quiescente ocurre en la fruta (Bailey, 1992).
Swimburne (1983), menciona que las siguientes condiciones pueden
promover la quiescencia: Condiciones fisiológicas y físicas adversas
44
impuestas temporalmente por hospedante sobre el patógeno, modificación
de la capacidad patogénica del organismo y resistencia temporal del
hospedante. Además este tipo de infecciones ocurren en floración, o
permanecer en frutos inmaduros hasta su maduración y activarse en los
períodos de poscosecha; sin embargo, existen otras circunstancias que
pueden activar estas infecciones, como condiciones inapropiadas de
almacenamiento de los frutos, daños físicos, mecánicos o plagas, estrés o
cambios bruscos de las condiciones climáticas en el campo; cambios
fisiológicos en la maduración de la fruta y deficiente nutrición. Las infecciones
quiescentes son comunes en una amplia variedad de frutas, vegetales y
cosechas de flores; son causadas tanto por bacterias como hongos.
C. gloeosporioides ha sido asociado con infecciones quiescentes y
enfermedades en poscosecha sobre frutos tales como el aguacate, mango,
papaya, maracuyá, guayaba, granadilla, cítricos, manzana, uva. C. acutatum
ha sido reportado sobre hospederos de frutas cultivadas en zonas templadas
y subtropicales incluyendo manzana, uva, melocotón, almendra, kivi. Bajo
condiciones tropicales, C. acutatum se ha reportado causando pérdidas en
poscosecha en guayaba. Se han reportado numerosos casos de reportes
sobre varias especies de Colletotrichum asociadas a un solo hospedero; por
ejemplo, la fresa puede ser infectada por C. acutatum, C. fragariae y C.
gloeosporioides. Los cítricos pueden ser afectados por C. gloeosporioides y
C. acutatum causando tres enfermedades diferentes. En los últimos años
muchos documentos han descrito diferencias entre C. gloeosporioides y C.
acutatum y su infección sobre frutas de zonas templadas (Peres, 2002)
Los costos económicos de las infecciones quiescentes causadas por
Colletotrichum son proporcionalmente mayores que las perdidas en campo,
debido a los costos generados durante la cosecha, transporte,
almacenamiento y empaque. Desafortunadamente las infecciones
45
quiescentes no son visibles o predecibles en el momento de la cosecha y el
periodo de quiescencia puede ser prolongado así como ocurre en la
antracnosis en banano (Musa spp).
Las infecciones latentes de las plantas por patógenos han sido reconocidas
por muchos años y a menudo son consideradas uno de los más grandes
niveles de parasitismo, aunque el hospedero y el parásito coexisten con un
daño mínimo hacia el hospedero. Verhoeff (1974) afirma que una infección
latente verdadera debe involucrar una relación parasítica que eventualmente
induce síntomas. Agrios define la infección latente como el estado en el cual
un hospedero es infectado con un patógeno pero no muestra los síntomas.
Las infecciones latentes persisten hasta que los síntomas son inducidos a
aparecer por condiciones ambientales y nutricionales o por el estado de
madurez del hospedero o el patógeno. Las infecciones latentes pueden ser
consideradas como un tipo de tolerancia o resistencia a ciertos patógenos,
donde el parásito encuentra el ambiente interno inadecuado para su
crecimiento y multiplicación. La compresión de las infecciones latentes
contribuyen al desarrollo de medidas efectivas de control, así como la
comprensión de la penetración, colonización, expresión de la enfermedad y
pérdidas en campo (Sinclair, 1991).
Colletotrichum spp., agente causal de la antracnosis, tiene un periodo de
latencia en muchos hospederos. Muchos de los síntomas se desarrollan
después de prolongados períodos de tiempo de alta humedad, así como en
plantas senescentes o aquellas que llegan a estresarse. Esta fase latente
puede ser corta, de unos pocos días como en la mayoría de las
florescencias, o varios meses como ocurre en las infecciones quiescentes de
las frutas. El daño del tejido por procesos fisiológicos o mecánicos
invariablemente resulta en la activación de infecciones quiescentes para
roducir infecciones necróticas (Waller, 1992).
46
3.6.2.4. Síntomas y rango de hospederos
Las enfermedades causadas por Colletotrichum spp se presentan en un
amplio rango de plantas hospederas distribuidas a nivel mundial
registrándose tanto en precosecha como en poscosecha. Los problemas
causados en poscosecha son particularmente prevalentes en los trópicos
donde a menudo son un factor limitante en la calidad de exportación
ocasionando serias pérdidas en los cultivos de frutas. La mayoría de las
enfermedades de poscosecha exhiben el fenómeno de quiescencia siendo
las especies de Colletotrichum o Glomerella, patógenos que presentan dicho
tipo de infección.
En plantas de P. ligularis, la antracnosis se presenta en ramas, pecíolos de
las hojas, en los frutos antes de la cosecha y posteriormente es limitante en
poscosecha. Si la infección en el pecíolo es severa, las hojas pueden
desprenderse y producirse una defoliación de la planta. Las infecciones
ocurren en el envés de las hojas a lo largo de las venas, produciendo una
coloración oscura, color ladrillo o púrpura, la cual se torna pardo oscura o
casi negra. En los frutos se forman manchas circulares en la cáscara, de
color pardo oscura y algo hendidas. Si el ataque es temprano, durante el
desarrollo del fruto, éste cae prematuramente o se queda pequeño y
totalmente deformado. Cuando existe alta humedad en el ambiente, el hongo
produce abundantes esporas, las cuales son diseminadas por el viento.
Estas esporas son depositadas en las ramas y frutos donde germinan y
producen áreas necróticas (ICA, 1996)
En plantas de mora de castilla R. glaucus, la enfermedad se presenta como
manchas oscuras en ramas y tallos; en el interior de estos tejidos, se
observa una coloración café claro a café rojizo, posteriormente, las ramas se
secan y mueren. Esta enfermedad también puede atacar botones florales,
47
brotes tiernos, pedúnculos y frutos los cuales se deshidratan y pudren.
Cuando este cultivo se siembra en zonas de alta humedad, la enfermedad
ataca la base de los tallos, a diferencia de otras especies de frutales el
patógeno no es frecuente en estructuras florales y reproductivas. Con el
progreso de la enfermedad las manchas se agrandan, el centro toma una
coloración grisácea con bordes oscuros; luego aparecen las estructuras
reproductivas del patógeno, constituidas por acérvulos y masas de conidias
de color salmón. Uno de los síntomas más frecuentes se presenta en las
ramas o tallos cortados o heridos durante las labores de cultivos, sitios por
donde el microorganismo puede penetrar, ocasionando lesiones de color
oscuro y bordes definidos que van colonizando en forma rápida todo el
tejido, causando en el primer caso muerte descendente de la rama y en el
segundo, muerte desde la base del tallo hacia las ramas superiores. Con
alguna frecuencia la enfermedad también se manifiesta en las yemas
produciendo a su alrededor manchas oscuras con bordes bien definidos, en
algunos casos el patógeno puede avanzar en forma ascendente y necrosar
la rama recién formada. Los frutos producidos sobre las ramas y pecíolos no
maduran en forma uniforme. Los tejidos de mayor lignificación son los más
susceptibles para el desarrollo de la enfermedad, esta enfermedad puede
afectar entre el 50 y 70% de los tallos de las plantas cultivadas (FORERO de
La Rotta, 2001).
En tomate de árbol S. betacea el hongo afecta las hojas, ramas y
especialmente los frutos en cualquier estado de desarrollo y ocasiona
pérdidas que oscilan entre el 10 al 25% de los frutos cosechados. En los
frutos los síntomas iniciales aparecen 6 días después de la inoculación, como
pequeñas lesiones aceitosas que gradualmente se vuelven negras,
aumentando de tamaño y cubriendo total o parcialmente el fruto; las lesiones
tienen bordes definidos y el centro deprimido, que se cubre de una masa de
color rosa-salmón correspondiente a las estructuras fructíferas del hongo,
48
cuando las condiciones climáticas son favorables. Posteriormente los frutos
se secan y se momifican cayendo al suelo o permaneciendo adheridos a la
rama (Tamayo, 2001).
En mango M. indica , las lesiones primero aparecen en las panículas florales
como pequeñas manchas de color café o negras, las cuales se agrandan , se
unen y pueden causar ennegrecimiento total de la inflorescencia y
marchitamiento antes que el fruto inicie su formación. Posteriormente las
infecciones producen lesiones hundidas en frutos jóvenes, los cuales por lo
general se caen. Cuando la infección ocurre en frutos grandes (4-5cm),
usualmente la lesión no se desarrolla, pero el microorganismo permanece en
estado de quiescencia hasta que los frutos maduran y aparecen lesiones
hundidas de color oscuro. En todos los casos el desarrollo de la lesión está
acompañado de masas rosadas como consecuencia de la maduración del
acérvulo. La infección en la flor o la fruta pueden dar lugar a una baja
producción, la fase mas perjudicial de la enfermedad se inicia como una
infección quiescente. El crecimiento del patógeno se retoma después de la
cosecha cuando la fruta inicia su proceso de maduración y se desarrolla la
antracnosis. El efecto del hongo en el rendimiento radica en el hecho de
afectar frutos en todos los estados de desarrollo, los cuales se desechan
para la comercialización al momento de la cosecha y selección para el
empaque (Cartagena & Vega, 2001)
En cultivos de lulo, la antracnosis se manifiesta en los frutos como lesiones
redondas de apariencia café, que en condiciones de alta humedad relativa se
tornan negruzcas. La lesión es hundida en el centro y aumenta de tamaño en
forma rápida, formando anillos concéntricos que cubren el fruto hasta
deformarlo, momificarlo y producir su caída. Aunque las manchas en los
frutos debida a la antracnosis, se presenta sobre la epidermis, es frecuente
que la enfermedad se extienda a la pulpa del fruto y le proporcione un sabor
49
desagradable o amargo. Algunas cepas del hongo ocasionan una pudrición
blanda que propicia la caída de los frutos. Así mismo es frecuente que otros
hongos invadan al fruto a través de lesiones de antracnosis y aceleren la
velocidad de descomposición. Los frutos demasiado maduros son
particularmente susceptibles a la infección. Las pérdidas por esta
enfermedad alcanzan un 40% de la producción (Tamayo, 2001).
3.6.2.5. Consideraciones epidemiológicas
La epidemiología de la enfermedad causada por antracnosis ha sido
estudiada en varios estados de desarrollo del cultivo. En mango, la
enfermedad es particularmente severa sobre las hojas jóvenes y si se
presentan climas húmedos durante la floración, la enfermedad sobre los
frutos se puede prevenir. La infección ocurre durante el desarrollo de los
frutos especialmente en periodos de cosecha pero usualmente permanece
en estado de quiescencia hasta la maduración de la fruta. En plantaciones de
mango el desarrollo del microorganismo se ve favorecido sobre un amplio
rango de condiciones ambientales (10-30ºC, >95% humedad relativa)
ocasionando lesiones sobre las hojas, ramas terminales defoliadas,
inflorescencias momificadas, y en la flor donde probablemente se disemina
con el transcurso de los años (Bailey, 1992)
Cuando el patógeno se encuentra fuera del hospedero, el desarrollo de las
enfermedades se ve restringido por el requerimiento de agua durante todas
las fases del ciclo de la enfermedad. La esporulación no solo requiere altas
humedades sino que la liberación y dispersión de las esporas es dependiente
del agua libre (usualmente la lluvia) y se requiere por lo menos unas cuatro
horas más de humedad a las temperaturas óptimas de 20-25ºC para la
germinación e infección de las mismas. La dependencia de la disponibilidad
de agua durante todas las fases del ciclo de la enfermedad por fuera del
50
hospedero, permite que se identifiquen unos patrones temporales y
espaciales para su desarrollo. Sin embargo, la ubicuidad de las fuentes de
inóculo tiende a sobrepasar cualquier restricción en el desarrollo de la
enfermedad que la dispersión de esporas por agua puede imponer.
