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MICOBACTERIAS

Bioq Nora I Costa

Sección Bacteriología TBC

Hospital de Infecciosas F.J.Muñiz

MICOBACTERIAS: CLASIFICACIÓN

Orden: ActinomycetalesFamilia: Mycobacteriaceae

Género: MycobacteriumIntegrado por más de 150 especies, que pueden dividirse en 3 grandes grupos:

Micobacterias patógenas estrictas: Complejo Mycobacterium tuberculosis:

M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. capreae, M. pinnipedii

Enfermedad: Tuberculosis M. leprae (no cultivable) Enfermedad: Lepra

Micobacterias Ambientales Micobacterias no tuberculosas de crecimiento rápidoMicobacterias no tuberculosas de crecimiento lento

Enfermedad: Micobacteriosis

Micobacterias

M. Tuberculosis complejo

• Parásito estricto

• Reservorio: el hombre infectado.

• Son patógenos verdaderos.

• Se transmite persona a persona.

MNT

• Son muy abundantes en la naturaleza.

• Son habitantes de agua, tierra y alimentos.

• Variable distribución geográfica.

• Pueden contaminar muestras clínicas.

• Pueden ser patógenos oportunistas (micobacteriosis).

• No se transmiten persona a persona.

• Frecuentemente son resistentes a las drogas antituberculosas.

Micobacterias

Genero Mycobacterium

• Pared celular compleja y rica en lípidos.

1- Capacidad de ácidorresistencia.

2- Presencia de ácidos micólicos con 60 a 90 átomos de carbono.

3- Elevado contenido G+C : 61 a 71 % (guanosina+citosina), en su ADN.

Distribución enfermedades por Micobacterias

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

120,00%

Tuberculosis

Micobacteriosis

M.bovis

98.5%

1%0.5%

Datos de la epidemiología mundial

Países con mayor carga de TB

Tasas de incidencia de TB 2016

Tasas de TB por jurisdicción. Argentina 2019

Costo de los Tratamientos

OPS

S Tratamiento HRZE 918,32$

MR Tratamiento ZEKEthCsL 169021$

XDR Tratamiento LzErMoBe 1027502$

Resistencia a M tuberculosis…

• Aparece por mutación genética.

• Selección mediante esquemas terapéuticos erróneos, falta de supervisión terapéutica, falta de adherencia al tratamiento, mala calidad de los fármacos.

• Por haber recibido un mal esquema (irregularidad, abandono, mala prescripción)

RESISTENCIA ADQUIRIDA

• Por haberse contagiado con una cepa resistente (exposición a un foco con tuberculosis resistente)

RESISTENCIA INICIAL

DIagnósticoDIAGNÓSTICO

Los procedimientos diagnósticos en el laboratorio deben realizarse en condiciones de

bioseguridad adecuada

Baciloscopía: BSL 2Cultivo: BSL2, con prácticas de BSL3.

Métodos de Laboratorio para el diagnóstico de TB

• Baciloscopía • Cultivo

Baciloscopía: Coloración de Ziehl-Neelsen

1- Fijar extendido con calor.

2- Cubrir con Fucsina y flamear hasta desprender vapores blancos.

3- Lavar

4- Decolorar con Alcohol-HCl 3%

5- Lavar

6- Contracolorear con Azul de Metileno 2 o 3 minutos.

7- Lavar y dejar secar.

8- Mirar en 100X, e informar bacilos/100 campos

Ziehl Neelsen

• M. tuberculosis: se ven como pequeños bastones curvados (bacilos) de color rojo, en pares o grupos, sobre un fondo de tonos azulados

Cuantificación del frotis

Coloración de ZN: nro. de BAAR obs. a 1000x

Informe

Ninguno No se obs. BAAR

1 a 9 BAAR en 100 campos Nro. de bacilos observados.

10 a 99 BAAR en 100 campos (+)

1 a 10 BAAR/cpo. en al menos 50 cpos. obs.

(++)

> 10 BAAR/cpo. en al menos 20 cpos. osb

(+++)

Baciloscopia

• “La calidad del informe del laboratorio de microbiología depende inicialmente de la calidad de la muestra clínica remitida”

• En el diagnóstico de TB pulmonar, el Esputo es la mejor muestra del tracto respiratorio

Calidad de las muestras I

ESPUTOS

Muestra de elección: mucopurulenta o mucosa

Espontáneo o inducido.

