biofÍsica de proteÍnas de membrana parte 1

Dra. Leticia I. Llarrull

Lic. en Biotecnología

Asignatura: BIOFISICA – 2020

BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAPARTE 1

Involucradas en: • Señalización a través de membranas celulares• Transporte de moléculas no permeables a través de

membranas• Comunicación célula-célula• Reconocimiento celular• Adhesión celular, entre otros

Muchas son blancos de drogas: el blanco de mas del 50% de todas las drogas en el mercado son proteínas de membrana.

Dificultades en la obtención de cristales de buena calidad

Sub-representadas en bases de datos estructurales (solo el 1% de las estructuras depositadas en el PDB)

PROTEÍNAS DE MEMBRANA

Las proteínas de membrana son difíciles de cristalizar

• Tienen regiones hidrofóbicas e hidrofílicas en sus superficies• Mucho más difíciles de aislar que las proteínas solubles en agua, ya

que deben ser solubilizadas de membrana (reemplazo de los lípidospor detergente) sin provocar desnaturalización.

• A pesar de los considerables esfuerzos realizados, relativamente pocasproteínas TM han producido cristales que difractan con altaresolución.

• Proteínas TM - aproximadamente 30% de un proteoma• En las bases de datos estructurales: comprenden sólo alrededor de 1%

del total de estructuras depositadas

Esto podría mejorar en el futuro, con tecnologías avanzadas:• Es posible determinar estructuras de rayos X de cristales de proteína

cada vez más pequeños;• Combinado con métodos novedosos de cristalización, tales como el

uso de anticuerpos para solubilizar

Las proteínas de membrana son difíciles de cristalizar

PROTEINAS PERIFERICAS LABILMENTE ASOCIADAS:Solubilización a partir de

preparaciones de membrana con tratamiento con KCl

PROTEINAS PERIFERICAS ASOCIADAS POR FUERTES

INTERACCIONES ELECTROSTATICAS:

Solubilización a partir de preparaciones de membrana con tratamiento con Na2CO3

PROTEINAS INTEGRALES:Solubilización a partir de

preparaciones de membrana con detergentes (a evaluar)

PROTEÍNAS DE MEMBRANA

PROTEÍNAS PERIFÉRICASInteracciones Reversibles de las proteínas periféricas con la

bicapa lipídica

PROTEÍNAS PERIFÉRICASInteracciones Reversibles de las proteínas periféricas con la

bicapa lipídica

HÉLICES ANFIPÁTICAS

Hidrofóbicos

Polares

Cargados

HÉLICES ANFIPÁTICAS

HÉLICES HIDROFÓBICAS

PROTEÍNAS PERIFÉRICAS

Lipid-Anchored Proteins

• Lipid modification gives an opportunity totarget proteins to the membrane (andeven to specific intracellular membranesin eukaryotes) as well as to stabilize theirinteractions at the bilayer.

• The lipids can be fatty acids, terpenes, orglycosylphosphatidylinositol (GPI).

Dra. Leticia I. Llarrull

Lic. en Biotecnología

Asignatura: BIOFISICA – 2020

BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAPARTE 2

Clasificadas en dos tipos básicos: α-helicoidales y barriles-β

Proteínas de membrana α-helicoidales:

• Categoría mayoritaria• Presentes en todos los tipos de membranas biológicas, incluyendo la

membrana externa bacteriana• Consisten en una o mas hélices transmembranas (hasta 20), cada una de

las cuales contiene un tramo de aminoácidos hidrófobos, vinculadas por bucles extra-membranosos

• Bucles pueden contener subestructuras: - Bucles re-entrantes (-hélices cortas que ingresan a la

membrana y salen del mismo lado)- Hélices anfipáticas (se acomodan paralelas a la

membrana)- Dominios globulares

PROTEÍNAS INTEGRALES DE MEMBRANA

Tipo Ia : contienen una secuencia señal escindible

Tipo Ib: no contienen una secuencia señal escindible

Proteínas integrales de membrana α-helicoidales

Tipo IIIa : contienen una secuencia señal escindible

Tipo IIIb: tienen su extremo N-terminal expuesto a la superficie exterior de la membrana pero no contienen una secuencia señal escindible

Tipo III. (A) La bacteriorrodopsina de Halobacterium salinarum, un receptor acoplado a proteína G(GPCR) con siete hélices transmembrana, flanqueada por la bicapa lipídica. Actúa como unabomba de protones, utilizando energía de la luz capturada para mover protones a través de lamembrana de la célula. código PDB 1py6. Otros GPCRs incluyen halorhodopsina, una bomba decloruro impulsada por la luz, código PDB 1e12. (B) representación de la topología de labacteriorrodopsina.

