bioquimica farmacia de autores: biblioteca
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS II
“Tamizaje fitoquímico y efecto antifúngico in vitro del extracto
hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes (amancay) frente a Candida
albicans”
PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:
BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA
AUTORES:
ROJAS ONTANEDA, Leslie Jenifer
ASESORA:
Dra. SOTO VÁSQUEZ, Marilú Roxana
TRUJILLO – PERÚ
2019
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Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
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A Dios, por guiar cada uno de mis pasos y
mantener mi camino firme y lleno de
bendiciones.
A mis padres, Miguel y Luz, por ser
modelos de responsabilidad y
esfuerzo y adentrar en mí estos
valores. Por la confianza depositada
y el apoyo incondicional otorgado en
cada etapa de mi vida.
A mi hermano Miguel, mi más grande motivo
para avanzar día a día hacia mis metas y poder
así, guiarlo hacia las suyas.
A mi sobrina Luciana, a mi abuela
Esther y a mi tía Mary, por ser una
fuente de inspiración y fortaleza en
mi camino.
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AGRADECIMIENTO.
Mi más profundo y especial agradecimiento a mi asesora Marilú Roxana Soto Vásquez,
quien con su paciencia y conocimiento me ha sabido orientar a lo largo de este camino.
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ÍNDICE
JURADO DICTAMINADOR ii
DEDICATORIA iii
AGRADECIMIENTO iv
PRESENTACIÓN v
RESUMEN vi
ABSTRACT vii
INTRODUCCIÓN 1
MATERIAL Y MÉTODO 8
RESULTADOS 21
DISCUSIÓN 26
CONCLUSIÓN 30
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 31
ANEXOS 34
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RESUMEN
El presente trabajo de investigación, tuvo como objetivo realizar el tamizaje fitoquímico,
y evaluar el efecto in vitro del extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes
(Amancay) frente a Candida albicans.
Se obtuvo el extracto hidroetanólico mediante soxhlet de 30 g de bulbos de Ismene
amancaes (amancay) procedente del distrito de Otuzco, provincia de Otuzco,
departamento de La Libertad. Se realizó el tamizaje fitoquímico preliminar mediante el
método de Martinez y Cuéllar. El extracto hidroetanólico se fraccionó en extracto
clorofórmico, etanólico y acuoso, en los cuales se realizaron los diferentes ensayos
fitoquímicos. Finalmente se determinó el efecto antifúngico del extracto hidroetanólico
de Ismene amancaes “amancay” mediante el método de difusión en discos – Kirby &
Bauer a concentraciones de 0.05 g/ml, 0.10 g/ml, 0.15 g/ml, 0.30 g/ml y 0.5 g/ml frente a
Candida albicans. En la fracción clorofórmica de bulbos de Ismene amancaes se
identificaron cualitativamente triterpenos-esteroides. En la fracción etanólica de bulbos
de Ismene amancaes se identificaron cualitativamente compuestos fenólicos, alcaloides,
aminoácidos, flavonoides, catequinas y resinas, y en la fracción acuosa de de Ismene
amancaes se identificaron cualitativamente alcaloides y saponinas. El extracto
hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes “amancay” presentó a concentraciones de
0.15 g/ml, 0.30 g/ml y 0.5 g/ml halos de inhibición, con valores promedios de 14.67 mm
± 2.5, 25.42 mm ± 1.62, 28.75 mm ± 3.11 respectivamente. Siendo sensible frente a
Candida albicans.
La concentración minima antifúngica del extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene
amancaes fue de 0.5 g/ml, frente a Candida albicans.
PALABRAS CLAVES: Tamizaje fitoquímico, Ismene amancaes, efecto antifúngico,
Candida albicans, in vitro.
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ABSTRACT
The objective of this research work was to carry out phytochemical screening, and to
evaluate the in vitro effect of the hydroetanolic extract of bulbs of Ismene amancaes
(Amancay) against Candida albicans.
The hydroethanolic extract was obtained by means of 30 g of bulbs from Ismene
amancaes (amancay), the district of Otuzco, province of Otuzco, department of La
Libertad. Preliminary phytochemical screening was performed using the Martínez and
Cuéllar method. The hydroethanolic extract was fractionated in the chloroform, ethanolic
and aqueous extract, and in which the different phytochemical tests were carried out.
Finally the antifungal effect of the hydroquinhanolic extract of Ismene amancaes
"amancay" was determined by means of the diffusion method in nightclubs - Kirby &
Bauer at a rate of 0.05 g / ml, 0.10 g / ml, 0.15 g / ml, 0.30 g / ml and 0.5 g / ml against
candida albicans. In the chloroformic fraction of bulbs of Ismene amancaes, triterpene-
steroids are qualitatively identified. Phenolic compounds, alkaloids, amino acids,
flavonoids, catechins and resins were qualitatively identified, and in the proportion of
Ismene amancaes, alkaloids and saponins were qualitatively identified. The
hydroethanolic extract of bulbs of Ismene amancaes "amancay" presented at
concentrations of 0.15 g / ml, 0.30 g / ml and 0.5 g / ml halos of inhibition, with average
values of 14.67 mm ± 2.5, 25.42 mm ± 1.62, 28.75 mm ± 3.11 respectively. Being
sensitive to Candida albicans.
The minimum antifungal concentration of the hydroethanolic extract of Ismene amancaes
bulbs was 0.5 g / ml, compared to Candida albicans.
KEY WORDS: Phytochemical screening, Ismene amancaes, antifungal effect, Candida
albicans, in vitro.