Spot vs Overnight (53 % vs 85%)

Los esputos salivosos, no son buenas muestras, pero no deben descartarse, porque aun así pueden contener bacilos

Esputos¿Cuántas muestras procesamos?

Realizar estudio seriado para una mayor rentabilidad

La baciloscopía directa aporta:

~ 1ra. Muestra: 80% de positivos

~ 2da. Muestra: 95 % de positivos

marcado incremento de la positividad

~ 3ra. Muestra: 100% de positivos

Baciloscopia

• Conservación esputo (En heladera)

• No hay mucho problema si los conservamos hasta 1 semana, porque aunque los bacilos no sean viables, se colorean.

• No enviar extendidos!!!

En extendidos fijados hay entre 30 a 40% de bacilos viables.

En preparados coloreados, no hay bacilos viables

Baciloscopía

Rápida Fácil de realizar Bajo costo Detecta la mayoría de los casos infecciosos Especificidad: 96-99% Son necesarios entre 5.000 y 10.000 BAAR/ml. de

muestra para ser BK+, por eso la limitación másimportante es su baja sensibilidad

• RECORDAR!!! se necesitan < de 10 bacilos para transmitir la infección

S:70%E:99.8%

Baciloscopía

• Especificidad 96-99%• Falsos positivos:

Micobacterias ambientalesHongosNocardiaRayadurasSuciedad

• En un país de alta o mediana endemia, más del 99% de las BK+ son TB

DIAGNÓSTICO DE CERTEZA!!!!

La gran limitación de esta técnica (ZN) es su relativa baja sensibilidad

Influenciada por 3 factores:

1ro. Con lo avanzado de la enfermedad:

Sens. 80-90% con patrón cavitario en Rx de tórax

Sens. 50-80% si tiene infiltrados

Sens. < 50% en formas nodulares o masas

2do. Calidad de la muestra y de la coloración

3ro. Tiempo que dedica el operador en observar el frotis

BaciloscopíaPermite…

• Categorizar el grado de avance de la enfermedad en el momento del diagnóstico

• Interrumpir la cadena de transmisión tratamiento

aislamiento del paciente internado

• Monitorear la evolución del tratamiento

Control de tratamiento

• A todos los pacientes positivos en tratamiento se les realizarán controles baciloscópicos al 2º, 4º y 6º mes.

• Si la baciloscopía del 2º mes resultara positiva, se cultivará la muestra para identificación y sensibilidad.

• En el caso de pacientes internados se les realizará una baciloscopía semanal como control para poder externarlos.

CULTIVO

• La baciloscopía detecta el 70-80% de los casos • El cultivo el 20-30 % restante.

• Entre los casos de tuberculosis extrapulmonar el aporte del cultivo al diagnóstico es muy variable según la localización de la patología.

Si se considera el total

de casos con diagnóstico

de tuberculosis

pulmonar confirmado

bacteriológicamente…

Calidad de las muestras II

• BAL es importante centrifugar estas muestras previa realización de los

directos, para mejorar la calidad de las mismas.

Evaluar celularidad.

• CONTENIDO GÁSTRICO (solo en niños) BAAR no patógenos, baciloscopίa con reserva, debe haber abundantes bacilos.

• ORINAS centrifugar previa realización de los directos

seriado de 3 muestras

• Otros líquidos: pleural, LCR, articular, abscesos, etc

Calidad de las muestras III

• BIOPSIAS

En solución fisiológica o agua estéril, sin conservantes. Macerar el material antes de realizar el directo

• HEMOCULTIVO Y MÉDULA ÓSEA• 5 ml de sangre heparinizada

• Aspiración de médula ósea heparinizada

• Muestras que solo tienen valor en pacientes inmunocomprometidos

SEGÚN LAS NOTIFICACIONESLA BACILOSCOPIA CONFIRMA

EL 75% o más DE LOS CASOS PULMONARES….

• RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS EN MUESTRAS DE PACIENTES CON TUBERCULOSIS PULMONAR. ARGENTINA. 2º CUATRIMESTRE 2000

MUESTRA NÚMERO BACILOSCOPÍA +Nº %

SÓLO CULTIVO +Nº %

ESPUTO 1649 1339 81.2 310 18.8

L. BRONQUIAL Y BAL 110 53 48.1 57 51.9

LAVADO GÁSTRICO 37 18 48.6 19 51.4

TOTAL 1796 1410 78.6 386 21.4

RESULTADOS BACTERIOLÓGICOS EN MUESTRAS DE PACIENTES CON TUBERCULOSIS EXTRAPULMONAR

ARGENTINA. 2º CUATRIMESTRE 2000

MUESTRA BACILOSCOPÍA +Nº %

SÓLO CULTIVO +Nº %

TOTAL Nº %

GANGLIO 24 52.2 22 47.8 46 23.7

LÍQUIDO PLEURAL 5 13.9 31 86.1 36 18.5

ORINA 18 54.5 15 45.5 33 17.0

BIOPSIA PLEURAL 8 44.4 10 55.6 18 9.3

LCR 3 23.1 10 76.9 13 6.7

SANGRE Y M. ÓSEA 2 16.2 10 83.8 12 6.2

LÍQUIDO ASCÍTICO 3 33.3 6 66.7 9 4.6

OTRAS BIOPSIAS 1 12.5 7 87.5 8 4.2

OTRAS MUESTRAS 13 68.4 6 31.6 19 9.8

TOTAL 77 39.7 117 60.3 194 100.0

Cultivo

Muy importante!!!Conservar los materiales en la heladera, y procesarlos dentro de los 3 días, ya que los bacilos pierden viabilidad.

Tiempo 0 días 3 días 5 días 7 días

% viables 93% 83% 71 % 63%

Cultivo

• Permite dar seguridad al resultado de la baciloscopía positiva de algunas muestras.

• Permite aislar los BAAR presentes en una muestra en cantidad suficiente como para identificarlos por métodos bioquímicos.

• Permite realizar la prueba de sensibilidad en los casos que sea necesaria.

Normas para solicitud de cultivo

• Muestras de esputo con baciloscopías reiteradamente negativas y con clínica, radiología y/o epidemiología compatible con tuberculosis.

• Todas las muestras extrapulmonares.

• Todas las muestras pediátricas.

• Pacientes con asociaciones morbosas.

• Pacientes inmunocomprometidos.

• Pacientes comunidades cerradas.

Cultivo

• Decontaminación y concentración de la muestra por el Método de Petroff.

• El pellet obtenido de la concentración, es el que se siembra en el medio de LöwensteinJensen (LJ) y en un medio Stonebrink para

ver el desarrollo de M.bovis.

Detección de Micobacterias I

Método convencional:

Cultivo en medio sólido, a base de huevo entero, sales, glicerol, harina de papa y verde de malaquita.

Lowenstein-Jensen y Stonebrink (con glutamato)

Más de 20 días para obtener desarrollo microbiano

Cultivo en medio sólido

Las muestras se incuban a 37C durante 8 semanas, con observaciones diarias las primeras 48 hs. y luego observaciones semanales.

Registrar tubos contaminados, no debe ser mayor al 4-5% del total de muestras sembradas.

Los cultivos positivos se informan en cruces: Entre 1 a 19 colonias se informa el número exacto De 20 a 100 colonias: una cruz Más de 100 colonias: ++ o +++

CultivoVentajas:

Mayor sensibilidad que BK

Desvantajas:

Menos accesibles

Más caro

Lento crecimiento 3-8 semanas

10 a 100 bacilos en toda la

muestra

Utilidad del cultivo

Detectar bacilos escasos en distintas muestra

• De lesiones pulmonares poco avanzadas

• Extrapulmonares

• Pediatricas

Aislar e identificar BAAR en muestras que pueden contener micobacterias ambientales

• Orina, lavado gástrico

Utilidad del cultivo

Aislar y realizar la prueba de sensibilidad de BAAR de muestras de pacientes que pueden tener tuberculosis resistente a los antibióticos de primera línea con

Mala respuesta al tratamiento

Historia de tratamiento previo

Inmunosuprimidos

Vigilancia epidemiológica

A QUIENES PEDIR LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD?

• Pacientes con abandono de tratamiento, recaídas, re-internaciones.

• Todas las muestras de pacientes inmunocomprometidos(HIV +, oncológicos, en tratamiento con corticoides, diabéticos).

• Pacientes en contacto con multirresistentes.

• Pacientes que al segundo mes de tratamiento cumplido sigan con baciloscopías positivas.

• Pacientes de países con alta tasa de resistencia (Perú).

Prueba de sensibilidad

• Método de las proporciones:

• Medio de Löwenstein-Jensen, con antibióticos:

H,R,S,E,PAS + tubo control sin antibiótico. Se siembran dos diluciones.

