axón de jibia 2 de abril de 2007 clases/voltageclampk.ppt 04/04/2007 03:11:36 p.m

Axón de jibia

2 de abril de 2007

http://einstein.ciencias.uchile.cl/Fisiologia2007/Clases/VoltageClampK.ppt

04/04/2007 03:11:36 p.m.

Go to 46

Axón de jibiaElectrodo que inyecta corriente Vx(t)

+

_

oElectrodos para medir el potencial

Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón.

Circuito con realimentación negativa:VO = V+

Estímulo en de 25 A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0.

Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.

0.00 ms

0.04 ms

Estímulo en de 25 A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0.

Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.

0.12 ms

Estímulo en de 25 A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0.

Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.

0.52 ms

Estímulo en de 25 A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0.

Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.

1.00 ms

1.24 ms

1.88 ms

2.28 ms

2.92 ms

3.72 ms

4.60 ms

5.48 ms

6.44 ms

8.04 ms

8.84 ms

9.80 ms

10.76 ms

12.52 ms

15.12 ms

Axón de jibiaElectrodo que inyecta corriente Electrodos para medir

el potencial

Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón.

Vx(t)

En cada punto del axón pasa algo diferente, esto complica el análisis, tratemos de simplificar eliminando la variable espacio

Eliminando la variable espacio

Electrodo que inyecta corriente Vx(t)

La placa de tierra asegura que la resistencia del medio externo sea muy chica. Ro = 0

El alambre axial asegura que la resistencia del medio interno sea muy chica. Ri = 0.

oi

m

RR

R

2

¿Qué valor toma la constante de espacio?

Eliminando la variable espacio

Electrodo que inyecta corriente

El potencial de acción no se propaga. Se llama potencial de acción de membrana.

V (t)

Electrodo que mide potencial

A todo lo largo del axón pasa exactamente lo mismo, esto simplifica el análisis. Desaparece la variable espacio (Space clamp).

Potencial de acción de membrana

Space clampElectrodo que inyecta corriente

Vi (t)

PERO mientras esté circulado corriente por el electrodo de tierra no sabemos el potencial extracelular

Necesitamos otro electrodo para medir el potencial extracelular.

Electrodo que mide potencial intracelular

Space clamp

Necesitamos otro electrodo para medir el potencial extracelular.

Vi (t)

Electrodo que mide potencial intracelular

Ve (t)

Electrodo que inyecta corriente

Electrodo que mide el potencial extracelular

Medida de Vm

Vi (t)

Ve (t)

Medida de Vm

Vi (t)

Ve (t)

R R

0 V

RVi /0 RVi /0

-Vi

RVe /

Medida de Vm

Vi (t)

Ve (t)

R R

-Vi

R R

0 V

RVi /

Vi -Ve R

Vm

? RViVe /

Space clampElectrodo que inyecta corriente

Vm (t)

Electrodo que mide potencial intracelular

Electrodo que mide el potencial extracelular

Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp)

Vcomando

El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.

Voltage clamp

Vm

Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp)

El potencial de la membrana es igual al comando.

El ampérmetro A mide la corriente que pasa por 1 cm lineal de axolema.