El período latente característico de las enfermedades ocasionadas por
Colletotrichum en las fases activas de los tejidos susceptibles, permite un
ciclo epidémico rápido, de tal forma que los niveles de enfermedad crecen
aceleradamente durante los breves períodos cuando las fases susceptibles
del cultivo coinciden con las condiciones de humedad. La variabilidad de
latencia del patógeno representa una adaptación muy importante a las
condiciones de la fisiología del tejido y de los patrones climáticos que ocurren
durante el ciclo de cultivos perennes. Asimismo, esta variabilidad, se
convierte en un impedimento hacia la aplicación de medidas de control
exitosas, las cuales deben tener en cuenta epidemias cortas y severas en
flores y la separación temporal o larga, entre la infección y el desarrollo de la
enfermedad en el fruto (Waller, 1992).
Álvarez (1996); Páez y Zuluaga (1998), muestran una marcada correlación
de la enfermedad con la precipitación a través de todo el año, demostrando
que el hongo es dependiente la precipitación tanto para su germinación como
para su dispersión y desarrollo de la epidemia. Los estudios sobre la
infección y epidemia de la enfermedad, realizados por Rondón (1998)
determinaron con claridad que las hojas, los pedúnculos, las ramas jóvenes,
los racimos, botones, flores, sépalos de la flor y los frutos en cualquier
estado, son tejidos potencialmente susceptibles al hongo; razón por la que
las alternativas de manejo, deben concebir alternativas integrales en el
manejo del inoculo.
51
En cuanto a la dinámica del inoculo, el agua principalmente y en segundo
lugar, los insectos de los ordenes Díptera, Coleóptero y Homóptera juegan
un papel básico para la epidemia; la primera como diseminador de esporas
por salpique y lavado de espora, y los insectos en el transporte de esporas a
partir especialmente de frutos esporulados, ya sea en el árbol o en el suelo.
Estos componentes del patosistema en su conjunto deberán ser objeto de
mayor interpretación y análisis, buscando a su vez optimizar las estrategias
para su manejo y control, pues inocules sin un medio de transmisión tampoco
constituyen epidemias (Rondón, 1998).
3.6.2.6. Métodos diagnósticos
Aunque los métodos tradicionales no nos permiten diferenciar entre las
especies y subespecies de Colletotrichum, las herramientas moleculares han
ganado popularidad la última década, siendo empleados exitosamente para
diferenciar entre las poblaciones de Colletotrichum de muchos hospederos.
La sensibilidad al benomyl ha sido empleada principalmente para estimar el
potencial de tales compuestos (benzimidazoles) en el control químico. Este
método sencillo puede ser utilizado para una caracterización adicional de
poblaciones locales de Colletotrichum asociadas con enfermedades
particulares de antracnosis (Freeman et al., 1998). Aunque esta prueba
permite diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides debe ser
complementada con otro tipo de pruebas moleculares debido a que se puede
presentar resistencia a los productos químicos. La prueba cualitativa de la
proteasa (Martín & García-Figueres, 1999) es una prueba rápida que
permite diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides por la producción
de enzimas extracelulares donde se generan halos de 3 a 4 mm de diámetro
sobre el medio de cultivo, esta prueba debe ser complementada con
52
herramientas moleculares para establecer la presencia de biotipos o
variaciones del genero.
Dentro de las técnicas moleculares empleadas se encuentran: el análisis
DNA (rRNA) ribosomal; primers específicos han sido designados
principalmente deacuerdo con las disimilitudes en la secuencia de las
regiones ITS de diferentes aislamientos de Colletotrichum., dichos primers
se han usado para diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides por
medio de la amplificación de fragmentos con PCR; análisis de polimorfismo
en DNA nuclear, empleando (RFLP) y análisis de enriquecimiento de A+T–
rich DNA asociado con (mt) DNA.
Los análisis de rDNA son métodos empleados para la identificación
taxonómica de las especies, mientras que los análisis usando GcpR1 y otros
elementos repetitivos de DNA, A+T-rich, DNA RFLPs, and ap-PCR son
métodos empleados para determinar diversidad de las subpoblaciones entre
las especies (Freeman et al., 1998). Los métodos moleculares son usados
para la caracterización de las especies responsables de la antracnosis de
diferentes cultivos debido a que las descripciones morfológicas no son
confiables para la identificación del patógeno. La diversidad genética de las
diferentes poblaciones además es valorada de cada población derivada del
hospedero.
3.6.2.7. Control de la enfermedad
Se ha planteado un programa de soqueo y manejo integrado de la
enfermedad (Tamayo 1995); siendo favorable desde el punto de vista
productivo y en rendimiento. Dentro de las prácticas recomendadas se
requiere mantener distancias de siembra entre los 3 y 4 m entre plantas,
53
deshoje y eliminación del inóculo potencial, permitir la aireación del cultivo y
mejor visualización para la detección y remoción de frutos enfermos,
aplicación de fungicidas con adherentes cada ocho días en invierno y cada
quince días en verano y la rotación de fungicidas para evitar crear resistencia
en el hongo. El control químico se realiza basado en fungicidas, sistémicos y
protestantes en rotación. Aplicar productos como Captan y a base de cobre
durante la época de floración proporcionan un buen control de la
enfermedad. Desinfectar las bodegas aplicando en las paredes una lechada
de cal viva con hipoclorito de sodio al 5%. Los empaques deben se lavados
con detergente y desinfectados con una solución de yodo o hipoclorito de
sodio al 3-5%. Las frutas pueden asperjarse o sumergirse en una solución de
Tiabendazol a 2500 ppm o Perchloraz a 500 ppm. En los puntos de venta
desinfectar las vitrinas exhibidoras y constantemente retirar frutos enfermos.
54
4. MATERIALES Y MÉTODOS:
4.1 Tipo de estudio
El tipo de investigación realizada fue exploratoria debido a que durante la
revisión de literatura se encontró que se han realizado estudios similares con
respecto a la caracterización del agente causal de la antracnosis
(Colletotrichum spp.) en otros lugares del mundo y sobre huéspedes
diferentes a los utilizados en este estudio; adicionalmente, aunque se han
realizado estudios de patogenicidad cruzada utilizando este microorganismo
en otros países del mundo no se ha realizado en Colombia utilizando los
huéspedes descritos originarios de la zona andina y comparándolos con una
de las enfermedades mas estudiadas en mango, especie que prefiere
condiciones diferentes para su cultivo. Por lo tanto, la investigación examinó
el tema a nivel colombiano.
Al mismo tiempo, la investigación fue evaluativa y descriptiva debido a que el
propósito de este estudio fue decir cómo son y cómo se manifiestan macro y
microscópicamente las estructuras características del patógeno
Colletotrichum spp. a partir de los aislamientos obtenidos de los cinco
huéspedes, a través de la medición y observación de las mismas con la
mayor precisión posible y si se presentaba alguna variación en la expresión
de los síntomas al inocular los aislamientos procedentes de los otros
huéspedes. El estudio se realizó en el laboratorio de fitopatología de la
Universidad Nacional, sede Bogotá.
55
4.2 Recolección de muestras
Los aislamientos se colectaron a partir de frutos de lulo (Solanum quitoense
Lam), tomate de árbol (Solanum betacea Sendt), granadilla (Passiflora
ligularis Juss), mango (Mangifera indica L) y tallos de mora (Rubus glaucus
Benth), con síntomas iniciales de antracnosis adquiridos en el mercado local
y en zonas productoras de los frutos como en Fusagasuga, Granada, Puente
Nacional, para frutos de clima frío moderado y de Ibagué en el caso de los
frutos de mango (Figura 3). Se realizaron varios muestreos para cada uno
de los frutos de interés con el fin de obtener patógenos con orígenes
diferentes y poder observar diversidad genética.
Figura 3. Síntomas de antracnosis. A. Mango. B, Lulo. C, Granadilla. D, Tallos de mora. E, F Tomate de árbol (Foto C. A. Contreras).
4.3 Aislamientos
Al iniciar el procedimiento, la superficie de los frutos se lavó con agua y jabón
y se secó con una toalla de papel estéril (Bernstein, et al., 1995). El tejido de
interés se obtuvo con la ayuda de un bisturí estéril cortando fragmentos de
tejido infectado y sano de aproximadamente 5x5 mm desde la periferia de las
lesiones, los cuales se manipulan con pinzas estériles y se sumergen durante
56
5 minutos en una caja de Petri con hipoclorito de sodio a una concentración
de 0.525% con el fin de eliminar la flora normal presente en el tejido
(Cedeño, et al., 1993; Dhingra, et al., 1995). Transcurrido el periodo de
desinfestacion, los fragmentos de tejido se enjuagaron 3 veces
sumergiéndolos en agua destilada estéril para eliminar los residuos de
desinfestante que pudiesen interferir con el desarrollo normal del patógeno.
Posteriormente bajo condiciones asépticas, se secaron los fragmentos de
tejido utilizando una toalla de papel estéril, para eliminar los excesos de
humedad que contribuyeran con la contaminación del aislamiento.
Finalmente, los fragmentos de tejido se sembraron en cajas de Petri con
papa-dextrosa-agar, se realizaron 3 repeticiones por fruto (ANEXO 1)
enterrando cuatro fragmentos de tejido en posición equidistante en la placa
de agar a través de manipulación con pinzas (Cedeño, et al., 1993; Dhingra,
et al., 1995).
Las placas de agar sembradas se incubaron a temperatura ambiente (±20°C)
durante 8 días, cada uno de los aislamientos obtenidos fueron resembrados
en placas de PDA por separado con el fin de purificar el hongo; así mismo,
se realizaron observaciones microscópicas (10 y 40X) coloreadas con azul
de lactofenol (100 ml de lactofenol, 1 ml de azul de algodón al 1% y 20 ml de
ácido acético glacial) con el fin de verificar la naturaleza del patógeno y
familiarizarse con la morfología de las conidias, el micelio y otro tipo de
estructuras típicas del microorganismo (Byrne, et al., 1997). La verificación
de la naturaleza del hongo se realizó con base en la clave para la
identificación de hongos imperfectos de Barnett (1999).
57
4.4. Conservación de los aislamientos
Una vez confirmado que los aislamientos obtenidos pertenecían al
microorganismo en estudio, se realizaron cultivos monospóricos para obtener
colonias puras. Para este fin se tomó una caja de petri de cada uno de los
aislamientos de 8 días de crecimiento, a los cuales se les agregó 10 ml de
agua destilada estéril con Tween 20 a una concentración de 100μl/l y con la
ayuda de un pincel estéril se barrió la superficie de las colonias. La
suspensión obtenida se filtró para recuperar las conidias. Finalmente, la
suspensión conidial se sembró en forma masiva y se incubó a 25ºC durante
las primeras 12 horas, para observar la germinación de las conidias a partir
de las cuales se recuperaron las colonias monospóricas que posteriormente
se sembraron de forma individual en cajas de Petri con PDA y se incubaron a
25º C.