• Hay Resistencia con un desarrollo mayor al 1%

|

BK + y ++: siembra SD y -2

BK +++: siembra -1 y -3

• Microscopia de Fluorescencia LED

Mejora de Microscopía

• Uso de Medio Líquido

• Nitratasa, MODS

Mejora de cultivo y DST

ID rápida

Biología molecular

Inmunocromatografia lateral

Diag de Mtc y mutaciones que determinen R (R y/o H).X pert,

Nuevas Herramientas

AURAMINA- RODAMINA

Tan eficaz como la coloración de ZN

Se basa en el mismo principio de la ácido-alcohol-resistencia

M. tuberculosis: se ven como pequeños filamentos amarillos fluorescentes sobre fondo verde

SISTEMAS DESARROLLADOS PARA LA DETECCIÓN PRECOZ DEL DESARROLLO DE MICOBACTERIAS

Métodos que detectan consumo de O2:

• MGIT 960

Fluorométrico

(Becton Dickinson)

MGIT 960

• Método automatizado de monitoreo continuo que detecta el consumo de oxígeno por parte de las micobacterias que desarrollan en la muestra. Así se activan los sensores de fluorescencia y se detectan en el equipo las muestras positivas.

MGIT 960

• Lectura automatizada de cultivos• Monitorean automáticamente

tubos indicando crecimiento • Aumenta la sensibilidad• Reduce a la mitad el tiempo de

detección de desarrollo del bacilo• No Identifica Complejo M

tuberculosis• Permite conocer el perfil de

resistencia a drogas antituberculosas

• Botella con tapa, mejora bioseguridad pero aporta mayor contaminación

MGIT 960

• Los tubos donde se inoculan las muestras son plásticos y a rosca por lo que no hace falta jeringa y aguja para inocular las muestras reduciendo riesgos en el personal que las manipula, aunque son observadas mayores tasas de contaminación.

• Código de barras.

• Link a sistemas de gestión de laboratorio

Ventajas de los medios líquidos

• Mayor sensibilidad que los medios sólidos.

• Mayor rapidez de detección que los medios

sólidos.

ZN +++ ZN ++

L-Jensen 17 días 20 días

MGIT 5 días 10 días

Inconvenientes o desventajas

• Mayores tasas de contaminación (se calcula una tasa de contaminación aceptable de 4%, aunque es algo superior en el caso de MGIT 8%).

• Aporte eléctrico continuo

• Dificultad para reconocer cultivos mixtos

(Incapacidad de observar morfología de las colonias)

• Incapacidad de realizar recuento de colonias

• Muy caros

• Bioseguridad???

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE MICOBACTERIAS

Marcha mínima

• MICROSCOPIA

( presencia de cuerda)

• TBc ID (inmunocromatografía).

detección de antigeno PT64.

• Tiempo de positividad del cultivo

• Características de las colonias

TBc ID (MGIT BD)

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD EN MEDIO LIQUIDO (MGIT)

• A drogas de primera linea:

H (0.1) y R

• A drogas de segunda linea:

H (1), Ak, K, Levo, Ca

PRUEBA DE SENSIBILIDAD-MGIT

MGIT 7ml- curva de crecimiento

MGIT- R a INH y RIF

Se han desarrollado métodos rápidos y económicos para hacer un screening que acelere la detección de Resistencia a R (e H )

Para laboratorios habituados a la prueba de sensibilidad en Lowenstein–Jensen.

Para laboratorios con entrenamiento en microbiología

general y bioseguridad adecuada.

NITRATASA

FAGOS

Nuevos métodos fenotípicos rápidos para detección de MR o resistencia a R

Técnicas basadas en la detección de viabilidad bacilar

Método de la Nitratasa

• No dependen de equipamiento sofisticado ni reactivos costosos.• El procedimiento es similar al del método convencional y emplea el

mismo medio sólido.• Capacidad que tienen los bacilos para reducir el nitrato a nitrito

mientras están viables• Su incorporación a la rutina no altera sustancialmente la carga de

trabajo en los laboratorios que realizan pruebas de sensibilidad.• Se ha comprobado su utilidad en la detección de resistencia a

isoniacida, rifampicina.• En un estudio realizado en nuestro país, el método de la nitratasa

también resultó adecuado para la detección de resistencia a drogas cuando fue aplicado directamente a muestras de esputo con BK +++

MODS

Métodos colorimétricos

• Se basan en la capacidad que tienen los bacilos viables, luego de la exposición a una droga, para reducir indicadores de color añadidos al medio de cultivo.