A

Voltage clamp

Vcomando

Vm

Extracelular Intracelular

Voltage Clamp

Cim III

Extracelular

Intracelular

Vm

Rm

Vr

Cm

Im

Ii IC

dt

dVC

R

VVI m

m

rmm

Vm

Tiempo

Im

Vr

Voltage clamp de un circuito pasivo

Cim III

dt

dVC

R

VVI m

m

rmm

Vm

Tiempo

Im

Vr

Voltage clamp de un circuito pasivo

Extracelular

Intracelular

Rm

Vr

Cm

Im

Ii IC

Cim III

Vm

TiempoIm

Vr

Eliminando la corriente capacitiva

dt

dVC

R

VVI m

m

rmm

XX

Extracelular

Intracelular

Rm

Vr

Cm

Im

Ii IC

VNa

GNa GK

VK

Extracelular

Intracelular Vm

)( NamNaNa VVGI )( KmKK VVGI

KNam III

INa IK

Im

0)( 54 mNaNa VGI)0( 94 mKK VGI

NaKm GGI 5494

Corrientes iónicas a Vm = 0 en un circuito con dos vías paralelas

Vm

Tiempo

Im

Vm=Vr

Vm=0

I, mA/cm2

t, ms

Voltage clamp de un axón de jibia

NaNaNaKKKm gpNgpNI 5494

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494

-60,8mV0mV

)0()0( NaNaKKm VGVGI

dtdV

CVVGVVGI mNamNaKmKm )()(

FUGU es un plato japonés que se prepara con la carne del pez globopufferfish (especies Takifugu, Lagocephalus, or Sphoeroides) o del pez puercoespín (género Diodon) . Debido a que el pez globo es un letalmente venenoso si se prepara en forma incorrecta, el fugu es el plato más celebrado y famoso de la cocina japonesa.

Reino: AnimaliaFilo: ChordataSubfilo: VertebrataClase: ActinopterygiiOrden: TetraodontiformesFamilia: TetraodontidaeGénero: TakifuguAbe, 1949

FUGU

Tetrodotoxin (anhydrotetrodotoxin 4-epitetrodotoxin, tetrodonic acid, TTX) es una neurotoxina sin un antídoto conocido. Bloquea los potenciales de acción en los nervios uniéndose a los canales de sodio rápidos de las membranbas celulares de los nervios.

El Dr. Yoshizumi Tahara la aisló en 1909 y la llamó tetrodotoxina, nombre derivado de Tetraodontiformes, el orden al que pertenece el pez globo.

I, mA/cm2

t, ms

-60,8mV0mV

Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494 KtVKKK gpNI ),(94

Control

TTX

I, mA/cm2

t, ms

-60,8mV0mV

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494

La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.

KtVKKK gpNI ),(94NatVNaNaNa gpNI ),(54

Extracelular Intracelular

Voltage Clamp

dtdV

CVVGVVGI mNamNaKmKm )()(

GNa y GK son funciones de Vm y t

Canales de potasio de axón de jibia

5 de abril de 2007

http://einstein.ciencias.uchile.cl/Fisiologia2007/Clases/VoltageClampK.ppt

I, mA/cm2

t, ms

Voltage clamp de un axón de jibia

-60,8mV0mV

dt

dVCVVGVVGI m

NamNaKmKm )()(

I, mA/cm2

t, ms

-60,8mV0mV

Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na

Control

TTX

dt

dVCVVGVVGI m

NamNaKmKm )()(

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-150 -100 -50 0 50 100 150

Conductancia GK?

)( KmKK VVGI

Potencial de inversión, VK?

Vm, mV

I K, m

A c

m-2

y = 0.0434x + 1.6983

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-150 -100 -50 0 50 100 150

Conductancia GK?

)( KmKK VVGI

Potencial de inversión, VK?

?Vm, mV

I K, m

A c

m-2

-39.1 mV

GK = 43.4 mS cm-2

VK = -39.1 mV

y = 0.0434x + 1.6983

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-150 -100 -50 0 50 100 150

Conductancia GK?

)( KmKK VVGI

Potencial de inversión, VK?

?Vm, mV

I K, m

A c

m-2

-39.1 mV

GK = 43.4 mS cm-2

VK = -39.1 mV

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-150 -100 -50 0 50 100 150

Conductancia GK?

)( KmKK VVGI

Potencial de inversión, VK?

Vm, mV

I K, m

A c

m-2

Estrategia para buscar el potencial de inversión VK.

Sospecha: VK = -94 mV

Problema: alrededor de -94 mV no se registra inversión de la corriente. ¿Por qué?Porque los canales están cerrados a -94 mV.

Solución: 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.

Vm, mV

IK,

mA

/cm

2

Los canales de K obedecen a la ley de Ohm:

)( KmOKK VVPNgI

La PO de la ecuación es la probabilidad de encontrar el canal abierto a 0 mV.

VK=-73.4 mV

Sorpresa: El valor encontrado es mayor que -94mV, el esperado según Nernst.

Explicación: Los canales de K no son idealmente selectivos: pasa algo de Na.