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I.- INTRODUCCIÓN
Las micosis invasoras son cada vez más frecuentes en la práctica clínica, afectando
especialmente a sujetos con grados variables de inmunocompromiso, por causas como
infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y enfermedades
hematológicas malignas. Además, se presentan en forma secundaria a tratamientos
agresivos como cirugía mayor, terapia anti retroviral, quimioterapia, trasplante de
precursores hematopoyéticos y tratamientos antimicrobianos de amplio espectro.1
La sepsis producida por hongos, principalmente por especies del género Candida spp. se
ha transformado en un problema creciente en servicios de salud, pues su incidencia se ha
Incrementado en un 40% entre los años 1980 y 1990. Actualmente corresponde a la cuarta
causa de sepsis a nivel nosocomial en hospitales complejos, desplazando en parte a
Staphylococcus coagulasa negativo, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. 2
Los hongos son microorganismos muy ubicuos; se encuentran diseminados en el suelo,
aire, agua y seres vivos, sobre todo en los vegetales. Solo unas 175 especies, de las más
de 500.000 clasificadas hasta la fecha, son capaces de producir enfermedades en el
hombre. Además de sobrevivir y crecer a la temperatura del cuerpo humano, los hongos
que producen enfermedad en el hombre deben vencer los mecanismos de defensa del
huésped y esto se da en muy pocas ocasiones. Candida albicans es la especie más
virulenta, y constituye el agente principal en las infecciones micóticas humanas.1, 3
Dentro del género Candida está la especie Candida albicans que es un comensal común
en las membranas de las mucosas de la boca, el intestino y la vagina de individuos sanos,
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pero puede invadir localmente, En casos extremos, puede crecer sistemáticamente y
causar la muerte después de colonizar la sangre a través de un catéter intravenoso, en el
cual las células de levadura se adhieren.3
Candida albicans contiene en su pared celular manano, quitina, proteínas, lípidos y
carbohidrato, los cuales son importantes en los procesos de adherencia al epitelio antes
de invadirlo, además con la obtención de ácidos carboxílicos de cadena corta, producto
del metabolismo de los azúcares logra un ambiente ácido óptimo para su crecimiento. El
componente antigénico es una glicoproteína que se encuentra en la pared celular, que
asociado a la producción de fosfolipasas capaces de destruir la membrana celular del
hospedero y proteinasas que ejercen un efecto sobre la superficie celular, juegan un papel
importante en la fase inicial de las infecciones en mucosas.4
El equilibrio entre la infección, la colonización y la eliminación depende de la capacidad
de las cepas de Candida para modular la expresión de factores de virulencia en la
respuesta a los cambios del medio ambiente, combinado con la competencia del sistema
inmune del huésped.3
Los principales factores de patogenicidad de Candida albicans son: switch fenotípico
(cambio morfológico entre levadura, formación de hifas y pseudohifas), secreción
enzimática, expresión diferencial de genes en respuesta al ambiente, síntesis de adhesinas
y su capacidad para formar biopelículas, las que contribuyen a la generación de resistencia
a los antifungicos.5
La formación de una biopelícula también es muy favorable para esta levadura, ya que le
permite resistir la acción limpiadora del flujo salival y de las moléculas de defensa del
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hospedero, además de brindar mayor resistencia a antifúngicos como el fluconazol, sobre
todo si esta biopelícula está compuesta también por bacterias. Se ha descrito que las
células fúngicas modulan la acción de antibióticos y a su vez las bacterias afectan la
actividad de agentes antifúngicos en biopelículas mixtas.6
Los protocolos actuales de tratamiento de la candidiasis son estándar, se aplican de igual
modo a todos los pacientes que presenten la condición. Comúnmente el tratamiento
comprende la administración de antifúngicos orales como nistatina o diversos azoles,
entre ellos, el fluconazol. La toxicidad presenta una diferencia importante entre los dos
grupos de azoles, debido a su selectividad. En consecuencia, los imidazoles son más
tóxicos.5, 7
Es por esta razón que la gente en países como el nuestro, busca nuevas alternativas y
prefiere muchas veces el tratamiento de sus afecciones con plantas medicinales, el uso
de las plantas medicinales se remonta a la época prehistórica en la mayoría de las culturas
conocidas. Gracias a sus infinitos conocimientos tradicionales, esta industria ancestral
persiste en el equilibrio del bienestar integral tanto de los pacientes como de los
practicantes.8
La familia Amarilidácea, la componen alrededor de 60 géneros, los cuales están ubicados
fundamentalmente en el sureste de África y en América del Sur, con gran cantidad de
especies apreciadas por su valor desde el punto de vista ornamental. Ciertamente esta
familia es muy afín con la Liliácea, pero se diferencia por la posición del ovario.9
Una característica particular de las amarilidáceas es la presencia de un grupo de alcaloides
isoquinolínicos. Su característica común es la presencia de un sistema de anillos
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compuesto por una unidad C6-C1 derivada del aminoácido fenilalanina y una unidad N-
C2-C6 derivada del aminoácido tirosina. Los subgrupos más conocidos incluyen los del
tipo licorina, galantamina, tazzetina, crinina y narciclasina. 10
La licorina tiene propiedades antineoplásica, antivírica dosis dependiente sobre el virus
Polio I, Coxsackie y Herpes simple; antiprotozoaria sobre P. caudatum. Inmunosupresor
útil en prevención de rechazos a trasplantes y tratamientos en alergias. Inhibidor potente
de la biosíntesis del ácido ascórbico así como también del crecimiento y división celular
en líneas celulares humanas y animales.10
La Narciclasina tiene propiedades antineoplásicas frente al glioblastoma multiforme
humano (GBM) en modelos animales preclínicos. Este tipo de tumor se caracteriza por
invasión agresiva de tejidos cerebrales normales y resistencia a las terapias
convencionales que desencadenan la apoptosis. Narciclasina tiene la habilidad de cruzar
la barrera hematoencefálica.10
