axón de jibia 15 de abril de 2010 cursos_2010 fisiologÍa general

Axón de jibia

15 de abril de 2010

http://einstein.ciencias.uchile.clCURSOS_2010 FISIOLOGÍA GENERAL

Eliminando la variable espacio

Alambre axial

La placa de tierra asegura que la resistencia del medio externo sea muy chica. Ro = 0

El alambre axial asegura que la resistencia del medio interno sea muy chica. Ri = 0.

oi

m

RRR

2

¿Qué valor toma la constante de espacio?

Vm

Electrodo que mide potencial

Space clamp

Vm

Generador de corriente

El potencial de acción no se propaga. Se llama potencial de acción de membrana.

A todo lo largo del axón pasa exactamente lo mismo, esto simplifica el análisis. Desaparece la variable espacio (Space clamp).

Space clamp

Vm

Generador de corriente

Pero si queremos medir en forma correcta el potencial de membrana tenemos un problema porque mientras esté circulado corriente por el electrodo de tierra no sabemos el potencial eléctrico en la superficie externa de la membrana.

Necesitamos otro electrodo para medir el potencial extracelular.

Potencial de acción de membrana

Potencial de acción de membrana

1Vs2008.0

150 msmV

dtdV

26 Acm 20010200 dtdV

cII KNa

dt

dVCIII m

NaKm dt

dVCII m

NaK 0

Vi, mV

IIones, mAcm-2

t, ms

Intensidad de las corrientes iónicas

dt

dVCII m

NaK

Potencial eléctrico intracelular

IIones, mAcm-2I R

V = 0

V = 0-IR

Electrodo de tierra

Superficie de la membrana

Vi, mV

RoIIones, Vo, mV

t, ms

t, ms

Potencial eléctrico intracelular

Potencial eléctrico extracelular

El potencial de acción aparece en el medio extracelular cono una espiga negativa y de pequeña amplitud. Esta es la base de los registros extracelulares de la actividad neuronal.

Space clamp

Vm

Generador de corriente

Ve

Vi

Ve

Vi, mV

Ve, mV

t, ms

t, ms

Medida de Vm

Medida de Vm

Vi

Ve

R R

0 V

RVi /0 RVo /0

-Vi

Ver en einstein.ciencias.chile.cl Fisiologia General 2008, Lecturas,Circuitos con amplificadores operacionales.

RVe /

Medida de Vm

Vi (t)

Ve (t)

R R

-Vi

R R

0 V

RVi /

Vi -Ve R

Vm

? RVo /0

Current clamp

Vm

Generador de corriente

Con este circuito puedo controlar la corriente y medir el potencial. Current clamp.

Vm

Con este circuito puedo controlar el potencial. ¿Cómo podría medir la corriente?

Vcomando

El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.

Voltage clamp

Vm

Con este circuito puedo controlar el potencial y medir la intensidad de la corriente. Voltage clamp.

VcomandoRf

-IRf

Voltage clamp

El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.

Vm

Con este circuito puedo controlar el potencial y medir la intensidad de la corriente. Voltage clamp.

VcomandoRf

-IRf

Voltage clamp

El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.

Cim III

Extracelular

Intracelular

Vm

Rm

Vr

Cm

Im

Ii IC

dt

dVC

R

VVI m

m

rmm

Vm

Tiempo

Im

Vr

Voltage clamp de un circuito pasivo

Cim III

dt

dVC

R

VVI m

m

rmm

Vm

Tiempo

Im

Vr

Voltage clamp de un circuito pasivo

Extracelular

Intracelular

Rm

Vr

Cm

Im

Ii IC

Cim III

Vm

TiempoIm

Vr

Eliminando la corriente capacitiva

dt

dVC

R

VVI m

m

rmm

XX

Extracelular

Intracelular

Rm

Vr

Cm

Im

Ii IC

Vm

Vcomando

Rf

V0 = -IiRf

Voltage clamp, resta de la corriente capacitiva

R R

-Vcomando

Cm

dtdV

CI mmi

dtdV

C mm

iI0 V

Ajustar hasta que se cancele la corriente capacitiva

iI

I, mA/cm2

t, ms

Voltage clamp de un axón de jibia

NaNaNaKKKm gpNgpNI 5494

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494

-60,8mV0mV

)0()0( NaNaKKm VGVGI

dt

dVCVVGVVGI m

NamNaKmKm )()(

I, mA/cm2

t, ms

-60,8mV0mV

Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494 KtVKKK gpNI ),(94

Control

TTX

I, mA/cm2

t, ms

-60,8mV0mV

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494

La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.