• La presencia de bacilos resistentes se detecta por un cambio de color del indicador.

• Dos indicadores, resazurina y MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), han sido ampliamente evaluados en un micrométodo.

• Con ambos indicadores se detecta resistencia a isoniacida, rifampicina y etambutol en 10 días con una eficiencia mayor a 98%.

• La implementación de estos métodos requiere buenas condiciones y prácticas rigurosas de bioseguridad, por lo que en nuestro medio su implementación sería posible a nivel de laboratorio de referencia.

Nuevas herramientas diagnosticas en las redes de laboratorios de tuberculosis en Latinoamérica. Barrera L, Montoro E. OPS 2006 1(1)

OPS ha recomendado la prueba de nitratasapara detectar rápidamente resistencia a rifampicina e isoniacida en Latinoamerica

OPS /OMS producen recomendaciones

en base al análisis de publicaciones

y revisión sistemática de resultados de validación

en los escenarios donde tienen que ser empleados

a cargo de expertos independientes de la industria

Prueba de sensibilidad de fármacos de segunda línea• Métodos aceptados por la OMS

Métodos de las proporciones en medio Lowestein- Jensen

MGIT para aminoglucósidos y levofloxacina.

• El ensayo e interpretación de resultados de las pruebas presentan alto grado de dificultad

Orientación para evaluar la resistencia a drogas de segunda línea

OMS, Ginebra , julio 2007

Se recomienda seguir el siguiente algoritmo

R e H(incorporar algún método rápido en lo posible)

E y S

Z

fluoroquinolonas (OFX)

kanamicina (o amicacina) y

capreomicina

En laboratorios muy

experimentados

bajo un programa de

control de calidad

externo conducido por un

laboratorio supranacional

Conclusiones• En general, las pruebas de sensibilidad a distintas drogas

difieren en confiabilidad y reproducibilidad. • Las pruebas de sensibilidad a R son las más reproducibles

seguidas por las de sensibilidad a H. • los resultados de las pruebas de sensibilidad a E y S son

mucho menos confiables, aún los obtenidos con los métodos patrones.

• A nivel internacional se proponen valores de eficiencia de 97% y 99% para las pruebas de sensibilidad a H y R y de 92% para S y E.

• Eficiencias inferiores a estas exigen un programa de mejoramiento de la calidad.

• El método de la nitratasa, los colorimétricos y el basado en la replicación de bacteriófagos cumplen con los niveles de eficiencia aceptados para H, R y E, pero no para S.

Métodos Moleculares

• Amplificación de ácidos nucleicos

Métodos Moleculares

Métodos moleculares

Métodos moleculares

Medios líquidos para cultivo y PS

en escenarios con bajos y medios recursos

OMS ha recomendado el empleo de

Pruebas moleculares (LIPAs) para screening rápido

de pacientes con riesgo de multirresistencia

http://www.who.int/tb/dots/laboratory/en/index.html

Comenzando la implementación en

laboratorios de referencia nacional

que cumplan ciertos requisitos

CONCLUSIONES…..Recordar siempre!!!!

Cuanto menor el número de bacilos, menor la probabilidad de que resulte positiva una baciloscopía, un cultivo o una PCR

El resultado negativo de un método microbiológico no puede ser utilizado para descartar el diagnóstico de TBC.

EL DIAGNOSTICO EN TB ES

Clínico: síndrome de impregnación.Radiológico: poco específicoBacteriológico (el de mayor especificidad), obtención de muestras de esputo, punciones, abscesos, LCR, PAMO y hemocultivos en HIV+.

CASO DE TB: paciente diagnosticado como tal por el médico tratante.

La baciloscopía y cultivo continúan siendo los métodos básicos y certeros para confirmar el diagnóstico de

tuberculosis, por lo tanto deben ser ofrecidos a todos los sintomáticos

• Los métodos de reciente generación no son de aplicación universal, son costosos y tienen

distinta utilidad y precisión.

• La selección e interpretación de sus resultados requiere interacción estrecha entre neumonólogo/infectólogo y el

microbiólogo de manera que , racionalmente, estos métodos aporten orientación útil para las decisiones clínicas.

Equipo multidisciplinario

de salud!!!!

GRACIAS POR SU ATENCIÓN!