La galantamina actúa como inhibidor de la acetilcolinesterasa selectivo, competitivo y
rápidamente reversible que interacciona tanto con el sitio aniónico como con la cavidad
aromática de la enzima. Además, se ha demostrado que es un modulador alostérico del
receptor neuronal nicotínico de acetilcolina. 11
Los alcaloides amarilidáceos, bufanidrina y distichamina, presentan actividad
antibacterial de amplio espectro frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli y
Klebsiella pneumonia. Candimia y una serie de derivados de licorina han mostrado
importante actividad frente al parásito Trichomonas vaginalis.11
Ismene tiene 10-14 especies originarias de los Andes. En el Perú habitan 10 especies, de
ellas 8 son endémicas; destaca en el Norte de Perú I. amancaes. Ismene amancaes
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“amancay” es una planta bulbosa que se desarrolla en la costa central de Perú y es un
componente característico del ecosistema de Lomas. Su desarrollo es dependiente de la
humedad ambiental que se presenta en los meses de invierno.12,22
En la actualidad esta especie se encuentra reportado como Ismene amancaes en
“Catalogue of the Flowering Plants and Gymnosperms of Perú” (1993) de Brako &
Zarucchi. Se le ubica como división angiospermae, clase monocotiledónea, orden liliales,
familia amarilidácea. Se le conoce con los siguientes nombres vulgares: amanca,
amancaes, amancay, flor de amancaes, amancaes, janancai (y), jamanackai y lirio de
amancaes.13
Ismene amancaes es una hierba con bulbos blancos, hojas de color verde intenso y flores
terminales amarillas con interior verdoso. Florece una vez al año, naciendo entre piedras
y neblina, y tiene un tiempo de vida corto de 2 a 4 días. Posee semillas verdes que
germinan en la planta y posteriormente caen con raíz al suelo. Se le encuentra silvestre y
cultivada, y tiene usos cosméticos y medicinales.14
Hymenocallis amancaes (R. & P.) tiene uso medicinal para el tratamiento de contusiones
y músculos desgarrados, también se utiliza como ornamental y es el símbolo de la ciudad
capital de Lima, aunque se considera en peligro de extinción.15
En un estudio realizado en el 2016 en México, denominado “Micropropagación de
Hymenocallis harrisiana” que tuvo como autor a Mayra Flórez Alcántara, se demostró
que la planta H. littoralis, tiene propiedades contra Candida albicans. Se ha demostrado
que esta misma especie contiene varios alcaloides con propiedades medicinales que
pueden ser aislados del bulbo (licorina), que ha demostrado tener efectos antineoplásicos
y antivirales. Así mismo, se menciona que en el género Hymenocallis hay presencia de
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galantamina, un alcaloide que actualmente se comercializa para el tratamiento
sintomático de la enfermedad de Alzheimer.20.
Debido a que esta planta es muy poco estudiada y casi no se han encontrado trabajos
científicos y debido a la gran incidencia de infecciones fúngicas por el hongo Candida
albicans es que busca realizar este estudio en el cual se investiga los extractos
hidroetanólicos de Ismene amancaes en Candida albicans.
Por lo expuesto se plantea el siguiente problema:
¿El extracto hidroetanólico de los bulbos de Ismene amancaes (Amancay)
presentará efecto antifúngico frente a Candida albicans?
Postulándose la siguiente hipótesis:
Los fitoconstituyentes del extracto hidroetanólico de los bulbos de Ismene
amancaes (Amancay) presentan efecto antifúngico frente a Candida albicans.
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OBJETIVOS
Objetivo general:
Determinar los fitoconstituyentes y el efecto in vitro del extracto hidroetanólico
de los bulbos de Ismene amancaes (Amancay) frente a Candida albicans.
Objetivos específicos:
Realizar el tamizaje fitoquímico del extracto hidroetanólico de los
bulbos de Ismene amancaes (amancay).
Determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto
hidroetanólico de los bulbos de Ismene amancaes (amancay) frente a
Candida albicans.
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II. MATERIAL Y MÉTODO
MATERIAL:
1. Material botánico
- 1 kg de bulbos de Ismene amancaes (amancay), recolectadas del sector
Platanar, provincia de Otuzco.
2. Material microbiológico:
- Cándida albicans ATCC 90028
Proporcionada por el departamento de microbiología y parasitología de la
Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo
3. Material farmacológico
- Discos de sensibilidad: Fluconazol 25UI
4. Material de laboratorio
Materiales de vidrio de uso común en laboratorio
4.1. Equipos e instrumentos:
Balanza analítica OHAUS
Baño maría MEMMERT
Cocina eléctrica
Estufa MEMMERT
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Micropipeta BIOHIT
Refrigeradora ELECTROLUX
Autoclave
Horno
4.2. Reactivos:
Anhídrido acético
Acetato de sodio
Ácido clorhídrico
Ácido sulfúrico
Alcohol amílico
Amoníaco
Carbonato de sodio
Cloroformo
Cloruro de sodio
Cloruro de sodio (10%)
Hidróxido de potasio
Hidróxido de sodio
Magnesio metálico
Ninhidrina
Tricloruro férrico (5%)
Reactivo de Baljet
Reactivo Dragendorff
Reactivo de Fehling
Reactivo de Liebermann-Burchard
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Reactivo de Mayer
Reactivo de Wagner
Solución de gelatina (1%)
4.3. Solventes:
Diclorometano
Alcohol
Agua
4.4. Otros
Alcoholímetro
Algodón hidrófilo
Mascarillas
Guantes estériles
Papel de filtro Whatman Nº 01
Asa bacteriológica
Placas petri
Mechero de Bunsen
MÉTODO:
1. Recolección de la muestra:
La especie de Ismene amancaes se recolectó del Sector Platanar, distrito de Otuzco,
provincia de Otuzco, departamento de La Libertad. La recolección de la especie se realizó
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por el método convencional de herborización, se seleccionó el material en el campo y
verificó sus buenas condiciones.
2. Identificación y determinación taxonómica de la especie:
Se llevó un ejemplar de la planta al Herbarium Truxillense (HUT) para su identificación
y posterior verificación taxonómica según el sistema filogenético de la especie. (Código
de depósito anexo 1)
3. Preparación de la muestra17
Selección de la muestra: El material vegetal recolectado fue transportado al
laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la
Universidad Nacional de Trujillo, en donde se eliminó las sustancias extrañas
presentes en el material vegetal.