Los cultivos monospóricos derivados de cada aislamiento fueron
almacenados en tubos con PDA en pico de flauta a 4°C, con el propósito de
limitar su crecimiento, hasta su utilización durante el desarrollo de este
trabajo. Con el fin de mantener colonias jóvenes se realizaron subcultivos
periódicamente en PDA, inoculando el medio con cuadros de agar con el
hongo de 5x5mm, los cuales fueron incubados durante 7 días a temperatura
ambiente (±20ºC).
4.5. Caracterización macroscópica
La descripción macroscópica comprende aspectos como el color de las
colonias, el tipo de micelio y la tasa de crecimiento, estos aspectos han sido
empleados para realizar y dar a conocer una descripción morfológica del
hongo Colletotrichum.
58
4.5.1. Color de las colonias
Los métodos de identificación tradicionales, han empleado el color de las
colonias como criterio de clasificación de las especies del género
Colletotrichum; en el caso de C. gloeosporioides, las colonias son grises y las
de C. acutatum de color salmón o rosado. El color de las colonias se
determinó examinando la masa conidial y micelial sobre una superficie
blanca. La observación de los cultivos se realizó a partir de cepas de 8 días
de incubación a (±20ºC) en cajas de Petri con PDA a partir de un cultivo
monospórico (Smith and Black, 1990).
Mediante este criterio establecimos dos grupos de aislamientos los
asilamientos de color gris fueron denominamos como GRAN-CG, LULO-CG,
MANGO-CG, MORA-CG, TOAM-CG, TOMR-CG; aislamientos de granadilla,
lulo, mango, mora, tomate de árbol amarillo y tomate rojo respectivamente.
Los aislamientos de color salmón, rosado fueron designados como GRAN-
CA, LULO-CA, MANGO-CA, MORA-CA, TOAM-CA, TOMR-CA.
4.5.2. Tipo de micelio
El tipo de micelio se determinó mediante la observación directa, teniendo en
cuenta los siguientes criterios: micelio algodonoso, esponjoso, velloso y si el
crecimiento del micelio se extendía por la superficie del agar, si penetraba el
medio y la presencia de micelio aéreo.
59
4.5.3. Crecimiento radial diario en PDA
El crecimiento radial de cada uno de los aislamientos se evalúo en cajas de
Petri con 18 ml de PDA, sembradas con trozos de agar de 5x5 mm con el
crecimiento del hongo que procedían de cultivos de 3-4 días, mantenidos a
temperatura ambiente (± 20°C ). El crecimiento radial se determinó
midiendo el diámetro de la colonia a intervalos de 24 horas durante 7 días,
incubando a 20, 25 y 28 o C y realizando 3 repeticiones por tratamiento
(Bernstein, et al., 1995).
Para determinar las tasas de crecimiento se empleó la hoja de cálculo
EXCEL 2003, mediante el procedimiento de regresión lineal, empleando, el
promedio de las pendientes lineales de tres repeticiones. El análisis
estadístico comprendió un ANOVA de dos factores (Aislamiento y
temperatura) para 3 repeticiones, con la prueba de Tukey donde se evalúo si
se presentaban diferencias en los tratamientos, para este procedimiento se
empleó el programa STATGRAPHICS Plus versión 5.1.
4.6. Caracterización microscópica
Los microorganismos aislados se identificaron mediante observaciones
microscópicas y con la ayuda de claves taxonómicas con el objetivo de
reconocer el hongo Colletotrichum y con el fin de determinar si los
aislamientos correspondían a una o varias especies, dentro de los aspectos
que se tuvieron en cuenta se encontraban la forma y tamaño de las conidias
que han sido criterios empleados por los sistemas tradicionales de
identificación.
60
4.6.1. Conidias
4.6.1.1. Forma y tamaño de las conidias
A partir de cada uno de los aislamientos incubados durante 9-12 días a 20,
25 y 28ºC se preparó una suspensión conidial en agua destilada estéril y se
determinó la forma de las conidias por observación de 50 conidias escogidas
al azar; de esta manera se ubicaron en tres categorías establecidas para la
forma de este género: 1). Fusiformes, (F) lados ahusados en ambos
extremos, 2) Cilíndricas, (C1) conidias con lados rectos y extremos redondos
a ambos lados y 3). Cilíndricas, (C2) conidias con lados rectos, un extremo
puntudo y el otro redondo. La forma y el tamaño de las conidias se determinó
utilizando microscopía de luz (Smith and Black, 1990).
El tamaño conidial de cada aislamiento se determinó midiendo el largo y el
ancho de 50 conidias escogidas al azar y expresado como un rango de
medias. El tamaño de las conidias se determinó por medio de un micrómetro
ocular el cual se calibró utilizando un micrómetro de platina, para determinar
la distancia lineal que representa cada unidad o valor micrométrico en un
aumento de 40X. Los micrómetros de platina son similares a una lámina
portaobjeto y tienen grabadas escalas que representan medidas exactas y
convencionales. (Smith and Black, 1990).
Para observar la variación de la forma y el tamaño de las conidias en cada
una de las temperaturas evaluadas se realizó un ANOVA de dos factores
(para el tamaño: Largo o ancho, temperatura y para la forma: el tipo de forma
y la temperatura), para establecer diferencias significativas entre los
tratamientos. La prueba de tukey se realizó para determinar las medias que
son significativamente diferentes unas de otras. Se empleó el programa
STATGRAPHICS Plus versión 5.1.
61
4.7. Sensibilidad al Benomyl
Una de las pruebas mediante las que se logra establecer si los aislamientos
de Colletotrichum pertenecen a las especies C. gloeosporioides y C
.acutatum es la sensibilidad de los aislamientos al Benomyl, por lo cual se
preparó una suspensión conidial de 1 x 105 conidias/ ml de cada uno de los
aislamientos (Freeman, et al., 1998). Luego se impregnaron discos de papel
filtro de 1 cm de diámetro en cuyo centro se practicaron perforaciones
circulares, con el producto Benlate en la dosis comercial de 1g/L y una dosis
superior de 1,5g/L; los discos se dejaron secar a temperatura ambiente en
una cámara de flujo laminar. Posteriormente se colocaron los discos en cajas
de petri con PDA y se inoculó 10 µL con la suspensión conidial en el centro
del disco. El control consistió en discos impregnados con agua destilada
estéril inoculadas. La evaluación se realizó asignando valores de cero si no
se presentó crecimiento sobre los discos y de uno y hubo crecimiento. El
montaje se realizó con tres repeticiones por dosis evaluada, las lecturas se
realizaron en 7 días y se incubó a (±20ºC).
4.8. Prueba de la proteasa
La prueba de la proteasa ha sido empleada para diferenciar las especies C.
gloeosporioides y C .acutatum. El medio para evaluar la producción de la
protesa (ANEXO 2), nos permitió establecer dos tipos de reacción una (+) y
otra (-); las cajas se sembraron con ayuda de un sacabocado de 5 mm de
diámetro, tomado bloques de agar son crecimiento micelial de cada
aislamiento, se realizaron 5 repeticiones (Martín & García-Figueres, 1999).
El principio de la prueba (prueba +) se basa en la producción de la enzima
proteasa fuera de las células (como una exoenzima), alrededor del medio,
catalizando el rompimiento de las proteínas de la leche, principalmente la
62
caseína, en aminoácidos y péptidos. Esta reacción ocasiona que en el agar,
normalmente opaco por la leche se observen zonas transparentes alrededor
de la zona de crecimiento del microorganismo
4.9. Pruebas de patogenicidad cruzada
Esta prueba se realizó con el fin de observar la capacidad patogénica que
tienen los aislamientos de un fruto específico en generar síntomas de
antracnosis sobre frutos sanos en estado de maduración de lulo (S.
quitoense), tomate de árbol (S. betacea ), granadilla (P. ligularis), mango (M.
indica) y tallos de mora (R. glaucus). Se emplearon 3 frutos por aislamiento
y dos como controles, los cuales fueron previamente lavados con agua y
jabón para remover residuos de fungicidas y elementos contaminantes.
Posteriormente, su superficie se sometió durante dos minutos en una
solución de hipoclorito de sodio a una concentración de 0.525%, para
desinfectarlos y luego se enjuagaron en agua destilada estéril (Bernstein, et
al., 1995).
A cada uno de los frutos y los tallos se les realizó 4 círculos con un lápiz de
cera, indicando los siguientes tratamientos, cumpliendo con un diseño
completamente aleatorio: 1. Agar con crecimiento micelial sobre una herida
realizada e el fruto o tallo; 2. Inóculo de conidias aplicado sobre el fruto o tallo
sin realizar heridas; 3. Inóculo de conidias sobre heridas; 4. Agar con
crecimiento micelial sobre el fruto o tallo sin realizar heridas. Los controles
consistieron en frutos o tallos sobre los cuales se colocaron bloques de agar
sin crecimiento micelial e inoculaciones con agua destilada estéril, para el
control negativo. El control positivo consistió en inocular la cepa sobre el
hospedero del cual fue aislado. Las heridas se realizaron con una aguja de
disección estéril. Inmediatamente después de la inoculación todos los
63
materiales se colocan en cámara húmeda (90-100%), y diariamente se
revisan para observar el desarrollo de la enfermedad. Las cámaras húmedas
se mantuvieron a una temperatura de (±20ºC), por un período de tiempo de
10 días para los frutos y 15 días para los tallos de mora. De los tejidos
finalmente infectados se realizan aislamientos para comprobar los postulados
de Koch (Cedeño et al., 1993).
4.9.1. Preparación del inóculo
Como inóculo se usan cuadros de agar de 5x5 mm con el patógeno,
extraídos de colonias de 7 días de crecimiento en agar PDA y gotas de
suspensión conidial (1x105 conidias/ml). La suspensión conidial se recolectó
mediante el cepillado de la superficie de la colonia con un pincel estéril,
agregando 10 ml de agua destilada estéril, que posteriormente se filtró para
separar el micelio y obtener las conidias (Manandhar et al., 1995).
64
5. RESULTADOS Y DISCUSION
5.1 Descripción macroscópica
5.1.1. Características de la colonia.
El crecimiento de todos los aislamientos se presentó de forma radial; el
aspecto micelial predominante fue algodonoso. La presencia de micelio
aéreo se describió como superficial en el 83.33% de los casos y con
presencia de micelio aéreo denso, 16.67% para las cepas MANGO-CG,
MORA-CG (ANEXO 3) (Fig 4). Esta característica morfológica ha sido
descrita por Katan en Colletotrichum gloeosporioides aislado de aguacate
(Freeman et al., 1998) quien propone varias pautas como las del tipo
conidial: con masas de conidias y sin micelio aéreo; el tipo conidial - micelial,
con micelio aéreo denso y masas de conidias; el tipo micelial -superficial,
con poco micelio aéreo o conidias; el tipo micelial con micelio aéreo denso el
tipo protoperitecial y peritecial. Estas pautas demuestran la variabilidad
existente dentro de las especies y que es un criterio limitante en la
clasificación taxonómica, pese a que aporta otra serie de características en la
descripción del hongo (Freeman, et al., 1998).
