alergia molecular., algunos conceptos personales

Dr. Tomás Velarde DomínguezEscuela Médico Militar

Hospital Central Militar, Cda. México. Hospital. Lic. Adolfo López Mateos ISSSTE

Unidad de Especialidades Médicas SEDENA

¿El diagnóstico molecular puede cambiar el abordaje de la alergia alimentaria y por aeroalergenos?

S

SS

IgE

Identificar, aislar y purificar múltiples alérgenos.Técnicas de DNA recombinante (Nanotecnología)

Micromatrices ( microarrays)

Ello permite hablar de:

DIAGNÓSTICO MOLECULAR O DIAGNÓSTICO POR COMPONENTES (component-resolved-diagnosis CRD)

El papel del especialista en Alergología, bajo el conocimiento actual, es establecer el riesgo potencial de enfermedad alérgica, situación difícil de determinar, y que requiere un continuo entrenamiento y años de experiencia clínica.

Dr. Tomás Velarde Domínguez.

Tie

mp

o

RIESGO

Severidad de los síntomas (afección en calidad de vida)

Detección precoz de la enfermedad alérgica…

No sensibilizado

IgE normal IgE elevada Sensibilizado

Piel-digestivo-Respiratorio(Marcha Alérgica)

Interesantes expectativas.

Miniaturización del diagnóstico en Alergia.

Sueño de conocer la especificidad molecular IgE en cada paciente.

Diagnóstico refinado.

Múltiples perfiles de sensibilización.

Predecir reacciones severas y la evolución de las mismas.

Inmunoterapia más precisa

Dr. Blakely1893

Prueba cutánea

Von Pirquet1906

Toxina Caballo

Sir Henry DaleHistamina 1910

Dr Leonard Noon1910

Vacunas hiposensibilizantes

1966IgE

Ishizaka / Johansson

1908 Mantoux

1921 primer extracto estandarizado

1924Lewis y Grant

pruebas por punción

1970Pepys modifica la prueba cutánea

1967Pharmacia

1970Phadebast amylase

test

1971Allergon

B

1972Phadeba

st IgE test

1974Phadebast

Rast(IgEs)

1976Pharmacia DiagnosticIgE PRIST

1981Phadezym RAST

1986Wallac OyPhadiatop

1989Immunocap

1990Procordia /

Kaby

1995Fusión con

Upjohn 1995

Immunocap100

AutomáticoPharmacia &

Upjohn Diagnostic

1990Procordia /

Kaby

1997Varelisa Elias

Autoinmunidad Immunocap

2000Micromatices

2009ISAC

2010Phadia 2500 5000

2011

PANALERGENOS

Proteínas ligadoras de calcio,Homólogos del alérgeno mayordel abedul,Determinantes de hidratos de Carbono y las profilinas

DILEMA DE LA POLISENSIBILIZACIÓN…!PROBLEMA FRECUENTE EN ALERGIA!

¿Es sensibilización independiente?, es decir cada alérgeno es responsable de la enfermedad clínica.

IgE muy elevada y entonces ¿toda ella se fija de manera inespecífica?

Fenómeno de reactividad cruzada.

La alergia vista desde el enfoque molecular:

POLISENSIBILIZACIÓN

≥ 3 Alergenos no relacionados 36% Población infantil

DIFERENTES INMUNOENSAYOS MARCADOS…….FA

SE

SO

LID

A /

LÍQ

UID

A Ag

IgE

Conjugado marcado

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)

ENZIMOINMUNOENSAYO(EIA)

FLUOROINMUNOENSAYO(FIA)

QUIMIOINMUNOENSAYO(QIA

Nomenclatura de los alérgenos ( Marsh,Lowestein.,Platts-Mills,1980)

Primeras 3 letras del género, primera de la especie y No. de identificación:

Felis domesticus 1: Fel d 1Ambrosia artemisiflora 1: Amb a 1

Isoalergeno: Tamaño, f, y > 67% secuencia a.a. Ejem: Amb a 1. 01

Isoforma: > 97% homología secuencial: Ejem: Amb a 1.01 01, Amb a 1.01 02

Epítope 1

Epítope 2

Sitio de corte enzimático

Epítope 1

Epítope 2

Secuenciales Conformacionales

La reactividad cruzada requiere al menos un 70% de estructura conformacional.

Epítope 1 Epítope 2

La reactividad cruzada requiere al menos un 70% de estructura conformacional.