Tarea: Calcular GK/GNa para estos canales

Vm, mV

IK,

mA

/cm

2

VK=-73.4 mV

)( KmKK VVGI

VK=-73.4 mV

)( KmKK VVGI

Km

KK VV

IG

Vm, mV

IK,

mA

/cm

2

OKK PNgG )1/(1 )/)(( 0 RTVVzF

OmeP

No. La forma de la curva no corresponde a una función de Boltzmann.

Extracelular

Intracelular

Bicapa

Estructura de los canales dependientes de voltaje.

1 2 4 5 6

1

2 3

45

6

Shrivastava, I. H., Durell, S. R. & Guy, H. R. (2004) Biophys. J. 87, 2255–2270.

Más detalles estructurales en (tema de seminario):

P loop

+ +

+ +

Vm = +60 mV Vm = -60 mV

Posible movimiento del segmento S4 impulsado por las diferencias de potencial eléctrico.

Despolarizar

Hiperpolarizar

Compuerta abierta Compuerta cerrada

Filtro de selectividad ( Na, K, Ca )

Aggarwal,. & MacKinnon. (1996) Neuron 16, 1169–1177.

Larsson, et al 1996. (1996) Vol. Neuron, 16, 387–397,

Papers para seminarios sobre este punto:

Los canales de K son tetrámeros.

Cada monómero tiene su propio sensor de potencial: es el segmento S4 que tiene varios residuos de arginina.

Los sensores de potencial tiene dos estados: reposo y activo

Los sensores de potencial operan en forma independiente.

El canal se abre sólo cuando los cuatro sensores de potencial están activos.

Sea n la probabilidad de encontrar un sensor activo

La probabilidad de encontrar un canal abierto es... n4

)-V(VnNgI KmKK4

)-V(VngNI KmKKK4

4ngNG KKK

)1( nndt

dnnn

nn

nn

ntt ennnn /

0 )(

nnn

1

)/),((

1

1RTnoVmVFnz

en

nn

nn

ntt ennnn /

0 )(

nnn

1

)/),((

1

1RTnoVmVFnz

en

)-V(VngNI KmKKK4

4

max4

)/),((

1

1

RTnoVmVFnz

eGngNG KKKK

4

max

)/),((

1

1

RTnoVmVFnz

eGG KK

Vm, mV

GK,

mS

/cm

2 Resultado de Solver:GK

max = 34 mS/cm2

V0,n = -51.6 mVzn = 1.2

4, ngNG KKK

4,

KK

K

gN

Gn

n

Vm, mV

Medición de la probabilidad de encontrar los canales abiertos

usando el análisis de las corrientes de cola.

Vm, mV Vm, mVG

K,

mS

/cm

2

IKcola@-60mV, mA/cm2 GK mS/cm2I K

cola@

60m

V, m

A/c

m2

Medición de la probabilidad de encontrar los canales abiertos usando el análisis de las corrientes de cola.

La corriente de cola es la medida a -60 mV, siendo la probabilidad de encontrar abiertos los canales igual a la correspondiente a Vm

Cinética

ntt ennnn /

0 )(

4/0 )( nt

tO ennnP

nt

tO ennnP /0

4 )(

)()()(4/

0 Kmt

KKK VVennngNtI n

Tarea: Demuestre que la corriente de cola decae exponencialmente para el caso en que n = 0.Relacione la constante de tiempo de la corriente de cola con n cuando n = 0.

40 mV

-140 mV

4/0 )()( nt

KK ennnNgtG

40 mV

-140 mV

ntKK ennnNgtG /

044 )()(

¿Cómo determinar n?

40 mV

-140 mV

n a diferentes voltajes

nnn

1

n a diferentes voltajes

nn

nn

nnn

1

nn

n

n

n

n

1Demostrar que:

n y n a diferentes voltajes

1

5001.0

10

50

mVm

n

e

V80

60

125.0mV

n e

Demostar que n =0,1 para límite Vm -50 mV

ntt ennnn /

0 )(

)()()(4/

0 Kmt

KK VVennnNgtI n

Ngk = 34 mS/cm2 VK = -74,2 mV

Descripción completa de los canales de K del axón de jibia

nn

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 5 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV.

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 1 ms de repolarizar desde 0 mV a -60 mV.