TIPO DE MICELIO
16,67%
83,33%
Micelio aereo densoMicelio aereo superficial
Figura 4. Tipo de micelio predominante en los aislamientos
65
Respecto al color de las colonias, el gris se observó en el 41.67% de las
colonias, comprendiendo los aislamientos de LULO-CG, MANGO-CG,
MORA-CG, TOAM-CG y TOMR-CG; el 33.33% de las colonias presentó
color salmón, correspondiente a las cepas GRAN-CA, LULO-CA, MORA-CA,
TOMR-CA; los aislamientos GRAN-CG y MAN-CA presentaron color blanco,
y representaron el 16,67%; finalmente el 8.33% que correspondió al
aislamiento TOAM-CA, presentó color rosado (Figura 5 y 6), (ANEXO 3).
COLOR DE LAS COLONIAS
16,67%
41,67%8,33%
33,33%BLANCOGRISROSADOSALMON
Figura 5. Color de la colonia predominante en los diferentes asilamientos
El micelio de los hongos inicialmente fue blanco y se tornó salmón o rosado
debido a la producción de masas de esporas con la edad, característica que
se presenta en asilamientos de C. acutatum, mientras que las colonias de C.
gloeosporioides posteriormente presentan tonalidades grisáceas. El color de
las colonias fue característico del género Colletotrichum y de acuerdo a la
descripción realizada por Simmonds 1965 para C. acutatum y por Arx 1957,
1981; Morgue, 1971; Sutton, 1980, Baxter 1983; Holliday, 1989 para C.
gloeosporioides se presumió la presencia de al menos estas dos especies
(Freeman et al., 1998; Sutton, 1992), sin embargo, la morfología de la colonia
del género Colletotrichum varia entre y dentro de las especies, además esta
sujeto a variaciones por características como el medio, el sustrato y los
cambios de la temperatura entre otros (Adaskaveg & Hartin 1997; Freeman
66
et al.,1998). Se han demostrado incongruencias entre las descripciones
morfológicas y los estudios moleculares para la identificación de especies de
Colletotrichum (Afanador et al.,2003)
5.2. Curva de Crecimiento a 20,25 y 28ºC
La temperatura óptima de crecimiento para las cepas GRAN-CA, GRAN-CG,
LULO-CA, LULO-CG, MORA-CA, MORA-CG, TOAM-CA, TOAM-CG, se
presentó a los 20ºC, mientras que a los 25 y 28ºC disminuyó. En las cepas
MANGO-CG y MANGO-CA hubo un crecimiento óptimo a los 28ºC y su
menor crecimiento fue a los 20ºC,
Figura 6. Variación en el color de las colonias. A, aislamiento de mora MORA-CG, colonia gris. B, lulo LULO-CA, colonias color salmon. C, tomate de árbol TOAM-CA, colonias color rosado. D, mango MANGO-CG, colonias color gris oscuro.
Se puede observar un efecto significativo de la temperatura (p< 0.05), del
tipo de aislamiento (p< 0.05), y del efecto de estos dos factores sobre el
crecimiento de las colonias (p< 0.05), (ANEXO 4). Dado que los aislamientos
de granadilla, lulo, mora, tomate de árbol crecen mejor a una temperatura de
20ºC y los de mango a 28ºC, probablemente haya una relación con las
67
condiciones donde se desarrollan los hospederos; en este caso hablamos de
plantas de clima frío moderado donde las temperaturas ideales para su
desarrollo oscilan entre los 16 y 18ºC, para granadilla; en lulo de 18-20ºC;
mora 14-18ºC; tomate de árbol, 14-20ºC; mientras para mango, fruto de clima
caliente, su temperatura de desarrollo oscila entre los 26-28ºC; dicha relación
se puede apreciar en la figura 7. Además los factores genéticos, biológicos y
fisiológicos existentes dentro y entre las especies de Colletotrichum permiten
el desarrollo y adaptabilidad de las especies bajo ciertas condiciones
(Wheeler & McGahen, 1952).
Swart (1999), reporta una temperatura óptima de 25ºC para aislamientos de
C. gloeosporioides en mango realizados en Sudáfrica y establece diferencias
significativas de la temperatura en respuesta al crecimiento, de acuerdo con
la zona de origen de los aislamientos. Peres et al. (2002), trabajó con
aislamientos de Colletotrichum en maracayá, mango, papaya, guayaba,
banano, fresa, aguacate los cuales presentaron un crecimiento óptimo a los
28ºC, lo cual corrobora el resultado de este estudio en los aislamientos de
mango. Aislamientos obtenidos a partir de durazno y fresa tienen un
comportamiento similiar cuando son incubados a una temperatura de 25ºC
(Adaskaveg & Hartin, 1997).
Según Agrios (1998), el efecto de la temperatura sobre el desarrollo de una
enfermedad particular después de la infección, depende de la interacción
entre el patógeno y el hospedero. El desarrollo rápido de la enfermedad
(tiempo mínimo requerido para completar el ciclo), usualmente se presenta
cuando la temperatura es óptima para el desarrollo del patógeno, pero está
sobre o bajo la temperatura óptima del desarrollo del hospedero. A
temperaturas más bajas o más altas con relación a la temperatura óptima del
patógeno, o cercanas a la temperatura óptima del hospedero, el desarrollo de
la enfermedad es más lento. Si la temperatura mínima, óptima y máxima para
68
el patógeno, el hospedero y la enfermedad son las mismas, el efecto de la
temperatura en el desarrollo de la enfermedad es aparentemente a través de
la influencia sobre el patógeno, el cual es activado a la temperatura óptima
del hospedero aún cuando no presente su tasa de crecimiento óptima. En
muchos casos la temperatura óptima para el desarrollo de la enfermedad
muestra ser diferente a la temperatura óptima del patógeno como del
hospedero, como sucede en el hongo Thielaviopsis basicota en tabaco.
0102030405060708090
100
20 25 28Temperatura (ºC)
Crecimiento (mm)
MANGO-CGMANGO-CAGRAN-CGGRAN-CAMORA-CGMORA-CALULO-CGLULO-CATOMR-CGTOMR-CATOAM-CGTOAM-CA
Figura 7. Curva de crecimiento del hongo Colletotrichum spp en frutos de granadilla, lulo, mango, tomate de árbol y tallos de mora bajo temperaturas de 20, 25 y 28ºC
5.2.1 Tasa de Crecimiento a 20, 25 y 28ºC
La tasa de crecimiento vario deacuerdo con las temperaturas evaluadas. En
los aislamientos de clima frío moderado se observó que fue mayor a los 20ºC
y menor a los 25 y 28ºC; de modo opuesto sucedió para los aislamientos de
mango donde disminuyó a los 25 y 20ºC, siendo óptima a los 28ºC. La tasa
de crecimiento promedio de las cepas GRAN-CA, LULO-CA, MANGO-CA,
MORA-CA, TOAM-CA, TOMR-CA fueron menores bajo las tres temperaturas
en comparación con las cepas GRAN-CG, LULO-CG, MANGO-CG, MORA-
CG, TOAM-CG y TOMR-CG (ANEXO 5).
69
La tasa de crecimiento y las relaciones de temperatura han sido usados para
diferenciar entre C. gloeosporioides y C. acutatum. Varios reportes sugieren
que los aislamientos de C. acutatum crecen a una tasa significativamente
menor que la de C. gloeosporioides, lo cual podría explicar la diferencia entre
las tasas de crecimiento entre este grupo de aislamientos (Bernstein et
al.,1995; Smith & Black, 1990).
Aunque algunos autores establecen que la tasa promedio de crecimiento
para C. gloeosporioides es de 13 a 14 mm/día (Gunnell ,1992); mientras para
C. acutatum es de 8 a 9 mm/día (Dyko, 1989) esta tasa varía de acuerdo al
tipo de hospedero y las condiciones de origen. En frutos de almendro en
California y en Israel la tasa promedio de crecimiento para las especies de C.
gloeosporioides es de 2.2 (1.6-2.8) y para C. acutatum de 7.7 (4.9-9.9) en
frutos inmaduros (Freeman et al.,1998). En fresa se ha descrito a C.
gloeosporioides como un microorganismo de rápido crecimiento a
temperaturas de 32ºC, mientras C. acutatum presenta crecimiento mas bajo
(Smith & Black, 1990).
5.2.1. Características de las conidias a 20, 25 y 28ºC
Forma
La forma predominante en las cepas GRAN-CA, LULO-CA, MANGO-CA,
MORA-CA fue del tipo fusiforme, alrededor de un 50-60% y de un 80-100%
para TOAM-CA y TOMR-CA, estas cepas también presentaban conidias del
tipo C1 y C2. Las cepas de GRAN-CG, presentaron forma cilíndrica del tipo
C1 en un 80%, mientras en los aislamientos LULO-CG, MANGO-CG, MORA-
CG, TOAM-CG y TOMR-CG, se observó el tipo de conidias C2 en un 60-
80%. En este estudio también se observó una forma de conidia en forma de
70
pesas, que ha sido reportada como ocasional (Tamayo, 2001). La figura 8
nos muestra, el tipo de formas conidiales que se presentaron durante la
caracterización de los aislamientos y en la figura 9, se puede apreciar que
en la mayoría de los aislamientos se presentó al menos dos tipos de forma
conidial, que en forma general comprendió las de tipo C1 y C2, aún cuando
fueron sometidos al tratamiento de las tres temperaturas.
La forma de las conidias no varió significativamente en ninguna de las
temperaturas evaluadas (p>0.05), ni bajo el efecto de interacción entre la
temperatura y tipo de aislamiento (p>0.05), sin embargo, se presentó una
diferencia significativa en cuanto a aislamientos (p< 0,05), siendo muy
marcado entre los aislamientos de LULO-CG, MANGO-CG, MORA-CG,
TOAM-CG y TOMR-CG y GRAN-CG frente a los aislamientos LULO-CA,
MANGO-CA, MORA-CG, TOAM-CA, TOMR-CA y GRAN-CA ,(ANEXO 6).
Fig 8. Forma de las conidias. A, Conidias con forma fusiforme, con ambos extremos terminados en punta (F). B, Conidias con forma cilíndrica, con ambos extremos redondos (C1). C, Conidias cilíndricas, con un extremo redondo y otro agudo (C2). D, Conidias en forma de pesa (P). (Foto C.A. Contreras) La variación en la forma de las conidias entre aislamientos de Colletotrichum,
morfológicamente se ha empleado como un método tradicional de
clasificación y en términos generales se ha descrito que las conidias de C.
gloeosporioides, son de forma cilíndrica y las de C. acutatum son fusiformes
71
respectivamente. Muchos autores indican una gran variación en la forma de
la espora dentro de ambos taxa (Smith & Black, 1990; Walker, Nikandrow &
Millar, 1991, Lardener et al.., 1999).
Lardener (1999) menciona que las conidias de C. acutatum, pueden ser
cilíndricas con uno a ambos lados agudos o con un extremo terminado en
punta como las características que presenta las C2. También se ha
documentado la producción de conidias secundarias – fialoconidias formadas
en medios de cultivo poco después de la germinación de la espora
especialmente en C. acutatum (Stoneman, 1898; Baxter, Van der Westhuizen
& Ricker 1983, Buddie et al., 1999), este tipo de conidia es generalmente
mas pequeña y mas variable en forma que las producidas en los cuerpos
fructíferos.
Sin embargo, este criterio no es consistente para discernir entre ambas y
otras especies ya que hay muchas cepas de Colletotrichum que presentan,
morfología y tamaños conidiales intermedios, además de mostrar una
amplia variación en características de su colonia.