Lavado de la droga: Luego de la separación de las sustancias extrañas, se
procedió a lavar el material vegetal con agua destilada, seguido de una
desinfección utilizando hipoclorito de sodio a una concentración de 200 ppm
durante 5 minutos. Posteriormente se realizó un enjuague con suficiente agua
destilada estéril, esto fue para retirar los residuos de hipoclorito.
Secado: Una vez lavado los bulbos, se procedió a adecuar la droga en bolsas
de papel Kraft con orificios y se colocó en la estufa a una temperatura de 40 °C
y se realizó la determinación de peso cada 24 horas hasta valores constantes.
Pulverización: Una vez secado los bulbos, se pulverizaron con ayuda de un
mortero.
Tamizaje: El material obtenido de la pulverización, se pasó a través del
tamiz Nro 0.75
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Almacenamiento: El polvo de las hojas se guardó en frascos de vidrio de color
ámbar de boca ancha.
4. Preparación del extracto hidroetanólico18, 19
Se pesó 30 g de polvo tamizado de hojas de bulbos de Ismene amancaes previamente
pulverizadas y tamizadas. Luego se vertió en un cartucho de papel de filtro y se colocó
en el extractor del equipo de soxhlet y se extrajo con 250 mL de etanol de 70° G.L, usando
cocina con termostato para mantener la temperatura de 60°C a 80°C durante 4 horas. El
producto se filtró 3 veces, primero con papel filtro Whatman N°41, un segundo filtrado
se realizó con papel filtro Whatman N°4 y por último un tercer filtrado con papel
Whatman N°2; se obtuvo un extracto purificado libre de partículas. La solución resultante
se llevó a sequedad en un rotavapor a presión reducida y a una temperatura de 40°C, luego
se pesó el residuo seco y se guardó en refrigeración a 4°C en frasco de vidrio de color
ámbar. De este residuo seco se preparó las concentraciones 5, 10 y 15 mg/ml disueltas en
etanol 70° GL, respectivamente. Finalmente los extractos se guardaron en frascos de
vidrio de color ámbar estériles y en refrigeración (4 – 8 °C) hasta su utilización en el
ensayo antifúngico.
5. Tamizaje fitoquímico19
Se llevó a sequedad el extracto y se procedió a realizar el tamizaje fitoquímico preliminar
siguiendo el método de Martínez M. y Cuellar A.
Fundamento: De acuerdo con este método para la marcha fitoquímica o tamizaje
fitoquímico de Martínez M. y Cuellar A., cada muestra fue sometida a la acción extractiva
de solventes de polaridad creciente: cloroformo, etanol y agua, modificando el pH del
medio con el fin de obtener los metabolitos secundarios de acuerdo a su solubilidad.
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Luego se separó las fracciones y se realizó la identificación de los fitoconstituyentes
haciendo uso de reactivos de coloración y precipitación.
Método y Procedimiento:
En este caso se empleó un esquema general, en el cual se realizó la extracción sucesiva
del material vegetal para la aplicación de técnicas de tamizaje fitoquímico detallado en el
esquema I:
Ensayo de Catequinas: Para ello se tomó I gota de la solución alcohólica, con la
ayuda de un capilar y se aplicó sobre papel filtro. Sobre la mancha se aplicó solución
de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde carmelita a la luz UV, indica
un ensayo positivo.
Ensayo de Resinas: Para detectar este tipo de compuesto, se añadió a 2 ml de la
solución alcohólica, 10 ml de agua destilada. La aparición de un precipitado indica un
ensayo positivo.
Ensayo de Fehling: Permite reconocer en un extracto la presencia de azúcares
reductores. Para ello, si la alícuota del extracto no se encontrase en agua, debe
evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 a 2 ml de agua.
Se adicionaron 2 ml del reactivo y se calentó en baño de agua 5 a 10 minutos. El ensayo
se considera positivo si la solución se colorea de rojo o aparece precipitado rojo.
Ensayo de Baljet: Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos con
agrupamiento lactónico, en particular cumarinas, aunque otros compuestos lactónicos
pueden dar positivo al ensayo. Para ello, si la alícuota del extracto no se encontrase
en alcohol, debe evaporarse el solvente en baño de agua y redisolverse en la menor
cantidad de alcohol (1 ml). En estas condiciones se adicionó 1mL del reactivo,
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considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o precipitado rojo (++ y
+++) respectivamente.
Ensayo de Liebermann-Burchard: Permite reconocer en un extracto la presencia de
triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos de productos poseer un núcleo del
androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6.
Para ello, el solvente se evaporó en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1 ml de
cloroformo. Se adicionó 1 ml de anhídrido acético y se mezcló bien. Por la pared del
tubo de ensayo se dejó resbalar II a III gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar.
Un ensayo positivo se ha de reconocerse por un cambio rápido de coloración:
- Rosado-azul muy rápido.
- Verde intenso-visible aunque rápido.
- Verde oscuro-negro-final de la reacción.
Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio generalmente
ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos compuestos.
Importante: Para realizar este ensayo no hubo agua en el medio de reacción, pues ésta
con el ácido sulfúrico reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente.
La reacción de Liebermann-Burchard se emplea también para diferenciar las
estructuras esteroidales de los triterpenoides, las primeras producen coloraciones azul
o azul verdoso, mientras que para las segundas se observa rojo, rosado o púrpura. Estas
coloraciones pueden variar por interferencias producidas por carotenos, xantofilas y
esteroides saturados que puedan estar presentes.
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Ensayo de La Espuma: Permite reconocer en un extracto la presencia de saponinas,
tanto del tipo esteroidal como triterpénica. De modo que se diluyó en cinco veces su
volumen en agua y se agitó, dicha mezcla, fuertemente durante 5 a 10 minutos.
El ensayo se considera positivo si apareciese espuma en la superficie del líquido de
más de 2 mm de altura y persistente por más de 2 minutos.