Proteínas integrales de membrana α-helicoidales

Una proteína Barril-canónica, la porina OmpF(monomérica) de Escherichia coli. Las porinas son proteínas transmembrana con centros huecos a través del cual las moléculas pequeñas pueden difundir. Código PDB 2f1c.

• Presentes en membranas externas de bacterias Gram-negativas, en lapared celular de bacterias Gram-positivas, y en las membranas externasde las mitocondrias y los cloroplastos.

• Se componen de una serie de hebras anti-paralelas embebidas en lamembrana, cada una de las cuales está unida mediante puentes dehidrógeno a las hebras inmediatamente antes y después en la secuenciaprimaria, conectadas por bucles extra-membranosos

Proteínas integrales de membrana Barril-β

• Todas las proteínas transmembrana Barriles- tienen una topología de hebras antiparalelas que puede reflejar su origen evolutivo común y mecanismos de plegado similares.

• Forman comúnmente porinas, de 16-18 hebras, que se ensamblan para formar canales llenos de agua que permiten la difusión pasiva de nutrientes y productos de desecho a través de la membrana exterior.

• Compuestos potencialmente tóxicos más grandes: impedimento de ingreso en la célula por el tamaño del canal.

Proteínas de membrana Barril-β

• Hebras : contienen alternadamente aminoácidos polares e hidrofóbicos de manera que los residuos hidrofóbicos están orientados hacia el exterior, donde se ponen en contacto con los lípidos que rodean a la proteína, y los residuos hidrofílicos están orientados hacia el interior de los poros.

Proteínas de membrana Barril-β

Translocón Sec Insertasa YidC Sistema Tat

• bacterias• algunas arqueo bacterias• membranas del retículo

endoplasmático en célulaseucariotas

• Cloroplastos• AUSENTE en mitocondrias

• bacterias• algunas arqueo bacterias• mitocondrias• cloroplastos

• presente en la mayoríade las bacterias y arqueobacterias

• presente en cloroplastos• AUSENTE en

mitocondrias

FUNCIONES • Transportar proteínassecretorias a través de lamembrana interna

• Insertar proteínas demembrana en lamembrana interna

• Insertar proteínas demembrana en lamembrana interna

• Coopera con el translocónSec en algunos casos

• Transportar proteínassecretorias a través de lamembrana interna

• Insertar proteínas demembrana en lamembrana interna

• Sustratos: generalmenteproteínas con cofactores,la inserción de loscuales está generalmenterestringida al citosol.

ESPECÍFICO PARA

PROTEINAS DESPLEGADAS PROTEINAS DESPLEGADAS PROTEINAS PLEGADAS (transporta proteínas plegadas a través de la membrana)

Sistemas de Translocación de Proteínas

SRP: signal recognition particleTF: trigger factorSA: Sequence/Signal AnchorSS: Signal Sequence of a soluble protein RNC: ribosome-associated nascent chain FtsY: membrane-anchored SRP receptor

RR: Signal Sequence of the Tat System, with a Twin Arginine Motif

Proteínas de membrana auto-integrativasColicins:• Bacteriocins, a class of toxins

synthesized and released by bacteriato kill competing microorganisms.More than a third of E. coli strainsproduce colicins.

• These bacteria harbor plasmids thatencode specific colicins, along withspecific immunity proteins, which aremembrane proteins that ensure theirown protection from the lethal actionof the colicins.

• They enter their target cells utilizingouter membrane receptors andeither the Tol or Ton intermembranetranslocation systems.

• Those in the channel-formingsubfamily then insert into thecytoplasmic membrane to formvoltage-gated channels that leak ionsat a very great rate (> 106 ionschannel-1 sec-1), depolarizing themembrane and eventually killing thecell.