Gal d 4 (lizosima

Gal d 1 Alta estabilidad térmica , difícil desnaturalizar, 11% proteína de la clara

Gal d 2 54% proteína clara. Resistente a la digestión por la pepsina a pH 1.2, lábil al calor y se desnaturaliza a 90 grados

Gal d 3 Ovotransferrina 12% clara, lábil al calor a 95 grados por 15 min.

Gal d 4 3.4% clara termolábil a 80 grados, resistente a pepsinas

Gal d 5 14% proteínas de la yema , relacionado s. ave-huevo, cruza con OVOTRANSFERRINA, termolábil a 90 grados 30 min.

Gal d 6 resiste calor, lábil a pepsina

Gal d 2 Ovoalbúmina

Gal d 1

(ovomucoide)

Gal d 3

Ovotransferrina

Gal d 5 alfalivetina

Gal d 6 (Vitelogenina)

Alergeno

Literatura experimental

Secuencia Pruebas Immunoblott

Prueba de función

(degranulación basófilos)

Prueba cutánea

Prueba reto conjuntival

Prueba reto

nasal

Prueba reto

bronquial

Reto oral

Datos epidemiología

Monitoreo tiempo real sensibilización IgE

Gal d 1

Gal d 2

Gal d 3

Gal d 4

Gal d 5

Gal d 6

Alergeno Literatura experimental

Secuencia Pruebas Immunoblott

Prueba de función

(degranulación basófilos)

Prueba cutánea

Prueba reto

conjuntival

Prueba reto

nasal

Prueba reto bronquial

Reto oral Datos epidemiología

Monitoreo tiempo real sensibilización IgE

Der p 1

Der p 2

Der p 3

Der p 4

Der p 5

Der p 6

LÁCTEOS

MATERNOVACA

40% CASEÍNA60% PROTEÍNAS SÉRICAS

α LACTOALBUMIN ALactoferrina, lactosa,

transferrina, hierro, ácidos grasos cadena larga, IgA,

vitaminasNO CONTIENE

β LACTOALBUMINA

80% CASEÍNA20% PROTEINAS SÉRICAS

α LACTOLABUMINAβ LACTOALBUMINA

FORMULA ARTIFICIALFORMULA ADAPTADA

¡EL D

OCUMENTO NO C

UENTA C

ON REFERENCIA

S!

Alergeno Literatura experimental

Secuencia Pruebas Immunoblott

Prueba de función

(degranulación basófilos)

Prueba cutánea

Prueba reto conjuntival

Prueba reto

nasal

Prueba reto bronquial

Reto oral

Datos epidemiología

Monitoreo tiempo real sensibilización IgE

Bos d 1Lipocalina

Bos d 2Lipocalina

Bos d 3Proteína unión Ca

Bos d 4Α-lacto

albúmina

Bos d 5β-lacto

globulina

Bos d 6Albumina

suero

Bos d 7IgG

Bos d 8Caseina(α,β,κ)

Bos d 9α S-1

caseína

Bos d 10 α S-2 caseína

Bos d 11 β

caseína

Bos d 12 κ

caseína

Características APLV NO APLV

Reto Historia Tolerancia Negativa

Sexo (Niños /Niñas) 21 / 13 18 / 9 7 / 4 9 / 2

Edad en años (media) 3.9 ( 1.0 – 12.7) 3.0 (0.8 – 12.8) 2.5 (1.0 -15.8) 3.2 (1.4 – 14.2)

Serología (media, rango)

IgE total (kU/L) 395 (32 – 12,784 536 (34 -14,283) 267 (44 – 3,260) 958 (66.1 – 27,815)

IgE leche específica (kUA/L) 11.6 (< 0.35 - > 100) 15.9 (1.4 - > 100) 4.2 (<0.35-27.6) 3.9 (1.0-17.3)

IgE caseína específica(kUA/L) 13 (<0.35 - >100) 21.6 (0.42- >100) 2.3 (<0.35-6.6) 2.0 (1.1 -4.2)

Síntomas de alergia No.(%)

Dermatitis atópica 28 (82%) 24 (89%) 9 (82%) 10 (91%)

Asma 9 (26%) 12 (44%) 5 (45%) 1 (9%)

Alergia a huevo 25(74%) 20(74%) 4(36%) 6(54%)

Medicación No. (%)

Antagonistas H-1 6 (18%) 6 (22%) 3 (27%) 3 (27%)

Esteroide inhalado 2 (6%) 5 (18%)

55

28¿UTIL?