KtVKKK gpNI ),(94NatVNaNaNa gpNI ),(54

Canales de potasio del axón de jibia

Pulso -120 a 100 mV

Vm

El curso temporal del desarrollo de la corriente de potasio no sigue un curso exponencial.

Para estudiar la relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana se mide a diferentes potenciales.

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-150 -100 -50 0 50 100 150

Conductancia GK?

)( KmKK VVGI

Potencial de inversión, VK?

Vm, mV

I K, m

A c

m-2

Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.

y = 0.0434x + 1.6983

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-150 -100 -50 0 50 100 150

Conductancia GK?

)( KmKK VVGI

Potencial de inversión, VK?

?Vm, mV

I K, m

A c

m-2

-39.1 mV

GK = 43.4 mS cm-2

VK = -39.1 mV

Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.

y = 0.0434x + 1.6983

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-150 -100 -50 0 50 100 150

Conductancia GK?

)( KmKK VVGI

Potencial de inversión, VK?

?Vm, mV

I K, m

A c

m-2

-39.1 mV

GK = 43.4 mS cm-2

VK = -39.1 mV

Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

-150 -100 -50 0 50 100 150

Conductancia GK?

)( KmKK VVGI

Potencial de inversión, VK?

Vm, mV

I K, m

A c

m-2

Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.

Estrategia para buscar el potencial de inversión VK.

Sospecha: VK = -94 mV

Problema: alrededor de -94 mV no se registra inversión de la corriente. ¿Por qué?Porque los canales están cerrados a -94 mV.

Solución: 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.

Vm, mV

IK,

mA

/cm

2

Prepulso constante

Pulso de prueba variable

Vm

1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.

VK = -73,4 mV

Sorpresa: El valor encontrado, -74 mV es menos negativo que el esperado según Nernst (-94mV).

Una explicación posible: los canales de K no son idealmente selectivos: pasa algo de Na.

Tarea: Calcular GK/GNa para estos canales

VK = -73,4 mV

El potencial de reposo es -60 mV, los potenciales de inversión de las corrientes de potasio y leak son -73 y -50 mV respectivamente. Calcule la razón GK/GLeak para el potencial de reposo.

Vm, mV

IK,

mA

/cm

2

VK=-73.4 mV

)( KmKK VVGI

VK=-73.4 mV

)( KmKK VVGI

Km

KK VV

IG

Vm, mV

IK,

mA

/cm

2

AVISO:SEMINARIOS DE ESTUDIANTES

Forme un grupo de tres estudiantes para la presentación de su seminario.

Cada grupo debe mandar una carta a bacigalu@uchile.cl declarando el artículo escogido, los integrantes del grupo, y la dirección electrónica de contacto del grupo.

Antes de elegir el paper, revise en la página del curso ( http://cursos.ciencias.uchile.cl ) el archivo LISTA DE PAPERS PARA SEMINARIOS, en que están indicados los papers ya seleccionados y aquellos aún disponibles.

En la página del curso ( http://cursos.ciencias.uchile.cl ) hay una carpeta que contiene las versiones PDF de todos los papers para seminarios.

Si Ud. encontrara un paper que le interese y que no esté incluido en la lista, puede proponérselo al coordinador del curso y será incorporado si se considera adecuado.

Espere confirmación a vuelta de correo.19 de Abril de 2010

19 de Abril de 2010

Continuación de la clase de canales de potasio del axón de jibia.

Prepulso -100 a 200 mV

Pulse de prueba -100mV

La conductancia se puede medir de la intensidad de la corriente instantánea de la cola, dividida por el potencial del pulso de prueba menos el potencial de inversión de la corriente.