Proteínas de membrana auto-integrativas

Fusiones de Mistic a proteínas de membrana: ayuda a la sobreexpresión de proteínas de membrana en sistemas recombinantes

Dra. Leticia I. Llarrull

Lic. en Biotecnología

Asignatura: BIOFISICA – 2020

BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAPARTE 3

Proteínas de membrana auto-integrativasColicins:• Bacteriocins, a class of toxins

synthesized and released by bacteriato kill competing microorganisms.More than a third of E. coli strainsproduce colicins.

• These bacteria harbor plasmids thatencode specific colicins, along withspecific immunity proteins, which aremembrane proteins that ensure theirown protection from the lethal actionof the colicins.

• They enter their target cells utilizingouter membrane receptors andeither the Tol or Ton intermembranetranslocation systems.

• Those in the channel-formingsubfamily then insert into thecytoplasmic membrane to formvoltage-gated channels that leak ionsat a very great rate (> 106 ionschannel-1 sec-1), depolarizing themembrane and eventually killing thecell.

Antibacterial Peptides

Colicins

Plegamiento de proteínas de membrana auto-integrativas

Plegamiento de Proteínas de Membrana α-helicoidales

A. The two-stage model for foldinghelical membrane proteins consists of :

(I) helix insertion

The stability of individual helices is postulated to allow them to insert as stable domains in thelipid bilayer.

(II) helix interaction.

Side-to-side helix association results in a folded and functional protein.

A third stage for some proteins involves additional folding steps:

➢ (top) such as loop rearrangement,

➢ addition of prosthetic groups (P).

Plegamiento de Proteínas de Membrana α-helicoidales

Empaquetamiento "Knobs-in to-holes“: observado en interacciones hélice-hélice en muchas proteínas de membrana

La Glicoforina A dimeriza cuando las hélices TM de dos moléculas se asocian, demanera tal que cadenas laterales de aminoácidos ramificados que protruyen de unahélice se acomodan en “huecos o agujeros" de la otra hélice debido a los residuosde glicina. Visto desde la parte superior, el estrecho contacto entre pares deresiduos de valina y glicina son evidentes. Visto desde el lateral, la proximidad detales pares permite que las dos hélices puedan interactuar fuertemente. El tercerdibujo muestra las distancias interatómicas entre las dos regiones TM.

Motivo cierre de serinas en interacciones hélice-hélice

Polar clamp hydrogen bonding (‘Abrazadera’ Polar)

Involucra la cadena lateral deun aminoácido en una posicióndada i que es capaz de formaral menos dos enlaces puentede hidrógeno (es decir, E, K N,Q, R, S, T) con otros dosresiduos, uno en la mismahélice (en la posición i + 1 o i +4) y uno en la otra hélice.

Estudios de Plegamiento de Proteínas de Membrana Barril-

Proteínas -hélice: cada hélice puede ser formada independientemente mediantepuentes de hidrogeno a lo largo del eje de la hélice.

Proteínas Barriles-:• presentan puentes de hidrogeno entre hebras vecinas, aun con hebras cercanas a los

extremos N y C-terminal;• una hebra- aislada no es una estructura estable: se requiere de la formación de al

menos 3-5 hebras para estabilizar una estructura , incluyendo los de dominios deproteínas solubles;

• se esperaría que todas las hebras del barril- se formen simultáneamente.

Estudios de Plegamiento de Proteínas de Membrana Barril-

OmpA: Las ubicación de los residuos de Trp durante el proceso de plegado se siguió con un conjunto de “reglas espectroscópicas”: lípidos que llevan un átomo de bromo como quencher de la fluorescencia en diferentes posiciones de sus cadenas carbonadas.

Dra. Leticia I. Llarrull

Lic. en Biotecnología

Asignatura: BIOFISICA – 2020

BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAPARTE 4

Métodos Biofísicos para el estudio de proteínas de membrana

• Fluorescencia – determinación de la topología y del mecanismo de plegamiento

• Estudios en SUVs: CD/IR/Absorción/Fluorescencia• Estudios en nanodiscos: fluorescencia/CD/Intercambio de deuterio-MS• Difracción de rayos X• RMN• Crio-microscopia electrónica• EPR (fuera de los alcances del curso)

• BIOINFORMATICA• Modelado molecular• predicciones de la proteína en relación con la membrana basada en la

minimización de la energía de transferencia de agua-lípido • Análisis de hidrofobicidad/característica estructural • simulaciones de dinámica molecular de grano grueso

• The detergent concentration must be keptabove its CMC to maintain the mixedmicelles.