Ito et al . Clinical and Molecular Allergy 2012 10:1 1-7

La leche se conforma de suero y coágulo. Suero contiene α y β lactoalbúmina.

Coágulo contiene caseína.

Potencialmente todas las proteínas son alergénicas.

Mayor sensibilidad y especificidad con CASEINA

Prueba APLV(61)

GRUPO NO APLV GRUPO CONTROL NO SENSIBILIZADO A LECHE

Tolerancia (11)

Negativo(11)

Atopia(28)

Sin atopia(31)

Caseína 0.36 ( < 0.07-13.4)

0.46 (<0.07-25.4)

24.8 (0.17-197)

5.2 (0.14-64.7)

1.3 (< 0.07-125)

valor p - NS < 0.001 < 0.001 NS

α -lacto albúmina

< 0.07(< 0.07-2.7)

< 0.07 (<0.07-1.8)

7.1(0.09-52.9)

2(<0.07-44.7)

1.2(<0.07-25.1)

valor p - NS < 0.001 <0.001 <0.01

β-lactoalbúmina <0.07(<0.07-3.5)

0.09(<0.07-1.8)

5.2(<0.07-16.5)

1.5(<0.07-20.6)

0.53(<0.07-28.2)

valor p - NS < 0.001 < 0.001 < 0.001

Nivel de anticuerpos IgG4 alérgeno específicos a leche

IgG4 pudiera utilizarse como valor protector o de tolerancia

Resumen

Mejor rendimiento en diagnóstico APLV es IgEs caseína.

APLV es problema de salud pública.

Evitar el consumo de caseína no es tarea fácil.

Muchos productos no lácteos contienen caseína.

Placebo doble ciego oral es estándar de oro en Dx.

Niveles elevados de IgEs vs leche en > 5 años: peor pronóstico.

Mayor concentración IgE específica a leche a mayor edadPEOR PRONÓSTICO

Resumen Presencia de IgG4 se

considera respuesta fisiológica normal.

Niveles elevados indican mayor tolerancia.

Marcador de tolerancia. Niveles IgE/IgG4.

IgG4 refleja exposición a leche.

IgG4 muy elevada sugiere factor protector para alergia a leche ( ¿Fenotipo?)

No es un estudio para alergia a leche.

Se requieren más estudios al respecto.

¿El diagnóstico molecular puede cambiar la indicación y prescripción de los alérgenos en la ITE?

Extractos de diversos alérgenos (mezclas, purificadas o no) Específicos Reacción cruzada Concomitante

141 pacientes (RCA / AB)31 años ( ± 13.6)59% Mujeres

Prick: Olea Platanus Cupressus Cynodon Artemisa Plantago Phragmites Mezcla gramíneas

Microarray 96 alérgenos

ISAC® Phadia

PRICK TEST VS ISAC® PHADIA

No hay concordancia con la prueba cutánea

54% hay desacuerdo en la indicación ITE

Solo basado en el resultado de la prueba cutánea o serológica.

Sensibilidad cutánea

Sensibilidad molecular

¿Nuevos fenotipos de la enfermedad alérgica?

50% alergenos de plantas

Superfamilia prolaminas

ProfilinasSuperfamilia

cupinasProteínas

relacionadas Bet v-1

Cacahuate (Arachis hipogaea)

Ara h 1Ara h 3

Ara h 2Ara h 6

Ara h 7Ara h 9

Ara h 5Ara h 4Ara h 3Ara h 8

Oleosinas Defensinas

Ara h 12Ara h 13

Ara h 10Ara h 11

Curr Allergy Asthma Rep (2014) 14:429

Trímero Ara h 1 Hexámero Ara h 3

ALERGENOS MAYORES ( > 50% RECONOCIMIENTO DEL SUERO EN POBLACIÓN ALÉRGICA)

Ara h 5 Ara h 8

Ara h 2

Diferencias entre IgE vs IgG

Epitopes IgE tienen mayor reactividad cruzada

Prioridad a ciertas superficies.

Epitopes se agrupan en ciertas regiones.

Paratopos de IgE son más flexibles (sitio unión al Epítope).