A
0
10
20
30
40
50
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
GRANCA
GRANCG
LULOCA
LULOCG
MANGOCA
MORA-CA
MORACG
TOAM-CA
TOAM-CG
TOMR-CA
TOMR -CG
Aislamientos
Nº Conidias
C1
C2
FP
72
B
0
10
20
30
40
50
60
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
C1
C2 F P
GRAN-CA
GRAN-CG
LULOCA
LULOCG
MANGO-
MANGOCG
MORA-CA
MORACG
TOAM-CA
TOAM-CG
TOMR-CA
TOMR-CG
Aislamientos
Nº Conidias
P
F
C2
C1
C
0
10
20
30
40
50
60
C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F C1
C2 F
GRANCA
GRANCG
LULOCA
LULOCG
MANGOCA
MANGOCG
MORACA
MORACG
TOAMCA
TOAMCG
TOMRCA
TOMRCG
Aislamientos
Nº ConiidasF
C2
C1
Figura 9. Efecto de la temperatura sobre la forma de las conidias. A 20ºC. B, 25ºC y C,
28ºC
73
5.2.1. Tamaño de las conidias
El largo de las conidias no varió significativamente a los 20, 25 y 28ºC;
(p>0.05), ni se presentó una variación conjunta influenciada por los factores
temperatura y aislamiento (p>0,05). El ancho de las conidias varió
significativamente respecto a la temperatura y los aislamientos evaluados (p<
0,05), pero, la interacción entre los factores asilamientos y temperatura no es
significativa (p>0,05) (ANEXO 7y 8). En la figura 10, se pueden observar las
variaciones en cuanto al ancho y largo de las conidias cuando los
asilamientos fueron sometidos a las tres temperaturas. La tabla 1, muestra
los aislamientos que presentaron los mayores tamaños conidiales.
Fruto Aislamientos Tamaño (µm)
Granadilla GRAN-CA 17.5 x 7.5
Granadilla GRAN-CG 17.5 x 7.5
Lulo LULO-CA 17.5 x 2.5
Lulo LULO-CG 17.5 x 2.5
Mango MANGO-CA 15 x 2.5
Mango MANGO-CG 17.5 x 2.5
Mora MORA-CA 15 x 2.5
Mora MORA-CG 25 x 2.5
Tomate amarillo TOAM-CA 25 x2.5
Tomate amarillo TOAM-CG 17.5 x 2.5
Tomate rojo TOMR-CA 15 x 2.5
Tomate rojo TOMR-CG 17.5 x 2.5
Tabla 1. Tamaño de las conidias.
74
Según los sistemas de clasificación tradicionales, el tamaño de las conidias
para C. gloeosporioides varia entre 12-17 x 3.5- 6 µm y las de C. acutatum
8.5-16.5 x 2.5-4 µm, Sutton (1992) y aunque en este estudio algunos
tamaños exceden los rangos propuestos y otros tamaños se encuentran
dentro de los establecidos para C. gloeosporioides y C. acutatum se
considera que este criterio no es el mas adecuado para diferenciar entre
dichas especies.
En estudios realizados en Colombia sobre diferentes frutos, se ha podido
determinar que el tamaño de las conidias vario entre 13-18 x 4.4-6.6 µm
para Colletotrichum sp y de 10.3-18.7 x 3.7-5.6 µm para Colletotrichum
acutatum aislado de Tamarillo; en Passiflora, 12-16 x 5-7 µm para
Colletotrichum sp y en Mango de 12-14.5 x 5-7 µm para Colletotrichum
gloeosporioides (Afanador et al., 2003). En lulo el tamaño vario entre 9.52-
22.25 x 3.17-9.52 para especies de C. gloeosporioides y C. acutatum
(Cerón, 2004), en mora de castilla 11-13.3 x 3.1 µm para C. gloeosporioides
(Gonzáles & Perilla, 2001) y en tomate de árbol 8.49-18.2 x 2.5- 3.97 para C.
gloeosporioides (Romero, 1999).
Sanders & Korsten (2003) encontraron variaciones considerables en la
longitud de las conidias de C. gloeosporioides pero el ancho permaneció
constante, contrario a lo que se reporta en este trabajo, donde se encontró
diferencia en el ancho y no en la longitud de las conidias. Estos autores
establecen que no hay una correlación evidente entre el radio ancho/largo y
la virulencia de los aislamientos cuando se inoculan frutos de mango y de
aguacate.
Pese a que C. acutatum es conocido por producir conidias directamente
sobre el micelio y no necesariamente en los acérvulos, tanto en cultivos
puros como en inoculaciones artificiales, las dimensiones de las esporas
75
producidas en substratos naturales pueden diferir de las presentes en
cultivos artificiales (Buddie et al., 1999).
B
Figura 10. Efecto de la temperatura sobre el tamaño de las conidias. A, efecto sobre el ancho de las conidias. B, efecto sobre el largo de las conidias
A
Temperatura
AISLAMIENTO GRAN-CA GRAN-CG LULO-CA LULO-CG MANGO-CAMANGO-CGMORA-CA MORA-CG TOAM-CA TOAM-CG TOMR-CA TOMR-CG
2,6
3,1
3,6
4,1
4,6
5,1
20ºC 25ºC 28ºC
Ancho
(µm)
Temperatura
LARGO (µm)
AISLA GRAN-CAGRAN-CGLULO-CALULO-CGMANGO-CAMANGO-CGMORA-CAMORA-CGTOAM-CATOAM-CGTOMR-CATOMR-CG
11
12
13
14
15
20ºC 25º 28ºC
76
5.3. Prueba de Benomyl
En el tratamiento con benomyl, se observó que las dos dosis utilizadas (1 y
1.5 g Benlate/ L) inhibieron el crecimiento de las cepas GRAN-CG, LULO-CA,
MANGO-CG, MORA-CG y TOAM-CG, contrario a lo que ocurrió con las
demás cepas donde hubo crecimiento micelial sobre los discos impregnados
con benomyl. Los controles presentaron crecimiento normal sobre los discos
impregnados con agua destilada (ANEXO 10).
Esta prueba se utiliza para diferenciar entre las especies C. gloeosporioides
y C. acutatum (Freeman et al., 1998; Bernstein, 1995), por lo cual los
aislamientos que fueron sensibles al benomyl se considera que pertenecen a
la especie C. gloeosporioides, mientras que a aquellos que no son sensibles
pertenecen a C. acutatum como se puede observar en la figura 11.
De la Isla (1994), menciona que el mecanismo de acción de los
benzimidazoles se centra en inhibir el proceso mitótico fungoso, bloqueando
a la vez la síntesis de ácido desoxirribonucleico. El benomyl y la mayoría de
fungicidas sistémicos son convertidos en la superficie de las plantas al
compuesto metil benzimidazol carbamato (MCB, carbendazim), el cual
interfiere en la división nuclear de los hongos que son sensibles (Agrios
1999).
El Benomyl (Benlate), empleado como control químico de la antracnosis, ha
demostrado ser efectivo en un 59-80%, en frecuencias de aspersión de 8–15
días con dosis de 0,5 g/L y de 1g/L. Con los resultados obtenidos se puede
apreciar que concentraciones superiores y las concentraciones son efectivas
en el control de la enfermedad cuando el agente causal es C.
gloeosporioides, mientras que para el control C. acutatum, se debe pensar en
una alternativa ya que es un hongo más agresivo y no es controlado con
77
dicho producto. Además ambos hongos se pueden presentar generando
lesiones, en diferentes lugares del fruto o del tallo, así como en una misma
lesión; por lo cual la aplicación del producto solo estaría controlando una
parte del problema.
Figura 11. Prueba de Benomyl. Crecimiento de la cepa TOAM-CA sobre los discos impregnados con benomyl en dosis de 1g/L y 1.5 g/L (foto C. A. Contreras)
5.4. Prueba de Proteasa
En esta prueba las cepas positivas fueron GRAN-CA, LULO-CG, MANGO-
CA, MORA-CA, TOAM-CA, TOMR-CA, TOMR-CG, las cuales pertenecen a
C. acutatum (ANEXO 11). La prueba de la proteasa ha mostrado ser una
forma rápida y un test útil para diferenciar C. gloeosporioides de C. acutatum
(Martín & García-Figueres, 1999). En la prueba positiva se observó la
aparición de un halo transparente de 3-5 mm alrededor del sitio de contacto
del hongo con el agar debido a la degradación de las proteínas a peptonas
como se puede observar en la figura 12; en la prueba negativa se observó
crecimiento micelial sin que hubiese cambio alguno en el medio.
78
Figura 12. Halo producido por la prueba positiva de la proteasa.
Las especies de Colletotrichum son conocidas por producir un amplio rango
de enzimas capaces de destruir los componentes estructurales de los tejidos
vegetales y ocasionar muerte celular. Las enzimas frecuentemente
encontradas son aquellas que degradan los carbohidratos, aquellas,
disuelven la pared celular y las que hidrolizan la cutícula. Las enzimas que
degradan la pared celular como las poligalacturonidasas, pectin liasas y las
proteasas son consideradas de gran importancia en el proceso de
establecimiento, infección y maceración del tejido (Bailey et al., 1992).
Específicamente en el caso de las proteasas, cuando el patógeno secreta
estas enzimas, inactiva los componentes proteínicos de respuesta de
defensa de las plantas tales como las quitinas y la β-1,3 glucanasa. Se ha
demostrado la producción de enzimas como poligalacturonidasas y pectin
liasas (Fernando et al., 1994) en medio de cultivo a partir de de tejido de
hojas afectadas por C. acutatum en plantas de caucho (Hevea brasilensis) y
la producción de la enzima proteasa sobre medio (CMH) medio hidrólisis de
la caseína para diferenciar entre C. acutatum y C. gloeosporioides
(Paterson & Bridge 1994).
79
5.5 Pruebas de Patogenicidad cruzada
De los frutos y tallos evaluados el 73,61%, empleando bloques de agar con
micelio del microorganismo y el 70.83%, de los frutos inoculados con
suspensión conidial, mostraron la sintomatología de antracnosis en los
tratamientos sobre los cuales se realizaron heridas con la aguja disección. En
los frutos y tallos sobre los cuales no se practicaron heridas, el 13,89%
inoculado con suspensión conidial y el 20,83% con bloques de agar
manifestaron los síntomas.
Los aislamientos caracterizados por las pruebas de benomyl y proteasa
como C. acutatum se observó el potencial de patogenicidad cruzada,
encontrándose que la cepa GRAN-CA obtenida de granadilla, ocasionó
síntomas característicos de antracnosis en frutos de lulo, mango, tallos de
mora, tomate amarillo y tomate rojo. El aislamiento de mango MANGO-CA,
presentó patogenicidad en tallos de mora y en tomate amarillo; la cepa de
mora MORA-CA, infectó granadilla, mango, tomate amarillo y tomate rojo;
mientras las cepas TOAM-CA, aislamiento de tomate amarillo y TOMR-CA,
aislamiento de tomate rojo; mostraron síntomas en mango, tomate amarillo y
rojo respectivamente. La cepa TOMR-CG recuperada de tomate rojo produjo
síntomas en granadilla, lulo, mango y tomate amarillo. El aislamiento de lulo
LULO-CG fue patogénico sobre frutos de granadilla, mango y ambas
variedades de tomate (ANEXO 12).
Dentro de las cepas identificadas como C. gloeosporioides; la cepa GRAN-
CG mostró sintomatología en frutos de mango, tomate de árbol amarillo y
rojo. LULO-CA, cepa recuperada de lulo afectó los frutos de granadilla,
mango, las dos variedades de tomate y tallos de mora. El aislamiento de
80
mango MANGO-CG ocasionó síntomas en frutos de lulo, tomate de árbol
amarillo y rojo. La cepa de mora MORA-CG fue patogénica para mango,
tomate de árbol rojo y amarillo y el aislamiento TOAM-CG presentó
patogenicidad sobre frutos de tomate de árbol rojo, granadilla, lulo y mango
(ANEXO 11).