• Sometimes adding still higherconcentrations displaces the lipidcompletely, producing detergent-proteincomplexes Free of lipid.

Solubilización de proteínas de membrana

Estudios de proteínas de membrana en SUVsProtocolo 1

Estudios de proteínas de membrana en SUVsProtocolo 2 – Cell-free Síntesis con inserción in situ en liposomas

Molde + Extracto Celular + SUVs = Síntesis Proteica en SUVs

Limitación: proteínas condominios que tienen queser translocados a travésde la membrana, para locual se requiere de lasproteínas del sistema Sec,ausentes en los liposomas.

Estudios de proteínas de membrana en Nanodiscos

Estudios de proteínas de membrana en SUVsEjemplo Protocolo 2 – Cell-free Synthesis of a Seven Helix Membrane Protein: In situ Insertion of Bacteriorhodopsin into Liposomes

Estudios de proteínas de membrana en SUVsEjemplo Protocolo 2 – Cell-free Synthesis of a Seven Helix Membrane Protein: In situ Insertion of Bacteriorhodopsin into Liposomes

Estudios de proteínas de membrana en SUVs

Estudios de proteínas de membrana en NanodiscosNativos

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BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAPARTE 5

Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

SignalP; TargetP

Predicción de péptidos señal

BIOINFORMATICA

Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

Gráficos de hidropatía

Los primeros métodos de predicción por Kyte y Doolittle (1982) y Engelmanet al. (1986), y más tarde por Wiley and White (1996), se basaron en índicesde hidropatía determinados experimentalmente, para crear un gráfico dehidropatía para una proteína.

Este gráfico de hidropatía se genera considerando una ventana de 19-21residuos que se deslizada a lo largo de la secuencia de la proteína ypromediando la puntuación. En cada posición, el índice hidrofóbico medio delos aminoácidos dentro de la ventana se calcula y ese valor se representacomo el punto medio de la ventana.

BIOINFORMATICA

Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

Gráficos de hidropatía

BIOINFORMATICA

COEFICIENTE DE PARTICIONMEDICION DE LA HIDROFOBICIDAD DE UNA SUSTANCIA

Gtr = cambio en energía libre al transferir la sustancia desde el agua a un solvente apolar (heptano, por ejemplo).

Las regiones de alta hidrofobicidad corresponderían a -hélices TM hidrofóbicas (pueden aparecer algunas anfipáticas…).

Datos topológicos de proteínas de membrana interna en E. coli+

Datos de topología de proteínas de los centros de reacción fotosintéticos

• Análisis estadístico de los aminoácidos de los bucles internos y externosrevelaron una prevalencia de residuos básicos en los bucles citoplasmáticos,

• Residuos aromáticos (Trp y Tyr) tienden a agruparse cerca del final de lossegmentos transmembrana (Wallin et al. 1997 ): buffers físicos para estabilizarlas hélices TM en la bicapa lipídica,

• Aparición de motivos de secuencia, como ser el motivo GxxxG (Senes et al.2000), dentro de las hélices TM,

• Identificación de motivos periódicos implicados en el empaquetado hélice-hélicey en la estructura 3D (Samatey et al. 1995).

Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

The von Heijne Positive-Inside Rule

En general, los bucles no translocados de proteínas de membrana presentan dos a cuatro veces más residuos de Lys y Arg que los que se encuentran en

dominios/bucles translocados.

Predecir la orientación de las hélices TM de las secuencias de aminoácidos: TopPred(Claros and von Heijne 1994).

Específicamente, un bucle con varios residuos básicos dentro de los 30 residuosdesde el extremo de una hélice TM será un bucle interno.

Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

The von Heijne Positive-Inside Rule

Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

Bucles re-entrantes

Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

doi.org/10.7554/eLife.08928.001 doi:10.1093/nar/gkp1042

Péptidos Señal y Bucles re-entrantes:

La alta similitud entre estas estructuras y el perfil hidrofóbico de una hélice TM conducecon frecuencia a un cruce entre los diferentes tipos de predicciones.