Determinación de la conductancia del potasio a partir de la intensidad instantánea de la corriente de cola.

100

100@,

K

KK V

IG

100mV- a medida mA/cm 939.0 2KmaxI

Scm 0.0353 mV 4.73100

mA/cm 939.0 2-2

KKmax NgG mScm 35.3 -2KmaxG

Intensidad instantánea de la corriente de cola medida a -100 mV después de prepulsos de diferentes voltajes.

)-V(VpgNI KmVKkKK ),( ),(),(

max,

VKKK

VKKK

K

K pgN

pgN

I

I

Kp

NB. Para sacar pK(v,) del análisis de las corrinentes de cola, no hace falta conocer el potencial de inversión de la corriente.

pK(v,) es la probabilidad de encontrar abierto el canal de potasio, al potencial del prepulso, y en estado estacionario.

Los canales de K son tetrámeros.

Cada monómero tiene su propio sensor de potencial: es el segmento S4 que tiene varios residuos de arginina.

Los sensores de potencial tiene dos estados: reposo y activo

Los sensores de potencial operan en forma independiente.

El canal se abre sólo cuando los cuatro sensores de potencial están activos.

Sea n la probabilidad de encontrar un sensor activo

La probabilidad de encontrar un canal abierto es... n4

KmKK -VVnNgI 4

KmKK -VVnNgI 4 4n

I

I

Kmax

K

NB. n es función del voltaje y del tiempo. n sólo es función del voltaje. Es el valor de n en estado estacionario: cuando se aplica un potencial por mucho tiempo.

4n

4

maxII

KmKK -VVnNgI 4 4nII

Kmax

K

n

KmKK -VVnNgI 4 4nII

Kmax

K

RT

VVzF m

e

n0

1

1

V0 = -46 mVz = 1.4

)-V(VnNgI KmKK4 4n

II

Kmax

K

RT

VVzF m

e

n0

1

1

V0 = -47 mVz = 1.8

Errores pesados por 1/n

n

)-V(VnNgI KmKK4 4n

II

Kmax

K

RT

VVzF m

e

n0

1

1

V0 = -48 mVz = 1.2

Errores pesados por n

La curva n vs Vm no se ajusta bien a una función de Boltzmann.

n

Cinética

ntennntn /)()0()()( KmKK -VVnNgI 4

KmKK -VVtnNgtI 4)()(

Kmt

KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(

Caso n(0)=0, el curso temporal de la corriente es sigmoideo

Kmt

KK -VVenNgtI n4/4 1)()(

Caso n(∞)=0, el curso temporal de la corriente es exponencial

Kmt

KK -VVenNgtI n/44)0()(

Vm-140mV

0 mV -100mV

Kmt

KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(

Determinación de n.

Kmt

KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(

Paso desde -140 mV a 0 mV Paso desde 0 mV a -100 mV

Kmt

KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(

= 1.8 ms

Paso desde -140 mV a 0 mV Paso desde 0 mV a -100 mV

= 1.8 ms = 4.7 ms

Kmt

KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(

Paso desde -140 mV a 0 mV Paso desde 0 mV a -100 mV

La constante de relajación n en función del potencial

RTVVxzF me /)(0

0

RTVmVxzFRTVmVzFx ee /)0(/)0()1(0

1

RTVVzFx me /)(10

0

RTVmVzFRTVmVzF ee 2/)0(2/)0(0

1

0

0

22/)(sech

RTVVzF m

xx eex

2sech

Para el caso x = 0.5

0

0

22/)(sech

RTVVzF m 6)( Vo75Vo083.012/10

2.1z

0

0

22/)(sech

RTVVzF m 6)( Vo75Vo083.012/10

2.1z

0

0

22/)(sech

RTVVzF m 5.78Vo088.00

1.1z

La curva n vs Vm no se ajusta bien a una función secante hiperbólica.

Cálculo de a y b a partir de Po() y t

)(Po

1

)(Po

)(1 Po

1

5001.0

10

50

mVm

n

e

V80

60

125.0mV

n e

ms-1

n n

Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley 1952. Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.