El fruto mas susceptible al ataque de las dos especies de Colletotrichum fue
el mango en el cual se presentaron lesiones, tanto en heridas provocadas
con aguja de disección así como en los tratamientos sin heridas, la
patogenicidad se manifestó en forma generalizada con la producción de
síntomas sobre heridas abiertas. Las lesiones iniciales se presentaron en los
frutos control de una forma más rápida, mientras que cuando se realizaron
las inoculaciones con las cepas provenientes de otros frutos, las lesiones
demoraron más días en formarse (ANEXO 12). Los primeros síntomas se
identificaron como puntos necróticos pequeños y superficiales de color café a
negro, que en algunos casos ocasionó un posterior hundimiento suave y
primario. En algunos frutos y tallos el avance de la lesión al cabo de unos 7 a
9 días después de la inoculación generó lesiones bien definidas que
demuestran la colonización del tejido por parte del patógeno, tal como se
puede apreciar en la figura 13 y 14. El posterior re-aislamiento del patógeno
a partir de los frutos con síntomas confirmó la presencia del mismo.
El potencial de infección cruzada ha sido reportado entre diferentes especies
de Colletotrichum y genotipos de C. gloeosporioides y de sobre una gran
variedad de frutas tropicales, subtropicales y templadas bajo condiciones
artificiales de inoculación. Se ha demostrado que aislamientos de C.
acutatum y C. gloeosporioides son capaces de infectar manzana, nuez y
durazno (Bernstein et al., 1995), en estudios realizados en Israel se
demostró que la antracnosis causada en aguacate por subespecies de C.
gloeosporioides es la misma que causa de la antracnosis en almendro, aún
81
cuando los surcos de almendro se encontraban sembrados a lo largo de las
plantaciones de aguacate.
Feeman et al.,(1998) mostró que C. gloeosporioides aislado de almendro,
manzana, aguacate y mango, así como asilamientos de C. acutatum aislado
de anémona, manzana y durazno, infectan frutos de otros hospederos,
incluyendo manzano (dos variedades), aguacate, almendro, mango y
nectarina (fruta cítrica). Esto demuestra el potencial de infección cruzada
entre ambas especies, sin embargo, dadas las condiciones de laboratorio
que se manejan en el experimento, es necesario realizar estudios a nivel de
campo para demostrar y establecer evidencia que el potencial de infección
cruzada se presente bajo estas condiciones.
La aplicación de herramientas moleculares y de patogenicidad nos permiten
establecer las variaciones dentro y entre las especies del género
Colletotrichum ya que se observó variación morfológica y además se
necesitan como un soporte de las pruebas de Benomyl y proteasa. Las
variaciones entre y dentro de especies, han sido documentadas en cultivos
fríjol, entre otros, con Colletotrichum lindemuthianum en el cual se han
reconocido diferentes razas. Seis ( alfa, beta, gamma, delta, lambda y
epsilon) y siete (con kappa junto con las ya mencionadas) razas fueron
reportadas en Norteamérica y Europa; nueve razas fueron reportadas en
brasil y otras mas en Méjico y Suramérica (Tu, 1992).
82
Figura 13. Pruebas de patogenicidad cruzada. A, Cepa GRAN-CA. B, Cepa LULO-CA. C,
Cepa MANGO-CG. D, Cepa TOMR-CA. E, Cepa MORA-CA. F, Cepa TOAM-CG. E. Cepa
TOMR-CG.
A
B
C
D
D
B
B
Control
F
E
A G
A D
B
A E
83
Figura 14. Pruebas de patogenicidad cruzada en tallos de mora. A. MORA-CG. B. GRAN-CA. C. LULO-CA
A. Control
B
C
C
84
6. CONCLUSIONES
La forma típica de las colonias en medio PDA fue radial, el color de las
colonias y el tipo de micelio fueron aspectos característicos del género.
Se pueden presentar varias formas de conidias en los aislamientos del
género Colletotrichum y variaciones en el tamaño que evidencian de alguna
manera heterogeneidad entre y dentro del género.
El efecto de la temperatura no fue significativo sobre la forma de las conidias
y sobre el tamaño de las conidias solo hubo diferencias significativas en
cuanto al ancho de las conidias.
De acuerdo con este estudio los sistemas tradicionales de clasificación con
base en las características morfológicas, no deben tomarse como un criterio
de clasificación de especies dentro del genero y deben ser complementados
con otras pruebas.
Los aislamientos, las pruebas de Benomyl y de la proteasa realizadas en
este estudio permitieron establecer las presencia de dos especies, C.
acutatum y C. gloeosporioides causantes de antracnosis en frutos de mango,
lulo, granadilla, tomate de árbol y tallos de mora.
Se demostró el potencial de infección cruzada entre los aislamientos de
frutos de granadilla, lulo, mango, mora y tomate de árbol, lo cual permite
sugerir a los productores la implementación de nuevas estrategias de manejo
dado el potencial permanente de inoculo en los ecosistemas donde se
cultivan las especies de clima frío moderado.
85
7. RECOMENDACIONES
Complementar este tipo de estudios con pruebas de caracterización
molecular que permitan identificar variaciones en la secuencia de ácidos
nucleicos, proteínas y bases nitrogenadas, entre y dentro de las especies
investigadas.
Realizar evaluaciones de campo que permitan confirmar los resultados
obtenidos en este estudio.
86
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98
9. ANEXOS
ANEXO 1. Preparación del agar PDA.
* Infusión de papa 200 g/L
D(+) glucosa 20g/L
Agar-Agar 15g/L
Ajustar el pH a 5,6 ± 0,2 a 25ºC
Calentar por un minuto y esterilizar a 121°C a 15 lbs. por 15 minutos.
*Infusión de papa: preparada a partir de 200 g de papa por litro,
99
ANEXO 2. Medio para evaluar la reacción de la proteasa producida por Colletotrichum acutatum.
KH2PO4 1,0 g
KCL 0,5 g
CaCl2.2H2O 0,2 g
Glucosa 10,0 g
Agar-Agar 12,0 g
Agua destilada 975 ml
*Leche desnaturalizada 15 % 25 ml
Ajustar el pH a 5,4 con Ácido Clorhídrico y posteriormente autoclavar a
121ºC, 20 min. 15 lb presión.
*Preparar una solución de leche al 15% ( Pesar 15 g de leche
desnaturalizada y diluirlos en 100 ml de agua destilada), someter a agitación
y tomar el volumen requerido para completar el litro (25 ml)
Recomendación: El volumen de agua (975 ml) debe estar bajo agitación
constante y luego comenzar a agregar cada compuesto en el orden
establecido
100
ANEXO 3. Características morfológicas de los aislamientos
AISLAMIENTOS COLOR DE LAS
COLONIAS
CRECIMIENTO DE LAS
COLONIAS
TIPO DE MICELIO ASPECTO
MICELIO
GRAN CA Salmón Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
GRAN CG Blanco Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
LULO CA Salmón Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
LULO CG Gris Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
MANGO CA Blanco Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
MANGO CG Gris oscuro Radial Micelio aéreo
denso
Algodonoso
MORA CA Salmón Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
MORA CG Gris Radial Micelio aéreo
denso
Algodonoso
TOAM CA Rosado Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
TOAM CG Gris Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
TOMR CA Salmón Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
TOMR CG Gris Radial Micelio aéreo
superficial
Algodonoso
101
ANEXO 4. Análisis estadístico para crecimiento radial
Anova: Two-Factor With Replication Curva crecimiento
ANOVA
Source of Variation SS Df MS F P-value F crit
Aislamientos 36574,92 11,00 3324,99 120,67 0,000 1,92
Temperaturas 5554,17 2,00 2777,08 100,78 0,000 3,12
Interacción 16899,83 22,00 768,17 27,88 0,000 1,69
Residuos 1984,00 72,00 27,56
Total 61012,92 107
Contraste Múltiple de Rangos para DIAMETRO según TEMP -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey TEMP Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- 28ºC 36 29,9167 0,87489 X 25ºC 36 42,0 0,87489 X 20ºC 36 47,0 0,87489 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- 20ºC – 25ºC *5,0 2,96111 20ºC – 28ºC *17,0833 2,96111 25ºC – 28ºC *12,0833 2,96111 ---------------------------------------------------------------------------
• indica una diferencia significativa.
Contraste Múltiple de Rangos para DIAMETRO según AISLAMIENTO ----------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey AISLAMIENTO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- MANGO-CA 9 17,6667 1,74978 X LULO-CA 9 26,0 1,74978 XX GRAN-CA 9 27,3333 1,74978 XX LULO-CG 9 29,3333 1,74978 XXX TOAM-CG 9 31,0 1,74978 XXX TOAM-CA 9 33,0 1,74978 XXXX TOMR-CA 9 35,0 1,74978 XXX MANGO-CG 9 36,6667 1,74978 XX GRAN-CG 9 40,6667 1,74978 X TOMR-CG 9 52,3333 1,74978 X MORA-CA 9 56,6667 1,74978 X
102
MORA-CG 9 90,0 1,74978 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA - GRAN-CG *-13,3333 8,35847 GRAN-CA - MANGO-CA *9,66667 8,35847 GRAN-CA - MANGO-CG *-9,33333 8,35847 GRAN-CA - MORA-CA *-29,3333 8,35847 GRAN-CA - MORA-CG *-62,6667 8,35847 GRAN-CA - TOMR-CG *-25,0 8,35847 GRAN-CG - LULO-CA *14,6667 8,35847 GRAN-CG - LULO-CG *11,3333 8,35847 GRAN-CG - MANGO-CA *23,0 8,35847 GRAN-CG - MORA-CA *-16,0 8,35847 GRAN-CG - MORA-CG *-49,3333 8,35847 GRAN-CG - TOAM-CG *9,66667 8,35847 GRAN-CG - TOMR-CG *-11,6667 8,35847 LULO-CA - MANGO-CG *-10,6667 8,35847 LULO-CA - MORA-CA *-30,6667 8,35847 LULO-CA - MORA-CG *-64,0 8,35847 LULO-CA - TOMR-CA *-9,0 8,35847 LULO-CA - TOMR-CG *-26,3333 8,35847 LULO-CG - MANGO-CA *11,6667 8,35847 LULO-CG - MORA-CA *-27,3333 8,35847 LULO-CG - MORA-CG *-60,6667 8,35847 LULO-CG - TOMR-CG *-23,0 8,35847 MANGO-CA - MANGO-CG *-19,0 8,35847 MANGO-CA - MORA-CA *-39,0 8,35847 MANGO-CA - MORA-CG *-72,3333 8,35847 MANGO-CA - TOAM-CA *-15,3333 8,35847 MANGO-CA - TOAM-CG *-13,3333 8,35847 MANGO-CA - TOMR-CA *-17,3333 8,35847 MANGO-CA - TOMR-CG *-34,6667 8,35847 MANGO-CG - MORA-CA *-20,0 8,35847 MANGO-CG - MORA-CG *-53,3333 8,35847 MANGO-CG - TOMR-CG *-15,6667 8,35847 MORA-CA - MORA-CG *-33,3333 8,35847 MORA-CA - TOAM-CA *23,6667 8,35847 MORA-CA - TOAM-CG *25,6667 8,35847 MORA-CA - TOMR-CA *21,6667 8,35847 MORA-CG - TOAM-CA *57,0 8,35847 MORA-CG - TOAM-CG *59,0 8,35847 MORA-CG - TOMR-CA *55,0 8,35847 MORA-CG - TOMR-CG *37,6667 8,35847 TOAM-CA - TOMR-CG *-19,3333 8,35847 TOAM-CG - TOMR-CG *-21,3333 8,35847 TOMR-CA - TOMR-CG *-17,3333 8,35847 --------------------------------------------------------------------------------
* indica una diferencia significativa.