Reactividad cruzada puede ser clínicamente relevante o irrelevante (ELISA, RAST, IMMULITE, IMMUNOCAP, PRUEBAS EN PIEL) FRECUENTE ENCONTRAR POLISENSIBILIZADOS

50% pacientes alérgicos al cacahuate tienen reactividad a otras leguminosas.

5% son clínicamente relevantes.

Especial importancia la Historia Clínica y las pruebas de reto.

2005 se sabía Ara h 1 tenia reactividad cruzada con Ara h 2 (empírico).

Jug r 2 ( nuez nogal) proteína tipo vicilina cruza Ara h2.

Modificaciones moleculares a los alérgenos de cacahuate.

No enzimáticas

Enzimáticas

Glicosilación

Glicoepítopes o CCDs(Determinantes de carbohidratos de reacción cruzada)

XilosaAnillo 3 similar fucosa

Reactividad cruzada entre plantas e insectos

Ara h 1

YY IgE antiglicano (CCD)YY

IgG

Síntomas!!!

Protección

Reacción Maillard

Productos finales de glicación avanzada(AGEs)

10 plegamientos!!!!

Mayor susceptibilidad a la producción de AGEs son:Ara h 1Ara h 3

Ubicuidad de la respuesta alérgica

Estimulación de receptores similares a productos finales de glicación avanzada (RAGE)

TH2

Tejidos que muestran RAGE: Piel Pulmón

Inmunoterapia inyectable con cacahuate cocido

Ara h 1Ara h 2Ara h 3Ara h 5Ara h 8

*Raro consumo del alimento crudo

IgE específica

Reacción Maillard

Enfermedad muy severa

Enfermedad poco severa

IgG 4 Caseína

Bos d 8 (caseína)

Extracto completo de Leche

Ara h 2 (cacahuate) *Mayor reacción e incremento en reactividad cruzada clínicamente relevante

Ara h1 Ara h 3 (cacahuate) *Incrementa el riesgo de ANAFILAXIA

Gal d 1 Incrementa riesgo de reacciones

Gal d 2 Gal d 3 menor riesgo al consumo huevo cocido

POTENCIA

Almacenamiento (Temperatura)

Estandarización

Estabilización Liofilizados Glicerinados

Naturaleza del alérgeno

Proteasas

Dilución

ALERGENOS PARA PRUEBAS CUTÁNEAS

FisicoquímicasAdherenciaEstabilidadAmortiguadoresSolubilidad

• 4 AÑOS 1 MES• 3 AÑOS CON RINITIS/ASMA/ECCEMA• TALLA BAJA (100 cm) PC<5

• 6 meses con ciclosporina (5 mg/Kg/d) se suspende por reducciòn dep.creatinina

• Prednisona 1mg/kg/d• Zafirlukast 20mg/dia• Difenhidramina 5 ml cada 6 hrs• Loratadadina 10 mg/día

• SCORE AD: 89

• TRAK: 20

• Bh 2300 eos/mmc

• IgE: 6956 UI/ml

20

www.allergen.org

www.allergome.org

http://www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam/

¿Quieres conocer más de moléculas que producen alergia?

Conclusiones

Enfermedad alérgica(Clínica)

Diagnóstico

Método directoHistoria clínicaExploraciónReto directoMétodo indirecto

Pruebas alergiaCutáneas intradérmicasPrick testSerológicas

Immunolite Immunocap Microarrays

Validación de la prueba

Problema complejo

Conclusiones

¿Las pruebas de alergia molecular están validadas?

Relativas a la muestra:

Relativas al sistema analítico:

Relativas a la interpretación del resultado de la prueba

• Individuales• Agrupadas• Composición de la matriz• Cuantitativa• Cualitativa

• Físicos • Químicos• Técnicos• Factores inherentes a la muestra ( sexo, raza, edad, estado nutricional,

embarazo, capacidad de respuesta inmune• Costos

• Sensibilidad• Especificidad• Valor predictivo positivo• Valor predictivo negativo

“LA ALERGOLOGÍA ES UNA CIENCIA QUE SE PRACTICA COMO SI FUERA RELIGIÓN, COMO CIENCIA PUEDES TENER TONELADAS DE EVIDENCIA, SIN EMBARGO DEBES DUDAR DE LO QUE VEZ; Y EN MUCHOS CASOS NO TIENES EVIDENCIA, AÚN ASI CREES LO QUE VEZ.”

Pensamiento modificado de Carl Sagan

¡GRACIAS!