Calcule n para el límite Vm-50 mV

Ngk = 35.3 mS/cm2 VK = -73,4 mV

Descripción completa de los canales de K del axón de jibia

nn

Kmt

KK -VVennnNgtI n4/)()0()()(

1

5001.0

10

50

mVm

n

e

V80

60

125.0mV

n e

nnn

1

nn

nn

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 5 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV.

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 1 ms de repolarizar desde 0 mV a -60 mV.

Canales de sodio del axón de jibia

I, mA/cm2

t, ms

-60,8mV0mV

NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494

La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.

KtVKKK gpNI ),(94NatVNaNaNa gpNI ),(54

-60 mV

0 mVVm

La corriente de Na presenta inactivación

Con el uso de TTX se puede aislar la fracción de la corriente llevada por los canales de sodio.

-60 mV

0 mVVm

La corriente de Na presenta inactivación

30 mV

Procedimiento para demostrar que los canales de sodio cumplen la ley de Ohm y encontrar el potencial de inversión de la corriente

VNa = 41.2 mV

Los canales de sodio cumplen la ley de Ohm

Sorpresa: El valor encontrado, 41 mV es menos positivo que el esperado según Nernst (54 mV).

Una explicación posible: los canales de Na no son idealmente selectivos.Calcule la razón GNa/GK para estos canales

Figure 13.29. Ball-and-Chain Model for Channel Inactivation. The inactivation domain, or "ball" (red), is tethered to the channel by a flexible "chain" (green). In the closed state, the ball is located in the cytosol. Depolarization opens the channel and creates a negatively charged binding site for the positively charged ball near the mouth of the pore. Movement of the ball into this site inactivates the channel by occluding it. [After C. M. Armstrong and F. Bezanilla. J. Gen. Physiol. 70(1977):567.]

El modelo de bola y cadena para la inactivación de los canales de sodio

Topología de un canal de sodio membrana

http://nerve.bsd.uchicago.edu/Na_chan.htm

Inactivation Gate

-60 mV

0 mV

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(

Tratando los axones con pronasa se puede estudiar la activación sin interferencia de la inactivación

-60 mV

0 mV

-40 mV

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(

Procedimiento para determinar la conductacia de los canales.

INa,max = -9.38 mAcm-2 a -40 mV

GNa,max = 116 mS cm-2

VNa = 41.2 mV

40

40max@,,

Na

NaNamaxNa V

INgG

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(

),( VNap

),(),(

VNa

NaNa

VNaNaNa

Na,max

Na pgN

pgN

I

I

La función pNa(V,) no se puede ajustar bien con una función de Boltzmann

-40 mV

0 mVVm

-60 mV

Cinética de la activación

x = 1Suma de cuadrados = 8.0

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x

Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(

La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial

elevada a la cuarta potencia.

x = 2Suma de cuadrados = 0.14

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x

Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(

La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial

elevada a la cuarta potencia.

x = 3Suma de cuadrados = 0.00

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(x

Na tmp )( ntemmmtm /)()0()()(

La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. Lo simulamos usando una función exponencial elevada a la tercera potencia.

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa

ntemmmtm /)()0()()(

Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa

ntemmmtm /)()0()()(

Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.

m (0 mV) = 0.27 ms

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa

ntemmmtm /)()0()()(

Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.

m (0 mV) = 0.27 ms m (-40mV) = 0.48 ms

Tau m en función del voltaje

La curva n vs Vm no se ajusta bien a una función secante hiperbólica.

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(

),( VpNa

3)(tmpNa

Como ya sabemos la relación entre pNa y m podemos calcular de m(∞)

m()

3 ),( VpNa

NamNaNaNa VVtVpNgtI ),()(3)(tmpNa

La curva m parece que se ajusta bien a una función de Boltzmann.

Como ya sabemos m y tau podemos calular alfa y beta

mmm

mm

mm

1

)(

m y m a diferentes voltajes

1

351.0

10

35

mV

mm

e

V

18

60

4mV

m e

Calcule m para el límite Vm -35 mV

Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley 1952. Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.

La inactivación.