Ensayo del Cloruro Férrico: Permite reconocer la presencia de compuestos fenólicos
y/o taninos en un extracto vegetal. Si el extracto de la planta se realiza con alcohol, el
ensayo determina tanto fenoles como taninos. A una alícuota del extracto alcohólico
se le añadió III gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina
fisiológica. Si el extracto es acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos.
A una alícuota del extracto se añadió acetato de sodio para neutralizar y III gotas de
una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica, un ensayo
positivo puede dar la siguiente información general:
- Desarrollo de una coloración rojo-vino: compuestos fenólicos en general.
- Desarrollo de una coloración verde intensa: taninos del tipo pirocatecólicos.
- Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos.
Ensayo de la Ninhidrina: Permite reconocer en los extractos vegetales la presencia
de aminoácidos libres o de aminas en general. Se tomó una alícuota del extracto en
alcohol, o el residuo de la concentración en baño de agua, se mezcló con 2 ml de
solución al 2% de ninhidrina en agua. La mezcla se calentó 5 a 10 minutos en baño de
agua. Este ensayo se considera positivo cuando se desarrolle un color azul violáceo.
Ensayo de Borntrager: Permite reconocer en un extracto la presencia de quinonas.
Para ello el solvente se evaporó en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1 ml de
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cloroformo. Se agregó 1 ml de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al
5%. Se agitó, mezclando las fases y se dejó en reposo hasta su ulterior separación. Si
la fase acuosa alcalina (superior) se coloreara de rosado o rojo, el ensayo se considera
positivo. Coloración rosada (++), coloración roja (+++).
Ensayo de Shinoda: Permite reconocer la presencia de flavonoides en un extracto de
un vegetal. Se diluyó el extracto con 1 ml de ácido clorhídrico concentrado y un
pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se esperó 5 minutos,
se añadió 1 ml de alcohol amílico, se mezclaron las fases y se dejó reposar hasta que
se separen. Si la alícuota del extracto se encontrase en agua, se procede de igual forma,
a partir de la adición del ácido clorhídrico concentrado.
El ensayo se considera positivo cuando el alcohol amílico se coloree de amarillo,
naranja, carmelita o rojo; intensos en todos los casos.
Ensayo de Antocianidinas: Permite reconocer en los extractos vegetales la presencia
de estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. Se calentaron 2 ml
del extracto etanólico 10 minutos. Con 1 ml de HClcc., se dejó enfriar y se añadió 1
ml de agua y 2 ml de alcohol amílico. Se agitó y se dejó separar las dos fases. La
aparición de color rojo a marrón en la fase amílica es indicativa de un ensayo positivo.
Ensayo de Dragendorff: Permite reconocer en un extracto la presencia de alcaloides,
para ello, se evaporó en baño de agua y el residuo redisolvió en 1 ml de ácido
clorhídrico al 1%. Con la solución acuosa ácida se realizó el ensayo, se añadió III gotas
del reactivo de Dragendorff, si existiera: opalescencia se ha de considerar (+), turbidez
definida (++), precipitado (+++).
Ensayo de Mayer: Se realiza según la forma descrita anteriormente, hasta obtener una
solución ácida.
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Se añadió luego, una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agitó y filtró. Se ha de
añadir II o III gotas de la solución reactiva de Mayer, y si observase: opalescencia (+),
turbidez definida (++), precipitado coposo (+++).
Observación: En el caso de alcaloides cuaternarios y los aminoácidos libres, éstos solo
se encuentran en el extracto acuoso y para considerar su presencia la reacción debe ser
(++) o (+++), que un resultado (+) puede provenir de una extracción incompleta de
bases primarias, secundarias o terciarias.
Ensayo de Wagner: Se parte al igual que en los casos anteriores de la solución ácida,
se añadió II o III gotas del reactivo y clasificando los resultados de la misma forma.
6. Ensayo microbiológico: 20,21
Se realizó por el Método de difusión en discos – Kirby & Bauer.
a. Preparación de las cepas.
La cepa de Cándida albicans fue proporcionada por el Laboratorio de Microbiología
de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.
b. Reactivación de los cultivos de Cándida albicans.
A partir de los cultivos puros de Cándida albicans, se sembró al hongo en tubos de
ensayo conteniendo Agar Sabouraud, los mismos que incubaron a 37 ºC por un
espacio de 24 a 48 horas.
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c. Preparación y estandarización de los inóculos de Cándida albicans.
A partir de los cultivos reactivados del hongo se prepararon suspensiones en solución
salina fisiológica estéril hasta alcanzar la densidad similar a la turbidez del tubo Nº
0.5 del Nefelómetro de McFarland (1.5 x 108 células/mL).
d. Siembra en placas.
Los cultivos estandarizados de Cándida albicans se sembraron por superficie en las
placas Petri conteniendo Agar Mueller Hilton. Una vez realizada la siembra de
Cándida albicans se eliminó el excedente y se llevó a secar las placas Petri en estufa
por 5 minutos aproximadamente.
e. Aplicación de los extracto
En cada placa sembrada se colocaron los discos de sensibilidad antes preparados
correspondientemente a concentraciones de 5 mg/mL, 10mg/mL, 15 mg/mL, 30
mg/mL y 50 mg/mL del extracto de bulbos de Ismene amancaes presionándolos con
suavidad sobre la superficie del agar con una pinza estéril, como control se colocó
los discos de sensibilidad que contenían Fluconazol.
Cada disco se enumeró de 1 al 4 según volumen respectivo; se dejaron reposar por
10 minutos a temperatura ambiente y luego se incubaron a 37 ºC por 24 horas. Se
realizaron 5 ensayos.
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f. Evaluación del efecto del extracto
La evaluación del efecto antifúngico se realizó midiendo con una regla milimetrada
el halo de inhibición de crecimiento de Cándida albicans; y los resultados se
expresaron como diámetro (mm) de halo de inhibición.
g. Comparación del efecto del extracto con el de los discos de sensibilidad de
Fluconazol.