103
ANEXO 5. Tasa de crecimiento para los diferentes aislamientos bajo 20, 25 y 28ºC
20ºC
(mm/día)
25ºC
(mm/día)
28ºC
(mm/día)
GRAN-CG 8,67 6,3 5,33
GRAN-CA 5,67 4,67 3,33
LULO-CG 6,33 5,33 2
LULO-CA 6,33 3,67 1,83
MANGO-CG 11,33 12,67 15
MANGO-CA 4,33 7,33 11,67
MORA-CG 8,67 3,83 3,33
MORA-CA 4,5 3,83 1,67
TOAM-CG 7,5 6,33 1,67
TOAM-CA 6,67 5,67 4,17
TOMR-CG 13,33 11,33 1,5
TOMR-CA 7,67 6 3,33
104
ANEXO 6. Forma de las conidias
Análisis de la Varianza para FORMA - Sumas de Cuadrados de Tipo III -------------------------------------------------------------------------------- Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor -------------------------------------------------------------------------------- EFECTOS PRINCIPALES A:TEMP 0,760924 2 0,380462 1,39 0,2499 B:AISLAMIENTOS 478,439 11 43,4945 158,66 0,0000 INTERACCIONES AB 8,46766 22 0,384894 1,40 0,1006 RESIDUOS 444,916 1624 0,274132 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORREGIDO) 936,177 1659 -------------------------------------------------------------------------------- Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
Contraste Múltiple de Rangos para FORMA según TEMP -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey TEMP Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- 3 548 2,1411 0,0231729 X 1 562 2,16162 0,0225464 X 2 549 2,19514 0,0231562 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -0,0335173 0,0758125 1 - 3 0,0205218 0,0758407 2 - 3 0,0540391 0,076845 -------------------------------------------------------------------------------- * indica una diferencia significativa.
Contraste Múltiple de Rangos para FORMA según AISLAMIENTOS -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey AISLAMIENTOS Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CG 150 1,20667 0,0427498 X MORA-CG 85 1,55593 0,0579783 X MANGO-CG 75 1,58667 0,0604574 X TOAM-CG 150 1,88667 0,0427498 X LULO-CG 150 1,89333 0,0427498 X TOMR-CG 150 1,90667 0,0427498 X MORA-CA 149 2,38218 0,042895 X GRAN-CA 150 2,52 0,0427498 XX LULO-CA 150 2,56667 0,0427498 XX MANGO-CA 150 2,65333 0,0427498 XX TOAM-CA 150 2,84 0,0427498 XX TOMR-CA 150 2,99333 0,0427498 X ------------------------------------------------------------------------ Contraste Diferencias +/- Límites ---------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA - GRAN-CG *1,31333 0,197869 GRAN-CA - LULO-CG *0,626667 0,197869 GRAN-CA - MANGO-CG *0,933333 0,242339 GRAN-CA - MORA-CG *0,964069 0,23576
105
GRAN-CA - TOAM-CA *-0,32 0,197869 GRAN-CA - TOAM-CG *0,633333 0,197869 GRAN-CA - TOMR-CA *-0,473333 0,197869 GRAN-CA - TOMR-CG *0,613333 0,197869 GRAN-CG - LULO-CA *-1,36 0,197869 GRAN-CG - LULO-CG *-0,686667 0,197869 GRAN-CG - MANGO-CA *-1,44667 0,197869 GRAN-CG - MANGO-CG *-0,38 0,242339 GRAN-CG - MORA-CA *-1,17551 0,198205 GRAN-CG - MORA-CG *-0,349264 0,23576 GRAN-CG - TOAM-CA *-1,63333 0,197869 GRAN-CG - TOAM-CG *-0,68 0,197869 GRAN-CG - TOMR-CA *-1,78667 0,197869 GRAN-CG - TOMR-CG *-0,7 0,197869 LULO-CA - LULO-CG *0,673333 0,197869 LULO-CA - MANGO-CG *0,98 0,242339 LULO-CA - MORA-CG *1,01074 0,23576 LULO-CA - TOAM-CA *-0,273333 0,197869 LULO-CA - TOAM-CG *0,68 0,197869 LULO-CA - TOMR-CA *-0,426667 0,197869 LULO-CA - TOMR-CG *0,66 0,197869 LULO-CG - MANGO-CA *-0,76 0,197869 LULO-CG - MANGO-CG *0,306667 0,242339 LULO-CG - MORA-CA *-0,488844 0,198205 LULO-CG - MORA-CG *0,337402 0,23576 LULO-CG - TOAM-CA *-0,946667 0,197869 LULO-CG - TOMR-CA *-1,1 0,197869 MANGO-CA - MANGO-CG *1,06667 0,242339 MANGO-CA - MORA-CA *0,271156 0,198205 MANGO-CA - MORA-CG *1,0974 0,23576 MANGO-CA - TOAM-CG *0,766667 0,197869 MANGO-CA - TOMR-CA *-0,34 0,197869 MANGO-CA - TOMR-CG *0,746667 0,197869 MANGO-CG - MORA-CA *-0,79551 0,242613 MANGO-CG - TOAM-CA *-1,25333 0,242339 MANGO-CG - TOAM-CG *-0,3 0,242339 MANGO-CG - TOMR-CA *-1,40667 0,242339 MANGO-CG - TOMR-CG *-0,32 0,242339 MORA-CA - MORA-CG *0,826246 0,236043 MORA-CA - TOAM-CA *-0,457823 0,198205 MORA-CA - TOAM-CG *0,49551 0,198205 MORA-CA - TOMR-CA *-0,611156 0,198205 MORA-CA - TOMR-CG *0,47551 0,198205 MORA-CG - TOAM-CA *-1,28407 0,23576 MORA-CG - TOAM-CG *-0,330736 0,23576 MORA-CG - TOMR-CA *-1,4374 0,23576 MORA-CG - TOMR-CG *-0,350736 0,23576 TOAM-CA - TOAM-CG *0,953333 0,197869 TOAM-CA - TOMR-CG *0,933333 0,197869 TOAM-CG - TOMR-CA *-1,10667 0,197869 TOMR-CA - TOMR-CG *1,08667 0,197869 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.
106
ANEXO 7. Estadística para el largo de las conidias Análisis de la Varianza para LARGO - Sumas de Cuadrados de Tipo III -------------------------------------------------------------------------------- Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor -------------------------------------------------------------------------------- EFECTOS PRINCIPALES A:AISLA 700,098 11 63,6453 12,86 0,0000 B:TEMP 3,86223 2 1,93111 0,39 0,6770 INTERACCIONES AB 126,337 22 5,74257 1,16 0,2747 RESIDUOS 8038,91 1624 4,95007 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORREGIDO) 8869,17 1659
Contraste Múltiple de Rangos para LARGO según TEMP -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey TEMP Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- 1 562 12,5463 0,0958081 X 3 549 12,5542 0,0983993 X 2 549 12,6559 0,0983993 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -0,109619 0,322156 1 - 3 -0,00795233 0,322156 2 - 3 0,101667 0,326425 -------------------------------------------------------------------------------- * indica una diferencia significativa.
Contraste Múltiple de Rangos para LARGO según AISLA -------------------------------------------------------------------------------- Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey AISLA Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA 150 11,4833 0,18166 X MANGO-CA 150 11,7167 0,18166 XX TOMR-CA 150 12,1667 0,18166 XXX TOMR-CG 150 12,2467 0,18166 XXX TOAM-CG 150 12,2633 0,18166 XXX TOAM-CA 150 12,3167 0,18166 XXX LULO-CA 150 12,5333 0,18166 XXX LULO-CG 150 12,6 0,18166 XX MORA-CG 85 12,9824 0,246372 XXX MORA-CA 150 13,3 0,18166 XX GRAN-CG 150 13,45 0,18166 X MANGO-CG 75 13,9667 0,256906 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA - GRAN-CG *-1,96667 0,840819 GRAN-CA - LULO-CA *-1,05 0,840819 GRAN-CA - LULO-CG *-1,11667 0,840819 GRAN-CA - MANGO-CG *-2,48333 1,02979 GRAN-CA - MORA-CA *-1,81667 0,840819
107
GRAN-CG - LULO-CA *0,916667 0,840819 GRAN-CG - LULO-CG *0,85 0,840819 GRAN-CG - MANGO-CA *1,73333 0,840819 GRAN-CG - TOAM-CA *1,13333 0,840819 GRAN-CG - TOAM-CG *1,18667 0,840819 GRAN-CG - TOMR-CA *1,28333 0,840819 GRAN-CG - TOMR-CG *1,20333 0,840819 LULO-CA - MANGO-CG *-1,43333 1,02979 LULO-CG - MANGO-CA *0,883333 0,840819 LULO-CG - MANGO-CG *-1,36667 1,02979 MANGO-CA - MANGO-CG *-2,25 1,02979 MANGO-CA - MORA-CA *-1,58333 0,840819 MANGO-CA - MORA-CG *-1,26569 1,00183 MANGO-CG - TOAM-CA *1,65 1,02979 MANGO-CG - TOAM-CG *1,70333 1,02979 MANGO-CG - TOMR-CA *1,8 1,02979 MANGO-CG - TOMR-CG *1,72 1,02979 MORA-CA - TOAM-CA *0,983333 0,840819 MORA-CA - TOAM-CG *1,03667 0,840819 MORA-CA - TOMR-CA *1,13333 0,840819 MORA-CA - TOMR-CG *1,05333 0,840819 -------------------------------------------------------------------------------- * indica una diferencia significativa.
108
ANEXO 8. Estadística para el ancho de las conidias Análisis de la Varianza para ANCHO - Sumas de Cuadrados de Tipo III -------------------------------------------------------------------------------- Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor -------------------------------------------------------------------------------- EFECTOS PRINCIPALES A:AISLAMIENTO 766,361 11 69,6692 63,82 0,0000 B:TEMPERATURA 16,1943 2 8,09714 7,42 0,0006 INTERACCIONES AB 25,9127 22 1,17785 1,08 0,3625 RESIDUOS 1772,75 1624 1,09159 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORREGIDO) 2585,64 1659
Contraste Múltiple de Rangos para ANCHO según TEMPERATURA --------------------------------------------------------------------------------
Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey TEMPERATURA Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos -------------------------------------------------------------------------------- 3 549 3,61074 0,046208 X 1 562 3,62506 0,0449911 X 2 549 3,83474 0,046208 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-0,209673 0,151283 1 - 3 0,014327 0,151283 2 - 3 *0,224 0,153288 --------------------------------------------------------------------------------
* indica una diferencia significativa.