NamNaNa VVhmNgtI 3)(

La variable h representa probabilidad de que los canales NO estén inactivados.Para h = 1 los canales no están inactivados.Para h = 0 los canales están inactivados

La probabilidad de encontrar un canal conduciendo es m3h

-60 mV0 mV

NamNaNa VVhmNgtI 3)(

Procedimiento para determinar h infinito en función del voltaje-

Potencial de mantención variable

Pulso de prueba fijo en 0 mV

Medir la corriente en el mínimo.

NamNaNa VVhmNgtI 3)(

NamNaNa VVhmNgtI 3)(

h()

hVVmNg

VVhmNg

I

I

NamNa

NamNa

Na,max

Na3

3

La curva h parece que se ajusta bien a una función de Boltzmann.

-100 mV

-60 mV -40 mV-60 mV

Determinación de h mediante ajuste de curvas al curso temporal de la corriente de sodio

NamNaNa VVhmNgtI 3)( ntemmmtm /)()0()()(

htehhhth /)()0()()(

-100 mV

-60 mV -40 mV-60 mV

h = 3.4 ms

NamNaNa VVhmNgtI 3)( ntemmmtm /)()0()()(

htehhhth /)()0()()(

-60 mV -60 mV

0 mV 0 mV

Procedimiento para determinar h midiendo el curso temporal del escape de la inactivación

Procedimiento para determinar h midiendo el curso temporal del escape de la inactivación

h = 8.2 ms

Procedimiento para determinar h midiendo el curso tempooral del escape de la inactivación

Tau h en función del voltaje

La curva h vs Vm no se ajusta bien a una función secante hiperbólica.

Como ya sabemos m y tau en función de Vm, podemos calcular alfa y beta

hhh

hh

hh

1

)(

20

60

07.0mV

h e

1

1

10

30

mVh

e

Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley 1952. Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

-150 -100 -50 0 50 100 150

)(3NamNaNaNa VVhmgNI

NNagNa = 120 mS/cm2

h

m

h, ms

m, ms

VNa = 41,1 mV

Vm, mV Vm, mV

Vm, mVVm, mV

Calcular la fracción de canales de sodio abiertos después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Calcular la fracción de canales de sodio inactivados si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 m.

Calcular la fracción de canales de sodio inactivados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Calcular la fracción de canales de sodio cerrados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Potencial de reposo, segunda visita

Vm

IK

INa

IL

IC

Im

CLNaKm IIIII En el potencial de reposo Im = 0 e IC = 0

LNaK III 0

Vm

IK

INa

IL

IC

Im

LrLNarNaKrK VVGVVhmGVVnG 3max4max0

La tarea ahora es buscar un Vr se satisfaga esta ecuación.

2-max

2-max

-2

mScm 0,3 -50.1mV

mScm 120 mV 41.1

mScm 36 -73.3mV

LL

NaNa

maxKK

GV

G V

GV

LNaK III 0

El problema lo puedo resolver porque conozco n, m y h en función de Vm.

Vm ,(mV)

h

m

n

Celda Objetivo

Celda a ajustar para que la celda objetivo sea cero Solver:

Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero.

Mapshow2010.xls

Solver:

Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero.

Este es el Potencial de Reposo.

El potencial de acción de membrana

Computación de la trayectoria

m

LNaKm

C

III

dt

dV

tdt

dVVtV m

mm )(

Vm, n, m y h son los valores iniciales de la trayectoria. Con estas corrientes se calcula la derivada dVm/dt

Ahora calculo el nuevo Vm

)(4KmKKK VVngNI

)(3NamNaNaNa VVhmgNI

)( LmLL VVGI

Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm a Vm(t) por t unidades de tiempo.

Computación de la trayectoria

m

LNaKm

C

III

dt

dV

tdt

dVVtV m

mm )(

Con estos nuevos valores de Vm, n, m y h y las ecuaciones de las corrientes calculo la derivada dVm/dt

Ahora calculo el nuevo Vm

Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm a Vm(t) por t unidades de tiempo.

Mostar Mapshow

Repito estos pasos para calcular toda la trayectoria de Vm(t)...

19 de Abril de 2010

Fin de la clase de canales de potasio del axón de jibia.