Se realizó mediante el método de Kirby Bauer, para lo cual se utilizaron discos de
sensibilidad de Fluconazol. La medida del diámetro de los halos de inhibición de
crecimiento de Cándida albicans, por el contraste con el diámetro de los halos de
inhibición de los discos de sensibilidad de Fluconazol.
h. Determinación de la Concentración Bactericida y de la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI):
Se realizó la siembra de la bacteria en cinco tubos de ensayo con medio de solución
salina y el experimental en concentraciones de 5, 10, 15, 30 y 50 % y 0,2 mL de
acuerdo a lo que se quiso investigar y el cultivo bacteriano, incubándose a 37 C por
24 a 48 horas, después de lo cual se sembró de cada uno de los tubos 0.1 ml de la
dilución en placas con medio agar Mueller Hilton, incubando las placas en
anaerobiosis. La observación del crecimiento bacteriano se realizó mediante el
conteo de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC).
La CMI se interpretó como la concentración de extracto, contenida en el tubo de la
serie que inhibió el crecimiento visible de la bacteria, para lo fuel necesario
comparar cada uno de los tubos con los controles positivo y negativo. El tubo que
se observó claro sin turbidez fue la CMI.
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Aquellas placas petri en las cuales no existió crecimiento microbiano alguno o se
observó un crecimiento menor de 300 UFC fueron designadas como negativo (-);
mientras que en aquellas placas que presentaron crecimiento mayor de 300 UFC, el
resultado fue emitido como positivo (+).
Negativo (-): 0 a 300 UFC.
Positivo (+): >300 UFC.
8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para la presente investigación se utilizó tablas de resumen de indicadores como media
aritmética, desviación estándar y asimismo se usó gráficos adecuados para presentar los
resultados de investigación. Para determinar el efecto se utilizó el análisis de varianza
(ANOVA) para un diseño completamente al azar y considerando un nivel de significancia
de 95% (P<0.05). La prueba Post Hoc de elección fue Tukey.
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III. RESULTADOS
Tabla 1: Tamizaje fitoquímico del extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene
amancaes.
Metabolitos Ensayo Fracción
Clorofórmica
Fracción
Etanólica
Fracción
Acuosa
Alcaloides
Dragendorff ++++
Mayer ++++
Wagner ++++
Lactonas y Cumarinas Baljet -
Triterpenos y Esteroides Liebermann-Burchard +
Compuestos Fenólicos Tricloruro férrico +
Flavonoides Shinoda +++
Quinonas Borntrager -
Catequinas Luz UV +
Resinas Resina +
Azúcares Reductores Fehling +++
Saponinas Espuma +
Aminoácidos Ninhidrina +++
Antocianidinas Antocianidina - -
Resultado positivo: + Intensidad: Baja: +
Resultado negativo: - Moderada: ++
Alta: +++
Muy alta ++++
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Tabla 2. Medida de halos de inhibición producidos por exposición del extracto
hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes y los discos de sensibilidad de Fluconazol
25 UI, frente a Candida albicans.
Halo de inhibición (mm) discos de 6 mm de diámetro
Leyenda:
X ± D.E.: Promedio y desviación estándar. 6: No hay presencia de halo.
N° de
repeticiones
Concentración del extracto hidroetanólico (mg/mL) Control
positivo
Control
negativo
0.05 0.1
0.15
0.3 0.5 Fluconazol
25 U.I.
Etanol
30°
1 6 6 16 26 30 25 -
2 6 6 17 25 26 22 -
3 6 6 15 25 25 22 -
4 6 6 20 27 25 24 -
5 6 6 17 25 29 24 -
6 6 6 13 25 26 24 -
7 6 6 12 24 26 22 -
8 6 6 15 23 30 25 -
9 6 6 12 24 34 24 -
10 6 6 13 27 31 25 -
11 6 6 12 29 33 24 -
12 6 6 14 25 30 25 -
X ± D.E. 6 ± 0 6 ± 0 14.67±2.5 25.42±1.62 28.75±3.11 23.83 ±
1.19 -
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Figura 1. Promedios de los halos de inhibición del crecimiento del hongo Candida
albicans(mm) con diferentes concentraciones del extracto hidroetanólico de bulbos de
Ismene amancaes “Amancay”.
Tabla 3. Análisis de varianza para determinar el efecto del extracto hidroetanólico de
los bulbos de Ismene amancaes “Amancay” frente a Candida albicans.
Origen de las variaciones SC GL PC F P Valor
crítico para F
Entre grupos 5434.5 4 1358.625 366.595462 6.1355E-39 2.53968863
Dentro de los grupos 203.833333 55 3.70606061
Total 5638.33333 59
6 6
14.67
25.42
28.75
0
5
10
15
20
25
30
35
0.05 mg/mL 0.1 mg/mL 0.15mg/mL 0.3mg/mL 0.5 mg/mL
Concentración del extracto hidroetanólico vs Promedios de los halos de inhibición
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Tabla 4. Prueba de Tukey para determinar las concentraciones del extracto hidroetanólico
de bulbos de Ismene amancaes “Amancay” que presentan diferencias significativas
frente a Candida albicans.
Concentración Media
0.05g/ml 6
0.10g/ml 6
0.15g/ml 14.67
0.30g/ml 25.42
0.50g/ml 28.75
HSD 2.21
MULTIPLICADOR 3.98
Mse 3.71
N 12.00
A B C D E
A 0 -8.67 -19.42 -22.75
B -8.67 -19.42 -22.75
C -10.75 -14.08
D -3.33
E
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Tabla 5. Resultados del Recuento en placa de UFC de Candida albicans, frente a
diferentes concentraciones del Extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes.
0.05 mg/mL 0.1 mg/mL 0.15mg/mL 0.3mg/mL 0.5 mg/mL
Ensayo 1 320 900 630 620 80
Ensayo 2 320 930 650 430 110
Ensayo 3 300 960 960 400 30
Ensayo 4 400 620 680 580 100
Ensayo 5 510 1000 820 550 50
Promedio 370 882 748 516 74
Figura 2. Promedios del Recuento en placa del hongo Candida albicans(UFC) con
diferentes concentraciones del extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes
“Amancay”
370
882
748
516
74
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1 2 3 4 5
Ensayos
Promedio del Recuento en placa en UFC, a diferentes concentraciones.