SignalP; TargetP

Identificación de péptidos señal

TOP-MOD; OCTOPUS Identificación de bucles re-entrantes

(debe mejorarse) Problema: carencia de datos

confiables con los cuales entrenar a la computadora (machine-learning

based methods).

Predicción de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

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Asignatura: BIOFISICA – 2020

BIOFÍSICA DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAPARTE 6

Proteínas -helicoidales - ubicación topológica de una región (bucle)

• Análisis de glicosilación• Inserción de etiquetas • estudios con anticuerpos• construcciones de proteínas de fusión (a fosfatasa alcalina, a eGFP,

otras)

Riesgo de alterar la topología natural mediante la alteración de la secuencia de la proteína.

Estudio de la topología de proteínas de membrana α-helicoidales

Proteínas -helicoidales - ubicación topológica de una región (bucle)

Construcción de proteínas de fusión a eGFP

Predicción de la topología de proteínas transmembrana

BIOINFORMATICADISEÑO DE PROTEINAS

TRUNCADAS

https://doi.org/10.1038/s41598-019-55923-z

Ejemplo de Modelado integrativo y mapeo de topología de membrana

Homology model from I-

TASSER

EVFOLD residues 133 to 306

Homology modeling with evolutionary

restraints

140 160 180 200 220 240 260 280140

160

180

200

220

240

260

280

140 160 180 200 220 240 260 280140

160

180

200

220

240

260

280

RMSD = 6.08 Å

RMSD = 5.22 Å

Refinement and extensions based on

homology model

RMSD = 3.97 Å

Robetta model of the effector domain

Model of PROTEASE DOMAIN

MecR1 (Pfam)

4 301 335 580

Estructura determinada por

X-Ray

Ejemplo de Modelado integrativo y mapeo de topología de membrana

PONER A PRUEBA, EXPERIMENTALMENTE, LA TOPOLOGÍA

Ejemplo de Modelado integrativo y mapeo de topología de membrana

Thorben et al. Computational and Structural Biotechnology Journal (2012)

eGFP fusionada a un bucle localizado en el CITOPLASMA:

Emisión de fluorescencia

eGFP fusionada a un bucle localizado en el PERIPLASMA:

NO emission de fluorescencia

Wavelength (nm)500 520 540 560 580 600

Re

lati

ve

Flu

ore

sce

nce

(A

U)

0

5

10

15

20

MecR F1

MecR F2

MecR F3

MecR F4

MecR F5

MecR F6

MecR F7

citoplasma

periplasma

Ejemplo de Modelado integrativo y mapeo de topología de membrana

Ensayos con células de E. coliintactas.

Topología de proteínas transmembrana Fusiones a EGFP + susceptibilidad a Proteinasa K

citoplasma

periplasma

Ensayos con esferoplastos (células de E. coli con la membrana

externa permeabilizada), queexponen los bucles

periplasmaticos a la Proteinasa Kagregada a la suspensión,manteniendo los bucles

citoplasmáticos protegidos(membrana interna intacta).

CORREGIR LA TOPOLOGÍA

ENSAYOS DE FLUORESCENCIA + SUSCEPTIBILIDAD A PROTEINASA K

Topología de proteínas transmembrana Fusiones a EGFP + susceptibilidad a Proteinasa K

X-ray structures of

Sensor domain are

available

INTEGRATIVE MODEL OF FULL-LENGTH MecR1

One of the apo-protein structures of the sensor domain of MecR1 wasdocked on the model of the protease domain using published NMR dataabout interactions of the L2 loop with the sensor domain, and under theconstrain of the primary structure.

MecR1 (Pfam)

4 301 335 580

Estructura determinada

por X-Ray

Ejemplo de Modelado integrativo y mapeo de topología de membrana

• Mary Luckey, Membrane Structural Biology with Biochemicaland Biophysical Foundations, Cambridge University Press(2008):

Capítulo 4 Capítulo 6 – Sección: Bioinformatics Tools for Membrane Protein Families

Capítulo 7 – Secciones: - Folding alfa-Helical Membrane Proteins; Folding

Studies Beta-Barrel Membrane Proteins

BIBLIOGRAFIA