Contraste Múltiple de Rangos para ANCHO según AISLAMIENTO ----------------------------------------------------------------------------
-
Método: 95,0 porcentaje HSD de Tukey
AISLAMIENTO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
----------------------------------------------------------------------------
----
MORA-CA 150 2,73333 0,0853071 X GRAN-CA 150 2,97 0,0853071 XX LULO-CA 150 2,98333 0,0853071 XX MANGO-CA 150 3,2 0,0853071 XX TOMR-CA 150 3,3 0,0853071 XX LULO-CG 150 3,43333 0,0853071 XX TOAM-CA 150 3,7 0,0853071 XX TOAM-CG 150 3,86667 0,0853071 XX TOMR-CG 150 3,9 0,0853071 XX MORA-CG 85 4,26614 0,115695 X MANGO-CG 75 4,89733 0,120642 X GRAN-CG 150 5,032 0,0853071 X -------------------------------------------------------------------------------- Contraste Diferencias +/- Límites
109
-------------------------------------------------------------------------------- GRAN-CA - GRAN-CG *-2,062 0,394846 GRAN-CA - LULO-CG *-0,463333 0,394846 GRAN-CA - MANGO-CG *-1,92733 0,483585 GRAN-CA - MORA-CG *-1,29614 0,470458 GRAN-CA - TOAM-CA *-0,73 0,394846 GRAN-CA - TOAM-CG *-0,896667 0,394846 GRAN-CA - TOMR-CG *-0,93 0,394846 GRAN-CG - LULO-CA *2,04867 0,394846 GRAN-CG - LULO-CG *1,59867 0,394846 GRAN-CG - MANGO-CA *1,832 0,394846 GRAN-CG - MORA-CA *2,29867 0,394846 GRAN-CG - MORA-CG *0,765859 0,470458 GRAN-CG - TOAM-CA *1,332 0,394846 GRAN-CG - TOAM-CG *1,16533 0,394846 GRAN-CG - TOMR-CA *1,732 0,394846 GRAN-CG - TOMR-CG *1,132 0,394846 LULO-CA - LULO-CG *-0,45 0,394846 LULO-CA - MANGO-CG *-1,914 0,483585 LULO-CA - MORA-CG *-1,28281 0,470458 LULO-CA - TOAM-CA *-0,716667 0,394846 LULO-CA - TOAM-CG *-0,883333 0,394846 LULO-CA - TOMR-CG *-0,916667 0,394846 LULO-CG - MANGO-CG *-1,464 0,483585 LULO-CG - MORA-CA *0,7 0,394846 LULO-CG - MORA-CG *-0,832808 0,470458 LULO-CG - TOAM-CG *-0,433333 0,394846 LULO-CG - TOMR-CG *-0,466667 0,394846 MANGO-CA - MANGO-CG *-1,69733 0,483585 MANGO-CA - MORA-CA *0,466667 0,394846 MANGO-CA - MORA-CG *-1,06614 0,470458 MANGO-CA - TOAM-CA *-0,5 0,394846 MANGO-CA - TOAM-CG *-0,666667 0,394846 MANGO-CA - TOMR-CG *-0,7 0,394846 MANGO-CG - MORA-CA *2,164 0,483585 MANGO-CG - MORA-CG *0,631192 0,547067 MANGO-CG - TOAM-CA *1,19733 0,483585 MANGO-CG - TOAM-CG *1,03067 0,483585 MANGO-CG - TOMR-CA *1,59733 0,483585 MANGO-CG - TOMR-CG *0,997333 0,483585 MORA-CA - MORA-CG *-1,53281 0,470458 MORA-CA - TOAM-CA *-0,966667 0,394846 MORA-CA - TOAM-CG *-1,13333 0,394846 MORA-CA - TOMR-CA *-0,566667 0,394846 MORA-CA - TOMR-CG *-1,16667 0,394846 MORA-CG - TOAM-CA *0,566141 0,470458 MORA-CG - TOMR-CA *0,966141 0,470458 TOAM-CA - TOMR-CA *0,4 0,394846 TOAM-CG - TOMR-CA *0,566667 0,394846 TOMR-CA - TOMR-CG *-0,6 0,394846 ----------------------------------------------------------------------------
* indica una diferencia significativa.
110
ANEXO 9. Tamaño de las conidias en temperaturas de 20, 25 y 28ºC
20ºC 25ºC 28ºC
Aislamientos Largo (µm) Ancho (µm) Largo (µm) Ancho (µm) Largo (µm) Ancho (µm)
GRAN-CA 17,5-10 2,5-5 17,5-10 2,5-5 17,5-10 2,5-5
GRAN-CG 15-12,5 5 17,5-10 7,5-5 15-10 5
LULO-CA 15-12,5 2,5-5 17,5-10 2,5-5 17,5-10 2,5-5
LULO-CG 15-12,5 2,5-5 17,5-10 2,5-5 15-10 2,5-5
MANGO-CA 15-7,5 2,5-5 15 -10 2,5-5 15 - 10 2,5-5
MANGO-CG 15-12,5 2,5-5 15-12,5 5 17,5-12,5 2,5-5
MORA-CA 15-10 2,5-5 15 -10 2,5-5 15 -10 2,5-5
MORA-CG 17,5-10 2,5-5 25-10 2,5-5 17,5 -10 2,5-5
TOAM-CA 15-10 2,5-5 20 -10 2,5-5 25 -10 2,5-5
TOAM-CG 15-10 2,5-5 16 -10 2,5-5 17,5 -7,5 2,5-5
TOMR-CA 12,5-10 2,5-5 12,5-10 2,5-5 15 -10 2,5-5
TOMR-CG 15-10 2,5-5 17,5-10 2,5-5 17,5-7,5 2,5-5
111
ANEXO 10. Prueba de Benomyl para diferenciar entre C. acutatum y C.gloeosporioides
CONTROL 1g/L 1,5g/L
GRAN-CG 1 0 0
GRAN-CA 1 1 1
LULO-CG 1 1 1
LULO-CA 1 0 0
MANGO-CG 1 0 0
MANGO-CA 1 1 1
MORA-CG 1 0 0
MORA-CA 1 1 0
TOAM-CG 1 0 0
TOAM-CA 1 1 1
TOMR-CG 1 1 1
TOMR-CA 1 1 1
0 : Inhibición en el crecimiento micelial
1: Crecimiento del microorganismo
112
ANEXO 11. Prueba de la proteasa en 5 repeticiones
AISLAMIENTOS 1 2 3 4 5
GRAN-CG - - - - -
GRAN-CA + + + + +
LULO-CG + + + + +
LULO-CA - - - - -
MANGO-CG - - - - -
MANGO-CA + + + + +
MORA-CG - - - - -
MORA-CA + + + + -
TOAM-CG - - - - -
TOAM-CA + + + + +
TOMR-CG + + + + -
TOMR-CA + + + + +
La respuesta positiva es una característica que presenta C. acutatum
La respuesta negativa es una característica de C.gloeosporioides
113
ANEXO 12. Pruebas de potencial de patogenicidad cruzada
1. Agar con crecimiento micelial sobre herida
2. Inóculo de conidias aplicado sobre el fruto sin realizar heridas
3. Inóculo de conidias sobre heridas
4. Agar con crecimiento micelial sobre el fruto sin realizar heridas
AISLAMIENTOS
GRANADILLA LULO
TALLOS
MORA MANGO
TOMATE
AMARILLO
TOMATE
ROJO
GRAN-CG 1-3 X X 1-4 1-3 1-3
GRAN-CA 1-3 1-3-4 1-3 1-2-3-4 1-3 1-3
LULO-CG 1-3-4 1-3 X 1-3-4 1-3 1-3
LULO-CA 1-3-4 1-3 1-3 1-2-3-4 1-3 1-3
MANGO-CG X 1 X 1-2-3-4 1-3 1
MANGO-CA X X 1-3 1-2-3-4 1-3 X
MORA-CG X X 1-3 1-2-3-4 1-3 1-3
MORA-CA 1-3 X 1-3 1-2-3-4 1-3 1-3
TOAM-CG 1-3 1-3 X 1-2-3-4 1-3 1-3
TOAM-CA X X x 1-2-3-4 1-3 1-3
TOMR-CG 1-3 1-3 X 1-2-3-4 1-3 1-3
TOMR-CA X x x 1-2-3-4 1-3 1-3
114
ANEXO 13. Presencia de síntomas iniciales de antracnosis en los tratamientos de patogenicidad cruzada.
1. Agar con crecimiento micelial sobre heridas ocasionadas con aguja de
disección
2. Inóculo de conidias aplicado sobre el fruto sin realizar heridas
AISLAMIENTOS GRANADILLA LULO
TALLOS
MORA MANGO
TOMATE
AMARILLO
TOMATE
ROJO
GRAN-CG 7 días X X X 8 día 7 día
GRAN-CA 7 días 4 día 11 día 4 día 5 día 9 día
LULO-CG 8 día 7 día X 5 día 7 día 10 día
LULO-CA 9 días 7 día 11 día 5 día 10 día 8 día
MANGO-CG X X X 4 día 9 día X
MANGO-CA X 8 día 13 día 4 día 8 día X
MORA-CG X X 10 día 6 día 10 día 9 día
MORA-CA 10 días X 10 día 5 día 9 día 10 día
TOAM-CG 8 días 10 día X 4 día 7 día 8 día
TOAM-CA X X 4 día 7 día 8 día
TOMR-CG 9 días 8 día X 6 día 7 día 8 día
TOMR-CA X x X 5 día 6 día 7 día
AISLAMIENTOS GRANADILLA LULO
TALLOS
MORA MANGO
TOMATE
AMARILLO
TOMATE
ROJO
GRAN-CG 8 días X X 5 día 8 día 8 día
GRAN-CA 7 días 5 día 10 día 5 día 8 día 9 día
LULO-CG 8 día 8 día X 4 día 8 día 10 día
LULO-CA 9 días 7 día 12 día 5 día 8 día 8 día
MANGO-CG X 10 día X 4 día 8 día 10 día
MANGO-CA X 9 día 13 día 4 día 8 día X
MORA-CG X X 11 día 5 día 10 día 9 día
MORA-CA 10 días X 10 día 5 día 9 día 10 día
TOAM-CG 10 días 10 día X 4 día 6 día 8 día
TOAM-CA X X 4 día 7 día 7 día
TOMR-CG 9 días 8 día X 6 día 8 día 8 día
TOMR-CA X x X 5 día 8 día 7 día
115
3. Inóculo de conidias sobre heridas.
4. Agar con crecimiento micelial sobre el fruto sin realizar heridas
AISLAMIENTOS GRANADILLA LULO
TALLOS
MORA MANGO
TOMATE
AMARILLO
TOMATE
ROJO
GRAN-CG X X X X X X
GRAN-CA X 9 día X 6 día X X
LULO-CG 9 día X X X X X
LULO-CA 10 día X X 7 día X X
MANGO-CG X X X 6 día X X
MANGO-CA X X X 6 día X X
MORA-CG X X X 6 día X X
MORA-CA X X X 5 día X X
TOAM-CG X X X 5 día X X
TOAM-CA X X X 5 día X X
TOMR-CG X X X 6 día X X
TOMR-CA X X X 5 día X X
AISLAMIENTOS GRANADILLA LULO
TALLOS
MORA MANGO
TOMATE
AMARILLO
TOMATE
ROJO
GRAN-CG X X X X X X
GRAN-CA X X X 6 día X X
LULO-CG X X X 6 día X X
LULO-CA X X X 7 día X X
MANGO-CG X X X 7 día X X
MANGO-CA X X X 7 día X X
MORA-CG X X X 6 día X X
MORA-CA X X X 4 día X X
TOAM-CG X X X 5 día X X
TOAM-CA X X X 6 día X X
TOMR-CG X X X 6 día X X
TOMR-CA X X X 5 día X X
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