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IV. DISCUSIÓN
En la presente investigación, se realizó el Tamizaje fitoquímico de los bulbos de Ismene
amancaes provenientes del distrito de Otuzco y también se evaluó la sensibilidad y el
efecto antifúngico in vitro del extracto hidroetanólico de los bulbos de Ismene amancaes
frente a Candida Albicans.
En la tabla 1 se observa diferentes fitoconstituyentes; en la fracción clorofórmica se
identificó mediante la reacción de Liebermann-Burchard triterpenos y/o esteroides. En la
fracción etanólica se identificaron resinas, Catequinas, compuestos fenólicos,
aminoácidos, flavonoides. En la fracción acuosa se identificaron alcaloides saponinas,
azúcares reductores
Los terpenoides o isoprenoides, se derivan de la fusión de unidades de cinco carbonos
llamada isopreno (C5) y se clasifican de acuerdo al número de unidades de isopreno que
los forman. En plantas, los isoprenos básicos para la síntesis de los terpenos son el
isopentenil pirofosfato (IPP) o su isómero dimetilalil pirofosfato (DMAPP) 17.
Los monoterpenos tales como el mentol, que es un antimicrobiano, el citronelal, que es
un repelente de insectos y las piretrinas que funcionan como venenos del sistema nervioso
de los insectos, son componentes químicos con actividad biológica potencial durante la
respuesta de defensa de las plantas que los producen. Los sesquiterpenos tales como la
risitina y lubimina ,el capsidiol y el 2,7-dihidroxicadaleno son compuestos con actividad
antimicrobiana; mientras que el poligodial inhibe fuertemente la alimentación de diversos
insectos herbívoros, el diterpeno atractilósido inhibe la fosforilación oxidativa en
mitocondrias, y el casbeno es un agente antifúngico. 17,18.
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Los alcaloides son heterocíclicos que por su similitud química a moléculas que participan
en la transmisión de las señales del sistema nervioso, bloquean neuroreceptores,
intermediarios de la transducción de la señal neuronal y canales iónicos de vertebrados e
insectos. Los alcaloides que se han logrado diferenciar en la bibliografía son licorina,
galantamina, tazzetina, crinina y narciclasina. Mientras que sus efectos inhibitorios del
crecimiento de microrganismos patógenos están dados por su capacidad de intercalarse
con el DNA, de detener la síntesis de proteínas, inducir la apoptosis e inhibir las enzimas
del metabolismo de carbohidratos. Los receptores adrenérgicos, nicotinérgicos,
muscarinérgicos y de la serotonina son blancos de unión de estos compuestos. Así mismo,
inhiben a las enzimas necesarias para la síntesis y el rompimiento del neurotransmisor
acetilcolina, impidiendo la transducción de la señal neuronal de insectos y vertebrados.
La interacción de estos alcaloides con el DNA, las proteínas y enzimas de la transcripción,
tóxicos contra bacterias, hongos, virus, insectos, vertebrados y otras plantas. 17
Flavonoides son una familia muy diversa de compuestos, que se caracterizan por ser
polifenólicos y solubles en agua. Cumplen funciones metabólicas importantes en las
plantas, como por ejemplo son responsables de la resistencia de las plantas a la
fotooxidación de la luz ultravioleta del Sol, intervienen en el transporte de la hormona
auxina, y se cree que funcionan como defensa ante el herbivorismo. Además son
considerados antimicrobianos, anticancerígenos, entre otros. Un flavonoide con
importante efecto antifúngico es la pisatina es un isoflavonoide producido por el guisante
en respuesta a la infección por hongos e induce la expresión del gen PDA1 en estos. La
pisatina y el eriodictiol inducen la germinación de las esporas de ciertos hongos. También
las furanocumarinas y estilbenos han demostrado tener propiedades antibacterianas,
antivirales y antifúngicas 18.
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El efecto antifúngico, del extracto hidroetanólico de los bulbos de Ismene amancaes se
explicaría por la existencia de constituyentes fitoquímicos con poder antifúngico; la
acción mostrada puede estar relacionada al funcionamiento de uno o más metabolitos
secundarios, sin embargo, las características de una planta por lo general no provienen de
un único principio active de los que está compuesta, sino de la acción conjunta de todos
ellos201,21.
Para cada medicamento existe lo que se conoce como los puntos de corte, los cuales
determinan, según los mm obtenidos o la CMI obtenida, si la cepa es sensible, intermedia
o resistente. En el caso del fluconazol se obtuvo un valor promedio de 23.83 ± 1.19,
encontrándose según la SCLI dentro de la categoría de sensible (anexo 3) 20.
En la tabla 2 se presentan los diámetros de los halos de inhibición del extracto
hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes frente a Candida albicans, donde se
observa que en las concentraciones de 0.05mg/ml y 0.10mg/ml no existió formación
obteniéndose una media de 6.00 mm ± 00 en ambos casos, mientras que en las
concentraciones 0.15 g/ml , 0.3 g/ml y 0.5 mg/ml la formación fue notoria, siendo los
valores de 14.67±2.5 mm, 25.42±1.62mm y 28.75±3.11mm, respectivamente.
Encontrándose según la SCLI dentro de la categoría de sensible. El valor promedio del
control negativo fue 0, comprobándose que la formación de los halos no correspondía al
efecto del etanol 30°GL.
En la table 3 se realizó el análisis de varianza, obteniéndose una probabilidad menor a
0.05, por lo que se acepta la hipótesis alterna, concluyendo que, existe relación entre la
concentración empleada del extracto seco de hojas secas de Ismene amancaes y la media
del diámetro del halo de inhibición obtenido frente a Candida albicans.
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En la tabla 4 se ejecutó la prueba post Hoc de Tukey, para determinar las concentraciones
del extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes “amancay” que presentan
diferencias significativas frente a Candida albicans, obteniéndose que existe diferencia
estadísticamente significativa entre el efecto del extracto a una concentración de 0.15
g/ml, 0.3g/ml y a 0.5 g/ml.
En la tabla 5 se muestran los recuentos de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de
Candida albicans a diferentes concentraciones, siendo en las concentraciones de
0.05g/mL, 0.1g/mL, 0.15g/mL y 0.3g/mL mayores de 300UFC. Por el contrario, en la
concentración 0.5g/ml se obtuvo un promedio de 74UFC, al ser un valor menor de 300
UFC se considera que no existió crecimiento del hongo. Obteniéndose que la
Concentración Mínima antifúngica es 0.5g/ml.
Respecto a lo evaluado en este trabajo de investigación, la acción antifúngica mostrada
se presenta posiblemente por el sinergismo de sus compuestos, es por eso que existe un
requerimiento de estudiar el efecto de los metabolitos secundarios uno a uno.
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V. CONCLUSIONES
1) El extracto hidroetanólico de los bulbos de Ismene amancaes presentó
fitoconstituyentes como triterpenos – esteroides, catequinas, resinas, azúcares
reductores, compuestos fenólicos, saponinas, alcaloides, aminoácidos, y flavonoides.
2) El extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes presenta sensibilidad a las
concentraciones de 0.15 g/mL, 0.3 g/mL y 0.5 g/mL, frente a Candida albicans con
halos de inhibición de 14.67 mm , 25.42 mm y 29.75mm respectivamente.
3) El extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes presentó efecto antifúngico
a la concentración 0.5g/mL, frente a Candida albicans.
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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Muñoz Leiva, V. Caracterización fenotípica y molecular de Candida albicans y
Candida dubliniensis en muestras clínicas. 2012. [Visto el 10 de enero del 2019].
URL
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ANEXOS
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ANEXO1
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TABLA 2: Puntos de corte y equivalencia diámetro – CMI para Candida spp
Fuente: Cantón, E; Martin, E; Espinel, A. (2004). Métodos estandarizados por el
CLSI para el estudio de la sensibilidad a los antifúngicos (Documentos M27-A3,
M38-A y M44-A). España: Revista Iberoamericana de Micología.
ANEXO 3: Preparación de la muestra botánica
a) Selección de los bulbos de Ismene amancaes
B
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b) Lavado de los bulbos de Ismene amancaes
c) bulbos de Ismene amancaes sin raíces
C
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d) Pesado de los bulbos de Ismene amancaes(780 gramos)
e) Cortado de los bulbos de Ismene amancaes
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f) Secado a estufa 40 °C durante 3 días
g) bulbos de Ismene amancaes secos
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h) Pulverización de los bulbos de Ismene amancaes
i) Pesado del polvo de bulbos de Ismene amancaes (117
gramos)
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ANEXO 4: Preparación del extracto hidroetanólico
a) Preparación de alcohol de 70° GL
b) Macerado
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c) Filtrado
ANEXO 5: Tamizaje fitoquímico
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Ensayos químicos:
(1) (14)
LEYENDA:
1) Catequinas 4) Saponina 7) Ninhidrina 10) Bortranger 13) Wagner
2) Resina 5) Fehling 8) Shinoda 11) Antocianina 14) Liberman
3) Baljet 6) Cloruro férrico 9) Draggendorf 12) Mayer
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ANEXO 6: Ensayo microbiológico frente a Candida albicans
a. Cepa de Candida albicans
b. Turbidez similar al tubo Nº 0.5 del Nefelómetro de
McFarland
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c. Preparación de agar Mueller Hilton
d. Preparación de discos de sensibilidad de las
concentraciones del Extracto hidroetanólico.
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ANEXO 7: Aplicación de los discos de sensibilidad
ANEXO 8: Resultados del Ensayo microbiológico de Sensibilidad
a. Control negativo: Etanol 30°GL
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b. Control positivo: Fluconazol
c. Resultados del Ensayo microbiológico del extracto
fluido hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes
frente a Candida albicans, a una concentración de
0.05g/mL.
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d. Resultados del Ensayo microbiológico del extracto
fluido hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes
frente a Candida albicans, a una concentración de
0.10g/mL.
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e. Resultados del Ensayo microbiológico del extracto
fluido hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes
frente a Candida albicans, a una concentración de
0.15g/mL.
f. Resultados del Ensayo microbiológico del extracto
fluido hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes
frente a Candida albicans, a una concentración de
0.30g/mL.
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g. Resultados del Ensayo microbiológico del extracto
fluido hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes
frente a Candida albicans, a una concentración de
0.50g/mL.
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ANEXO 9: Resultados del Recuento en placa
a. Resultados del Recuento en placa, a una concentración
de 0.05g/mL.
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b. Resultados del Recuento en placa, a una concentración de 0.10g/mL.
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c. Resultados del Recuento en placa, a una concentración de 0.15g/mL.
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d. Resultados del Recuento en placa, a una concentración de 0.30g/mL.
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e. Resultados del Recuento en placa, a una concentración de 0.50g/mL.
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Rojas Ontaenda, Leslie
Jenifer FF.BB 1021100113 Autor
Soto Vásquez, Marilú FF.BB Farmacotecnia Asesor 5727 Asesor
Tamizaje fitoquímico y efecto antifúngico in vitro del extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene
amancaes (amancay) frente a Candida albicans
28294849
76850173
asesor
autor
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01 Rojas Ontaenda, Leslie
Jenifer FF.BB 1021100113 Autor
02 Soto Vásquez, Marilú FF.BB Asesor 5727 Asesor
autor 76850173
28294849
asesor
Tamizaje fitoquímico y efecto antifúngico in vitro del extracto hidroetanólico de bulbos de Ismene amancaes (amancay)
frente a Candida albicans
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